Терапевтический потенциал ПРЛ-3 адресности и клиническая значимость СПР-3 геномной амплификации при раке желудка

Терапевтический потенциал ПРЛ-3 адресности и клиническое значение ПРЛ-3
геномной амплификации при раке желудка
Аннотация
Справочная информация
фосфатазы регенерирующей печени-3 (ПРЛ-3) заслужил внимание как важнейший молекулы в несколько этапов метастазирования. В настоящем исследовании мы рассмотрели механизмы, регулирующие экспрессию ПРЛ-3, и оценили клинический потенциал ПРЛ-3-таргетной терапии при раке желудка.
Методы
ПРЛ-3 геномного амплификации анализировали с использованием количественной полимеразной цепной реакции и /или флуоресцентная гибридизация в 77 первичных опухолей желудка. Противоопухолевой активности ингибитора ПРЛ-3 (1-4-бром-2-бензилиден роданином) лечения оценивали против раковых клеток с разной генетической и экспрессии статуса.
Результаты
ПРЛ-3 геномной амплификации был тесно согласные с высоким уровень его экспрессии белка в клеточных линиях, и было обнаружено в 20% (8/40) среди первичных опухолей человека с его экспрессии, причем все это стадия III /IV болезни (40%, 8/20), но ни в одном (0 /37) среди тех, без всякого выражения. Кроме того, ПРЛ-3 геномной амплификации был связан со статусом метастатическим лимфатических узлов, что приводит к продвинутой стадии и тем самым плохим исходом у пациентов с метастазов в лимфатических узлах (P = 0,021
). ПРЛ-3 малых интерферирующих РНК энергично подавляются метастатических свойств, включая клеточную пролиферацию, инвазию и образование колоний анкерного-независимыми. Хотя ни ПРЛ-3 геномную амплификацию, ни уровень экспрессии отвечает за чувствительность к ПРЛ-3 обработки ингибитора, ингибитор показал дозозависимое противораковой эффективности, и удивительно индуцированный апоптоз на всех тестируемых клеточных линий с выражением ПРЛ-3.
Выводы
Мы имеем впервые, показали, что ПРЛ-3 геномного усиление является одним из преобладающих механизмов индукции его экспрессии, особенно в более продвинутой стадии, и что ПРЛ-3-мишенью терапии может иметь большой потенциал против рака желудка с его выражением.
Ключевые слова
ПРЛ-3 рака желудка геномная усиление таргетной терапии лимфоузел фона
рак желудка (GC) является четвертым наиболее распространенным видом рака и второй ведущей причиной рака, связанных смерти во всем мире [1 ]. Последние достижения в области диагностических средств и методов способствовали выявлению ранней GC и тем самым отличным выживания в долгосрочной перспективе. Однако у пациентов с прогрессирующим заболеванием на момент постановки диагноза остаются плохие результаты. Метастазы представляет собой многоступенчатый процесс, включающий местное вторжение, распространение и воссоздание в отдаленные органы, и является основным фактором, определяющим смертности [2]. Таким образом, лучшее понимание метастазирования может открыть путь к целому ряду инновационных терапевтических стратегий в GC.
Белка тирозин фосфатазы (PTPs) образуют большое семейство ферментов, которые служат в качестве ключевых регуляторных компонентов сигнальных путей [3] , В фосфатазы регенерирующей печени (PRL-1, -2, и -3), принадлежащие к небольшому классу PTP надсемейство имеют уникальный СООН-концевую пренилирование мотив, который критически влияет на их клеточную локализацию и функцию [4]. ПРЛ-3 был впервые идентифицирован, чтобы быть специально сверхвыражен в метастазов в печени, полученные из колоректального рака [5], а впоследствии его избыточная экспрессия была документирована в различных типах опухолей, в том числе GC [6]. ПРЛ-3 может способствовать инвазии, миграцию, рост и ангиогенез, либо через дефосфорилирование, катализируемого каталитическим доменом или локализации в плазматической мембране с помощью направленной СООН-концевую пренилирование мотив [7-9]. Таким образом, СПР-3 заслуживает внимания в качестве важнейшей молекулы в несколько этапов метастазирования и, следовательно, в качестве новой терапевтической мишени. С другой стороны, механизмы индукции экспрессии ПРЛ-3 не полностью выяснены. Амплификация геномных областей, содержащих онкогенов является основным механизмом его последующей избыточной экспрессии и развитие рака, и, следовательно, имеет важное значение для целенаправленной терапии [10]. ПРЛ-3
амплификации гена частично объясняет гиперэкспрессией в колоректального рака и рака пищевода [5, 11]. Тем не менее, связь между геномной амплификации и GC остается недостижимым в обоих механистических и терапевтических точек зрения. В настоящем исследовании, мы исследовали характеристики ПРЛ-3
геномного усиления в GC, и дополнительно оценивали клинический потенциал ПРЛ-3-таргетной терапии.
Методы
клеточных линий и образцов тканей
GC клеточная линия MKN7 был любезно предоставлен от Cell ресурсный центр для биомедицинских исследований института развития, старения и рака, университет Тохоку (Сендай, Япония). Семь других GC клеточные линии (GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, H111, MKN74 и NUGC4) были приобретены у RIKEN биоресурсные Center (Ибараки, Япония). Эти клеточные линии охватывают два основных типа GC [12], кишечного типа (MKN7, MKN74, AZ521 и H111 клетки) и диффузного типа (GCIY, KatoIII, SH10 и клетки NUGC) [13-15]. MKN7, NUGC4 и AZ521 клетки были созданы от метастазов в лимфатических узлах (LNM), и MKN74 клетки из метастаз печени. KATOIII и GCIY клетки были установлены с метастатическим плеврит и асцит, соответственно. H111 и SH10 клетки были созданы из ксенотрансплантации. Нормальные C2C12 клетки скелетных мышц были приобретены у DS Pharma Biomedical Co., Ltd (Осака, Япония). AZ521 и C2C12 клетки выращивали в DMEM среде (Gibco, Carlsbad, CA) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Остальные клетки выращивали в среде RPMI 1640 (Gibco), дополненной 10% FBS. 1-4-бром-2-бензилиден роданин был приобретен у фирмы Calbiochem Corp (San Diego, CA), который был идентифицирован как PRL-3 ингибитора через высокопроизводительный скрининг с использованием химической библиотеки Korea Chemical Bank, и ингибирует PRL-3 активность фосфатазы [16]. В самом деле, фосфорилирование KRT8, PRL-3-взаимодействующий белок, индуцированный каталитически неактивного мутанта ПРЛ-3, но не дикого типа, была подтверждена ПРЛ-3 обработки ингибитора в зависимости от дозы [17]. Кроме того, противоопухолевая эффективность ПРЛ-3 лечения ингибитором также показали, чтобы быть таким же, лечения миРНК в развитии рака пищевода или колоректального рака [11, 17].
Из 173 фиксированных формалином, парафин образцы тканей серии, в которой ранее мы оценивали состояние экспрессии PRL-3 с помощью иммуногистохимического окрашивания (IHC) в GC [6], 77 согласованных пар первичных опухолевых тканей и соответствующие им нормальные ткани слизистой оболочки были выбраны случайным образом из пациентов с дифференциальными стадий в соответствии с 13 е издание японской классификации желудочной карциномой (JCGC) [18]; 40 пар с положительным выражением ПРЛ-3 (10 пациентов на стадии I, 10 в II, 10 в III, и 10 в IV) и 37 пар с отрицательным выражением (10 пациентов в стадии I, 10 в II, 9 в III, и 8 в IV). Всем пациентам была выполнена гастрэктомия в соответствии с желудочными руководств по лечению рака в Японии [19], а также гистологические экспертизы были проведены в соответствии с JCGC. 6 е издание Международного союза по борьбе с раком (UICC) /также была использована классификация TNM [20]. В таблице 1 представлена ​​подробная информация о 77 пациентах. Все образцы тканей были собраны в больнице Сибасабуро университета, и информированное согласие было получено от всех пациентов. Настоящее исследование было одобрено Комитетом по этике Китасато University.Table 1 корреляция между усилением гена ПРЛ-3 и клинико-патологическими переменных у 77 больных раком желудка
по <й>
<й>
ПРЛ-3 амплификации гена

<й>
Переменные

Общее количество

Негатив

Positivity

значение р


<й>
<й>
Номер

(%)

Номер

(%)

<й>
ПРЛ-3 выражение
0,006
Негатив
37
37
(100 )
0 (0) завод
Positivity
40
32
(80)
8
(20)
Возраст (лет)
0,726
&л; 60
34
30
(88) 4
(12)
≥60
43
39
(91)
4
(9)
Пол
0,710
Male
51
45
(88)
6
(12)
Женщины
26
24
(92) страница 2 (8)
лимфатической проникающая
0,343
Отсутствие
15
15
(100)
0
(0)
Присутствия
62
54
(87)
8
(13) Сосудистый
проникающая
0,263
Отсутствие
25
24
(96)

1 (4)
Присутствия
52
45
(87)
7
(13)
Дифференциация
0,134
Ну и умеренные
31
30
(97)

1 (3)
Плохо
46
39
(85)
7
(15)
Глубина вторжения
0,006 *
T1 (м и см)
15
15
(100)
0
(0)
T2 (тр и сс)
35
33
(94) страница 2 (6)
T3 (SE)
19
16
(84) страница 3 (16)
T4 (SI)
8 страница 5 (63) <бр> 3
(38)
лимфоузлов метастаз
0,022
Отсутствие
29
29
(100)
0
(0)
Присутствия
48
40
(83)
8
(17)
состояния лимфатических узлов JCGC †
0,004 *
N0
29
29
(100)
0
(0)
N1
21
20
(95)

1 (5)
N2
20
14
(70)
6
(30)
N3 и отдаленные лимфатические узлы
7
6
(86)
1
(14)
UICC лимфатических узлов статус ‡
0,002 *
n0
29
29
(100)
0
(0)
N1 <бр> 18
17
(94)

1 (6)
N2
16
13
(81) страница 3 (19)
N3 и отдаленные лимфатические узлы
14
10
(71) 4
(29)
JCGC этап
0.005 *
I (IA и IB )
20
20
(100)
0
(0)
II
20
20
(100)
0
(0)
III (IIIA и IIIB)
19
15
(79) 4
(21)
IV
18
14 <бр> (78) 4
(22)
UICC стадия
0,003 *
I (IA и IB)
21
21
(100)
0
(0)
II
20
20
(100)
0
(0)
III (IIIA и IIIB)
16 <бр> 13
(81) страница 3 (19)
IV
20
15
(75) страница 5 (25)
флуоресценция на месте анализа гибридизации
флуоресцентная гибридизация в (FISH) анализ проводили, как описано ранее [11]. ПРЛ-3
находится на хромосоме 8q24.3 (инвентарный номер GenBank NT 000008,9) и хромосома 8 центромерная зонд был использован для оценки числа копий. Поскольку алгоритмы скоринга ПРЛ-3
FISH не были стандартизированы, оценка была основана на критериях HER2
[21]. Для каждого образца оценивали по меньшей мере, 60 раковых клеток. Положительный ПРЛ-3
геномную амплификацию определяется как отношение ПРЛ-3
на хромосоме 8 центромеры более чем 2,2, и отрицательным было отношение меньше, чем 1,8. Если отношение ПРЛ-3
на хромосоме 8 центромеры было от 1,8 до 2,2, дополнительные клетки подсчитывали, а отношение более чем 2,0 был, наконец, считается положительным [21]. Полисомию определяли как средние хромосоме 8 сигналов центромерных более 3,0 на ядро ​​[22].
Количественное-геномный ПЦР
тканевых секций от опухоли и соответствующей нормальной слизистой оболочки, полученных по меньшей мере, на 5 см от края опухоли, были резко расчлененный на гематоксилином и эозином окрашенных слайдах, и геномную ДНК затем экстрагируют с помощью комплекта QIAamp ДНК FFPE (Qiagen, Hilden наук). Количественное-геномный полимеразной цепной реакции (Q-ПЦР) проводили для количественного определения PRL-3
числа копий гена с использованием IQ ™ Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) в трех экземплярах на прибора Icycler Iq ™ в режиме реального времени обнаружения ПЦР система (Bio-Rad). Для нормализации СПР-3 гена
количество копий на одну ячейку, ADAM metallopeptidase домен 2 (ADAM2
, NT 923907,1), расположенный на хромосоме 8p11.2, был использован в качестве эндогенного ссылки, потому что амплификации гена определяется как копия увеличение числа ограниченной области хромосомы плеча [10]. Значения Δ CТ рассчитывали как Ct (ПРЛ-3
) -ct (ADAM2
) для каждого образца. Относительное число копий была определена как 2 - ΔΔ Ct, где ΔΔC <югу> т = δ C <суб> т (опухоль) -ΔC <суб> т (что соответствует норме) [23]. Увеличение более чем в 2 раза по отношению к соответствующему нормальному рассматривались в качестве геномной амплификации. Дополнительный файл 1 изображает подробный состояние ПЦР и последовательности праймеров и зондов, используемых в данном исследовании.
Вестерн-блоттинга
Цельные клеточные лизаты были извлечены в буфере RIPA (Pierce, Rockford, IL), с добавлением 10 мкл /мл Прекратить ™ Коктейль Kit Ингибитор протеаз (Pierce) и Halt ™ Cocktail Kit фосфатазы Ингибитор (Pierce), и белок были разделены на NuPAGE ® 4-12% Bis-Tris гель (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. И обнаружение и количественное определение специфических белков были выполнены с использованием ATTO Light Capture (ATTO Corporation, Токио, Япония). Два колоректальных раковых клеток линии DLD-1 и клетках SW480 (RIKEN Биоресурсный) были использованы в качестве нижнего и верхнего контролирует экспрессию, соответственно, как было описано ранее [11]
ПРЛ-3 мышиные моноклональные антитела (R &Amp;. D Systems, Миннеаполис , Миннесота) и β-актина мышиных моноклональных антител (Sigma, St. Louis, МО) использовали, как описано ранее [11].
ПРЛ-3 малых интерферирующих РНК трансфекции
Клетки трансфицировали 1 мкмоль /л Accell SMARTpool, миРНК-ПРЛ-3 (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO), смешанный с Accell миРНК доставки мультимедийного контента (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с Thermo Scientific Dharmacon ® протокола Accell ™ миРНК доставки [24]. в одиночку Accell ненацеливании бассейн (миРНК-СУУ) и Accell миРНК доставки мультимедийного контента были использованы в качестве контроля эффектов не-последовательности конкретных и в макете лечения, соответственно.
Анкоридж-независимого анализа образования колоний
Анкоридж-независимый рост клеток анализировали путем высева 0,36% Top агарозы (Бакто ™ Агар, Becton, Dickinson и Компания, Franklin Lakes, NJ), содержащий 1 × 10 5 клеток на поверхности 0,72% нижнего агарозы в 6-луночных пластины [11]. Клетки подпитывали еженедельно вышележащими свежий раствор мягкого-агар, и колонии были сфотографированы через 2 недели инкубации. Значение эффективная концентрация 50% (ЭК <суб> 50) ПРЛ-3 обработки ингибитора рассчитывали на основании измерения подсчета колоний.
Анализ пролиферации и инвазии анализа
анализа пролиферации проводили с использованием Премикс WST-1 пролиферации клеток Анализ системы (Takara Bio, Токио). Клетки (2 × 10 3), высевали в 96-луночные, и пролиферативная активность измеряли по оптической плотности при длине волны 450 нм на определенные дни отбора проб. Чувствительность к ингибитора ПРЛ-3 на антипролиферационного определяли с использованием ингибирующей концентрации 50% (IC <суб> 50) значение после обработки в течение 72 ч.
Пробирного инвазии проводили в 24-луночных BD Biocoat ™ Матригель ™ Invasion камера (BD Biosciences Discovery лабораторное оборудование, Bedford, MA). Клетки, которые вторгались через мембрану подсчитывали в четырех разделенных полей на лунку. Оба эксперимента были проведены в трех экземплярах.
Апоптоз АНАЛИЗЫ
Апоптоз анализы были выполнены с использованием системы Guava PCA (гуавы Technologies, Inc., Hayward, CA). Клетки (2 × 10 5) обрабатывали ингибитором СПР-3 в указанной концентрации в питательной среде с 1,0 дополнительному% FBS в течение 72 часов, а затем окрашивали аннексина V и 7-АСР (гуавы нексин реагентах). Эксперимент был проведен в трех экземплярах и проанализированы с помощью CytoSoft 2.1.5 программного обеспечения (гуавы Technologies).
Статистический анализ
точного критерия Фишера, или Манна-Уитни U
-test была использована для статистического анализа взаимосвязи между ПРЛ-3 гена
амплификации и клинико-патологические переменные. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с тестом ретроспективном использовали для сравнения между тремя группами для лечения миРНК (миРНК-ПРЛ-3, миРНК-СУУ и насмешка). Стьюдента
тест был использован для оценки терапевтического эффекта для индивидуальных концентраций ингибитора ПРЛ-3, по сравнению с 0 мкмоль /л ингибитора ПРЛ-3. Метод Каплана-Мейера использовали для оценки совокупных показателей выживаемости, а также различия в показателях выживаемости были оценены с использованием теста лог-ранга. Все случаи смерти больных были связаны с раком, и болезнь специфическая выживаемость (DSS) было измерено с даты операции до даты смерти или последнего наблюдения. P
&л; 0,05 рассматривалось как для обозначения статистической значимости. Все статистические анализы были проведены с СПМ 7.0 программного обеспечения (SAS Institute, Cary, NC).
Результаты
ПРЛ-3 экспрессии и геномной амплификации в желудочном линиях раковых клеток
Первоначально статус выражение ПРЛ-3 оценивали с использованием вестерн-блоттинга в строках 8 GC клеток (Фигура 1А). Выражение ПРЛ-3 наблюдалась на выявляемым уровне во всех клеточных линий, среди которых 5 клеточных линий (KatoIII, H111, MKN7, MKN74, и клетки NUGC4) и 3 клеточные линии (GCIY, AZ521 и SH10 клетки) показали высокие и относительно низкая экспрессия, соответственно. Впоследствии анализ FISH было проведено с целью изучения было ли вызвано выражение ПРЛ-3 через его геномной амплификации (рис 1B). Геномная усиления был явно положительным в 2-х клеточных линиях (MKN7 и MKN74 клеток) и отрицательные в 6 клеточных линий. 3 из шести были dysomic (клетки AZ521, GCIY и NUGC4), и трое были polysomic (KatoIII, SH10 и H111 клетки). ПРЛ-3
геномной амплификации часто происходили в разных регионах от хромосомы 8, так называемые распределенные вставки, на метафазе [10], и была созвучна с его высоким уровнем экспрессии. Рисунок 1. Экспрессия и генетического статуса СПР-3 в клеточных линиях 8GC. (А) Уровень экспрессии PRL-3 с помощью вестерн-блоттинга. (Б) анализ FISH на метафазе ПРЛ-3 гена
(зеленый). Хромосома 8 центромерная зонд (оранжевый) был использован для оценки числа копий.
Характеристика ПРЛ-3
геномной амплификации в первичных злокачественных опухолей желудка человека
В нашем предыдущем исследовании, экспрессия ПРЛ-3 был обнаружен в 95 (55%) из 173 первичных ШС с помощью IHC [6]. Чтобы изучить связь между ПРЛ-3 экспрессии и его геномной амплификации, Q-ПЦР проводили для обоих 40 опухолей с положительным выражением ПРЛ-3 и 37 опухолей с отрицательным выражением, которое были выбраны случайным образом из дифференциальных стадий в первичных опухолей 173. Все первичные опухоли без экспрессии ПРЛ-3 не были усилены, в то время как 8 (20%) из 40 первичных опухолей с выражением ПРЛ-3 амплифицировали (фиг.2А). FISH анализ также подтвердил очевидное геномную амплификацию как рак конкретных изменений (Фигура 2В), и выставлены в почти однородную картину как в центральной зоне и инвазивной области в пределах опухоли. Впоследствии, связь с клинико-патологическими факторами оценивали для ПРЛ-3
геномной амплификации (таблица 1), где он был в значительной степени связано не только с его выражением (P
= 0,006), но и с глубиной инвазии опухоли ( P
= 0,006), наличие LNM (P = 0,022
), LNM статус (P = 0,004
в JCGC, P = 0,002
в UICC) и стадия (P =
0,005 в JCGC, P = 0,003
в UICC). Кроме того, все первичные опухоли с геномной амплификации стадии III или IV болезни (40%, 8/20). Кроме того, геномная усиление отрицательно сказались результаты пациентов лимфоузлов гистологически (P
= 0,021, рис 2С), хотя экспрессия ПРЛ-3 не в нашей и других предыдущих докладах [6, 25]. Рисунок 2 Частота и прогноз ПРЛ-3 геномной амплификации в 77 человека GC. (A) Частота СПР-3
геномной амплификации с использованием Q-PCR в 77 человека GC. Q-ПЦР проводили для обоих 40 опухолей с положительным выражением ПРЛ-3 и 37 опухолей с отрицательным выражением. Для нормализации ПРЛ-3 гена
числа копий на клетку, ADAM2
, расположенный на хромосоме 8p11.2, был использован в качестве эндогенного ссылки. Значения Δ CТ рассчитывали как Ct (ПРЛ-3
) -ct (ADAM2
) для каждого образца. Относительное количество копий определяли как 2-ΔΔCt, где ΔΔCt = Δ CТ (опухоль) -ΔCt (соответствует норме). (Б) Представитель FISH анализ ПРЛ-3 гена
в первичной опухоли и соответствующей норме (случай 82). (C) Каплан Мейера 5-летнего DSS согласно позитивности или негативности ПРЛ-3
геномной амплификации у больных лимфоузлов гистологически. Усы, стандартное отклонение (SD).
ПРЛ-3 в качестве конвергентной терапевтической мишени
В GC, функциональные роли СПР-3, включая вторжение и распространения способностей, были зарегистрированы только в SGC7901 клетках [25] , Для подтверждения этих метастатических свойства, используя 3 клеточных линий с различными ПРЛ-3 и экспрессии генетического статуса, нокдауна экспрессии эндогенного ПРЛ-3 была выполнена с использованием миРНК трансфекции; Клетки AZ521 (низкая экспрессия и дисомия), клетки H111 (высокий уровень экспрессии и полисомию), клетки MKN74 (высокий уровень экспрессии и геномная амплификации). Эти клеточные линии были трансфицированы миРНК-ПРЛ-3 или миРНК-СУУ и Вестерн-блоттинга показал сниженный уровень ПРЛ-3 белка в миРНК PRL-С-3 клеток, но не миРНК-ССУ клетки, по сравнению с клетками, экспериментальная модель лечения ( Рисунок 3А). Одним из важных характеристик метастатического фенотипа, как предполагается, как способность раковых клеток расти под анкерными-независимых условиях [26], но участие в ПРЛ-3 остается неизвестной в GC. Все клетки миРНК-ПРЛ-3 показали значительно уменьшились размеры и количество колоний, по сравнению с миРНК-СУУ клетки или клетки экспериментальная модель обработки (фигура 3В). Кроме того, в соответствии с предыдущими сообщениями для других линий GC клеток [25, 27], мы также подтвердили, что клетки миРНК-ПРЛ-3 показали значительно меньше пролиферативную активность (рис 3C) и инвазивные способности (рис 3D). Рисунок 3. Ингибирование метастатических свойств после трансфекции миРНК в клетках с выражением. (А) вестерн-блоттинга через 72 часа после трансфекции. Вестерн-блоттинга также количественно. экспериментальная модель, лечение только Accell миРНК доставки мультимедийного контента; СУУ, лечение с помощью миРНК-СУУ; си, лечение с помощью миРНК-ПРЛ-3. (B) Анкерные независимые анализы образования колоний. Типичные картины образования колоний на AZ521 клеток показано на верхней панели. С макетом лечение как 1,0, относительная скорость числа колоний была показана в нижней панели. Бары, 200 мкм. (С) Анализ пролиферации. Пролиферативную активность AZ521 клеток на 1, 2, 3, 4, или 5 дней после трансфекции (верхняя панель) и относительной пролиферативной скорости на 5 дней после трансфекции (нижняя панель) были показаны. (D) Invasion анализ. Клетки высевали на 4 дня после трансфекции, а затем инкубировали в течение 22 часов. Представительные были показаны фотографии AZ521 клеток (верхняя панель) и относительной скорости инвазивной (нижняя панель). Бары, 200 мкм; *, P &
л; 0,05 по ANOVA с тестом ретроспективном; Отрезки ошибок,
SD. Терапевтический потенциал PRL-3 ингибитор, 1-4-бром-2-бензилиден роданин
Для оценки терапевтического потенциала и исследовать ориентир направления ответа на ПРЛ-3-целевой терапии, мы оценивали противоопухолевую активность ПРЛ-3 ингибитора, клеточно-проницаемой бензилиден роданин соединение [16], против 6 клеточных линий с различными ПРЛ-3 и экспрессии генетического статуса; GCIY и AZ521 клетки (низкая экспрессия и дисомия), клетки KatoIII (высокий уровень экспрессии и полисомию), клетки SH10 (низкая экспрессия и полисомию), MKN7 и MKN74 клетки (высокая экспрессия и геномная усиления). Клетки обрабатывали ингибитором ПРЛ-3 при концентрациях в диапазоне от 0 до 50 мкмоль /л. ПРЛ-3 ингибитор показал дозы и времени зависит эффективность антипролиферативное на всех протестированных клеточных линий, независимо от различных ПРЛ-3 и уровнем экспрессии генетического статуса, и IC <суб> 50 значений GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, MKN7 и MKN74 клетки были 26,77, 9,98, 24,26, 23,95, 22,29 и 9,45 мкмоль /л, соответственно (рис 4A). AZ521 и MKN74 клетки были более чувствительны к ПРЛ-3 лечения ингибитором, чем GCIY и MKN7 клеток, которые были отнесены к категории идентичных групп с точки зрения выражения и генетического статуса, соответственно. А именно, генетическое или выражение статус не был связан с чувствительностью GC клеток против ингибитора ПРЛ-3. Аналогичная эффективность была показана на образование колоний анкерного-независимой, а ЕК <Суб> 50 значения GCIY, AZ521, SH10, и клетки MKN74 были 6,99, 9,52, 13,05, 9,09 мкмоль /л, соответственно (4В). GCIY клетки выставлены более чувствительную ингибирование в отличие от анти-пролиферации. Кроме того, этот ингибитор также робастно аннулировал инвазивной способность GC клеток (рис 4в). Для дальнейшей характеристики противораковой эффективности ПРЛ-3 обработки ингибитора, апоптозом анализ проводили (рисунок 5А). Несмотря на то, 1 мкмоль /л ингибитора было недостаточным, чтобы вызвать апоптоз за пределы базовой линии (0 мкмоль /л), 10 мкмоль /л ингибитора робастно вызвало резкое апоптоз всех протестированных клеточных линий, где были 3-кратному и увеличивается в 11 раз за пределами базовой линии в GCIY и MKN74 клеток, соответственно. Таким образом, ингибитор пролактина-3 репрессирован эти метастатических свойств во всех тестируемых клеточных линий в зависимости от дозы, и ни один из уровней экспрессии, ни генетического статуса показали четкую корреляцию с чувствительностью. Рисунок 4 противоопухолевую активность ингибитора ПРЛ-3. (А) Анализ пролиферации после лечения с помощью ингибитора ПРЛ-3 при концентрациях в диапазоне от 0 до 50 мкмоль /л против 6 клеточных линий с различной ПРЛ-3 экспрессии и генетического статуса. С клетками, обработанными только химическим раствором (0 мкмоль /л ингибитора ПРЛ-3), как 1,0, относительная скорость пролиферативный на 5 дней после того, как лечение было показано в левой части панели. Пролиферативную активность AZ521 клеток на 1, 2, 3, или 4-х дней после того, как лечение было показано на правой панели. L, низкая экспрессия; H, высокая экспрессия; D, дисомия; P, полисомию; A, усиление; IC 50, ингибирующую концентрацию 50%. (B) Анкерные независимые анализы образования колоний. Представительные были показаны картины образования колоний на AZ521 клеток (верхняя панель) и относительную скорость числа колоний (нижняя панель). Бары, 200 мкм; ЕС50, эффективная концентрация 50%. (С) нашествие анализ. Представительные фотографии (верхняя панель) и относительную инвазивная скорость (нижняя панель) были показаны. Бары, 200 мкм; *, P &
л; 0,05 студенческим тестом т
, по сравнению с 0 мкмоль /л ингибитора ПРЛ-3; Столбики ошибок, SD.
Рисунок 5 ПРЛ-3 ингибитор-опосредованного апоптоза. (А) Апоптоз анализ проводили через 72 часа после обработки ингибитором ПРЛ-3 (от 0 до 10 мкмоль /л). Типичные показатели апоптозу анализа на AZ521 и С2С12 клетки были показаны в левой панели, а процент и SD раннего апоптоза (нижний правый квадрант) и позднего апоптоза (верхний правый квадрант) показаны в каждой панели. С клетками, обработанными только химическим раствором (0 мкмоль /л ингибитора ПРЛ-3), как 1,0, относительная скорость позднего апоптозу после обработки была показана на правой панели. *, P &
л; 0,05 студенческим тестом т
, по сравнению с 0 мкмоль /л ингибитора ПРЛ-3. (Б) ПРЛ-3 лечение ингибитором против нормальных скелетных мышцах С2С12 клеток. C2C12 клетки выставлены более низкий уровень экспрессии СПР-3, чем GC клеток с помощью Вестерн-блоттинга. проводили Анализ пролиферации после лечения с ингибитором ПРЛ-3. Усы, SD.
Наконец, мы оценивали индуцированное ли ингибитор ПРЛ-3 цитотоксичности в нормальных скелетных мышцах, где СПР-3 преимущественно экспрессируется [28]. Оба пролиферации и апоптозе анализы проводили с использованием обычных С2С12 клетки скелетных мышц, обработанных ингибитором, и показал, что 10 мкмоль /л ингибитора не удалось вызвать антипролиферативным и апоптотический ответ на С2С12 в отличие от эффективностей на всех протестированных ГХ клеточных линий ( на рисунке 5а и 5б).
Обсуждение
Как LNM рассматривается как важный прогностический фактор для GC [29], исследование молекул причинных отражающих LNM является перспективным направлением для улучшения результатов. Тесная связь LNM с выражением ПРЛ-3, следовательно, имеет потенциал в качестве новой терапевтической мишени [6, 25]. Тем не менее, критерии ПРЛ-3-направленной терапии не были установлены, и это имеет решающее значение для уточнения характеристик ПРЛ-3
геномной амплификации в обоих механистической и терапевтических точек зрения, из-за основного механизма его последовательное выражение и развитие рака [10]. В настоящем исследовании мы предлагаем жизненно важные ключи для развития этой терапевтической стратегии борьбы с GC.
Отношения между ПРЛ-3 экспрессии и его геномной амплификации никогда не были изучены до сих пор. ПРЛ-3
геномной амплификации была созвучна с его статусом экспрессии в клеточных линиях, и был найден в 20% (8/40) среди первичных опухолей человека с выражением, которые были все стадии III или IV болезни (40%, 8 /20), но ни в одном (0/37) среди тех, кто без всякого выражения. Кроме того, ПРЛ-3
геномная усиление было связано со статусом LNM, что приводит к продвинутой стадии и тем самым плохим исходом у пациентов с LNM (P = 0,021
). Таким образом, СПР-3
геномной амплификации может быть более актуальным для изменения LNM, и является одним из доминирующих механизмов, побуждающих свое выражение в более продвинутой стадии. Тем не менее, в большинстве случаев опухоли, экспрессирующие PRL-3 не были усилены, особенно в earler стадии. В мышиных эмбриональных фибробластов с дикого типа, но не p53 - /-, ПРЛ-3 индуцируется в р53-зависимым способом [30]. Мутация p53 или потеря функции, однако, было зарегистрировано во всех клеточных линиях GC, используемых в настоящем исследовании, за исключением NUGC4 клеток (TP53 веб-сайта, HTTP:.. //P53 свободный фр /) , указывая, что существует другой механизм, независимо от р53 пути. Выражение ПРЛ-3, как сообщалось, регулируется на транскрипционном уровне путем митогенных цитокинов, таких как IL-6, IL-21, что HGF или ИФР-1 в линии клеток миеломы [24], или, как TGF-бета в линиях клеток рака толстой кишки [ ,,,0],31]. Недавно полиЦ-РНК-связывающий белок 1 (PCBP1) был идентифицирован как поступательной регулятора ПРЛ-3 [32]. Альтернативные механизмы на транскрипционной или трансляционной уровне могут быть вовлечены, чтобы регулировать экспрессию ПРЛ-3.
Мы также подтвердили, что миРНК-опосредованной ПРЛ-3 нокдауна значительно репрессирован клеточную пролиферацию и инвазию в соответствии с предыдущими сообщениями для других линий GC клеток [25 , 27], и, кроме того, впервые показали уменьшенный эффект образования колоний под анкерными-независимых условиях, поддерживая, что ПРЛ-3 может быть привлекательной терапевтической мишенью против GC.

• МикроРНК-645, повышающей регуляции в человеческом adencarcinoma желудочного пищеводного перехода, ингибирует апопто…
• Прогностическое воздействие обнаружения жизнеспособных циркулирующих опухолевых клеток в больных раком же…