Terapijski potencijal PRL-3 usmjerenosti i kliničkog značaja PRL-3 genomske pojačanja u želučanom cancer

terapijski potencijal PRL-3 usmjerenosti i kliničkog značaja PRL-3
genomske pojačanja u rak želuca pregled apstraktne pregled pozadine
fosfataza od regeneraciju jetre-3 (PRL-3) je zaslužuje pažnju kao ključni molekule u više koraka od metastaze. U ovom istraživanju ispitali smo mehanizme koji reguliraju PRL-3 ekspresije, a procjenjuje se klinički potencijal PRL-3-ciljane terapije u raka želuca.
Metode pregled PRL-3 genomska pojačanje je analiziran pomoću kvantitativne-polimeraze lanca reakcija i /ili fluorescentna hibridizacija in situ u 77 primarnih želučanih tumora. Antikancerogena aktivnost PRL-3 inhibitora (1-4-bromo-2-benziliden rodamina) liječenje ocijenjena protiv stanica karcinoma s različitim genetskim i ekspresije statusu. Pregled Rezultati
PRL-3 genomske pojačanja bila pažljivo sukladna visokim stupanj njegove ekspresija proteina u staničnim linijama, a pronađen je u 20% (8/40) među ljudskim primarnim tumorima sa svojim izrazom, koji su svi bili fazi III /IV bolest (40%, 8/20), no niti u jednom (0 /37) među onima bez izraza. Osim toga, PRL-3 genomska pojačanje bio je povezan s metastatskim status limfnih čvorova, što je dovelo do poodmakloj fazi i time lošim rezultatima u bolesnika s limfnih čvorova metastaza (P
= 0,021). PRL-3 mala ometanja RNK snažno potisnute metastatskih svojstva, uključujući proliferaciju stanica, invazije i formiranja kolonija sidrište neovisan. Iako niti PRL-3 genomska pojačanje, niti izraz razina bio odgovoran za osjetljivost na PRL-3 tretmana inhibitora, inhibitor pokazao ovisi o dozi antitumorski učinkovitost i iznimno inducirana apoptoza na svim ispitivanim staničnim linijama s PRL-3 izražavanja. Pregled Zaključci pregled smo za prvi put, pokazala da PRL-3 genomska pojačanje je jedan od dominantnih mehanizama inducira svoj izraz, osobito u višem stupnju, te da je terapija PRL-3 ciljane može imati veliki potencijal protiv raka želuca s izrazom lica. pregled Ključne riječi pregled, PRL-3 rak želuca genomska pojačanje ciljane terapije Pozadina limfni čvor pregled karcinoma želuca (GC) je četvrti najčešći karcinom i drugi vodeći uzrok raka povezanih smrti u svijetu [1 ]. Nedavna poboljšanja dijagnostičkih alata i metoda olakšali otkrivanje ranog GC i time odličan dugoročni opstanak. Međutim, bolesnici s uznapredovalom bolesti u trenutku postavljanja dijagnoze i dalje loše rezultate. Metastaza je postupak u više koraka, koji uključuje lokalne invazije, širenje i ponovno uspostavljanje u udaljene organe, te je glavni odrednica smrtnosti [2]. Stoga, bolje razumijevanje metastaza može otvoriti put domaćin inovativnih terapeutskih strategija u GC.
Protein tirozin fosfataze (PTP) čine veliku obitelj enzima koji služe kao ključne regulatorne elemente u putevima prijenosa signala [3] , U fosfataza regeneracije jetre (PRL-1, -2 i -3), koji pripadaju maloj skupini PTP superfamilije imaju jedinstvenu COOH-terminalnu prenilacija motiv, koji se kritički utječe na njihovu stanična lokalizacija i funkciju [4]. PRL-3 je prvo identificiran kao specifično prekomjerno izražen u metastaze jetre koji su izvedeni iz karcinoma debelog crijeva [5], i nakon toga njezina pojačana ekspresija je dokumentirano u različitim vrstama tumora, uključujući GC [6]. PRL-3 može promovirati invazije, migraciju, rast i angiogenezu, bilo kroz defosforiliranje koje katalizira katalitičke domene ili lokalizacije plazma membrane usmjerena prema COOH-terminal prenilacije motiva [7-9]. Dakle, PRL-3 je zaslužuje pažnju kao ključni molekule u više koraka od metastaza, te stoga kao novog terapijskog cilja. S druge strane, mehanizmi koji izazivaju PRL-3 ekspresije nije potpuno razjašnjeno. Pojačanje genomskih regija sadrže onkogeni je glavni mehanizam njegovog posljedičnim prekomjernom ekspresijom i razvoj raka, i zbog toga ima značaj za ciljane terapije [10]. PRL-3 pregled gena pojačanje djelomično račune za prekomjernu ekspresiju u raka debelog crijeva i raka jednjaka [5, 11]. Međutim, odnos između genomske pojačavanje i GC i dalje izmiče u oba mehaničko i terapeutskih gledišta. U ovom istraživanju ispitali smo karakteristike PRL-3 pregled genomske pojačanjem u GC i dalje procijenjeni klinički potencijal PRL-3-ciljane terapije.
Metode
stanične linije i uzorci tkiva pregled GC stanična linija MKN7 ljubazno je dobivena iz stanica informacijski centar za biomedicinska istraživanja Instituta za razvoj, starenje i rak Sveučilišta Tohoku (Sendai, Japan). Sedam drugih GC stanične linije (GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, H111, MKN74 i NUGC4) kupljeni su od Riken BioResource Center (Ibaraki, Japan). Ove stanične linije pokrivaju dvije glavne vrste GC [12], crijevna tip (MKN7, MKN74, AZ521 i H111 stanice) i difuzni tip (GCIY, KatoIII, SH10 i NUGC stanice) [13-15]. MKN7, NUGC4 i AZ521 stanice su osnovana od limfnog čvora metastaza (LNM) i MKN74 stanice su od metastaze jetre. KATOIII i GCIY stanice su osnovana s metastatskim pleuralnog izljeva i ascitesom, respektivno. H111 i SH10 stanice su osnovana od transplantacije. Normalni skeletnih mišića C2C12 stanice su nabavljeni iz DS Pharma Biomedical Co, Ltd (Osaka, Japan). AZ521 i C2C12 stanice su rasle u DMEM mediju (GIBCO, Carlsbad, CA) uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS). Druge stanice su rasle u RPMI1640 mediju (Gibco) uz dodatak 10% FBS. 1-4-bromo-2-benziliden rodamina je kupljen od calbiochem Corp (San Diego, CA), koji je identificiran kao PRL-3 inhibitora kroz velikim protokom korištenjem kemijske biblioteke Koreja Chemical Bank, a inhibirana PRL-3 aktivnost fosfataze [16]. Doista, fosforilacija KRT8, PRL-3-interacting protein, inducirana katalitički neaktivni mutant PRL-3, ali ne i za divlji tip, je potvrđena PRL-3 liječenje inhibitora na način ovisan o dozi, [17]. Štoviše, antitumorski učinkovitost PRL-3 tretmana inhibitora je također pokazalo da je slična onoj siRNA liječenja u raka jednjaka ili raka debelog crijeva [11, 17].
Od 173 formalinom fiksna, parafinske ugrađen, uzorci tkiva serije gdje smo prethodno procjenjuje ekspresije stanje PRL-3 imunohistokemijskim bojanje (IHH) u GC [6] 77 uparen para primarnih tumorskih tkiva kao i odgovarajući normalne sluznice tkiva su slučajno odabranih pacijenata s diferencijalnim stupnja prema 13 th izdanje japanske klasifikaciji karcinoma želuca (JCGC) [18]; 40 parova s ​​pozitivnim PRL-3 izrazu (10 bolesnika u stadiju I, 10 u II, 10 u III, a 10 u IV) i 37 parova s ​​negativnim izrazom (10 bolesnika u stadiju I, 10 u II, 9 u III i 8, IV). Svi pacijenti podvrgnuti gastrektomije prema želučane smjernice za liječenje raka u Japanu [19], a tireoidektomija Ispitivanja su izvedena u skladu s JCGC. 6 th izdanju Međunarodne unije protiv raka (UICC) /TNM klasifikacija je također koristi [20]. Tablica 1 prikazuje detaljne informacije o 77 bolesnika. Svi uzorci tkiva prikupljeni su u Klinici Kitasato i informirani pristanak dobiven je od svih pacijenata. Ova studija je odobren od strane Etičkog komiteta Kitasato University.Table 1. Korelacija između PRL-3 gena pojačavanje i kliničkopatološkim varijabli u 77 bolesnika s karcinomom želuca pregled pregled pregled, PRL-3 amplifikacije gena
pregled varijable

Ukupan broj
Negativnost
pozitivnosti
p pregled vrijednost
pregled pregled, Broj
(%) pregled pregled, Broj
(%)
pregled, PRL-3 ekspresije pregled 0,006 pregled Negativnost pregled 37 pregled, 37 Netlogu (100 )
0
(0) pregled pozitivnosti
40 pregled, 32 pregled (80) pregled, 8
(20)
Dob (godine)
0.726 izvoznici < 60 pregled, 34 pregled, 30 pregled (88) pregled, 4 pregled (12) pregled ≥60 pregled 43 pregled, 39 pregled (91)
4 pregled (9)
Spol
0,710 pregled muški pregled, 51 pregled, 45 Netlogu (88) pregled, 6 pregled (12) pregled Ženski
26 pregled, 24 pregled (92) pregled 2 pregled (8) pregled Limfna propusnosti pregled 0,343 pregled Odsutnost pregled 15 pregled, 15 pregled (100) pregled, 0 pregled (0) pregled prisutnosti pregled, 62 pregled, 54 Netlogu (87) pregled, 8 pregled (13) pregled vaskularnog propusnosti pregled 0,263 Netlogu odsutnost pregled 25 pregled, 24 pregled (96) pregled, 1 pregled (4) pregled prisutnosti pregled, 52 pregled, 45 Netlogu (87) pregled, 7 pregled (13) pregled Diferencijacija
0,134
dobro i umjereno pregled 31. pregled 30
(97)
1 Netlogu (3) pregled Slabo pregled 46
39 pregled (85) pregled, 7 pregled (15) pregled Dubina invazije
0.006 * pregled T1 (m i sm)
15 pregled, 15
(100) pregled, 0 pregled (0) pregled, T2 (tt i ss)
35 pregled, 33
(94)
2
(6) pregled, T3 (se)
19 pregled, 16 pregled (84) pregled 3
(16) pregled, T4 (SI) pregled, 8 pregled 5 pregled (63)
3 pregled (38) pregled limfnih čvorova metastaze pregled 0,022 pregled Odsutnost pregled 29 pregled, 29 pregled (100) pregled, 0 pregled (0) pregled prisutnost pregled, 48 pregled, 40 pregled (83) pregled, 8 pregled (17) pregled JCGC statusa limfnih čvorova † pregled 0,004 * pregled N0 pregled 29 pregled 29
(100) pregled, 0 pregled (0) pregled N1 pregled 21 pregled, 20 pregled (95) pregled, 1 pregled (5) pregled N2 pregled 20 pregled, 14 pregled (70) pregled, 6 pregled (30) pregled, N3 i udaljene limfne čvorove pregled 7
6 pregled (86) pregled, 1 pregled (14)
UICC limfnog čvora status ‡
0.002 *
N0 pregled, 29 pregled, 29
(100)
0
(0) pregled N1
18 pregled, 17 pregled (94) pregled, 1 pregled (6) pregled N2 pregled 16 pregled, 13 pregled (81) pregled 3 pregled (19) pregled, N3 i udaljene limfne čvorove
14 pregled, 10 pregled (71) pregled, 4
(29)
JCGC stage pregled 0,005 * pregled i (IA i IB )
20 pregled, 20 pregled (100) pregled, 0 pregled (0) pregled II
20 pregled, 20 pregled (100) pregled, 0
(0) pregled, III (IIIA i IIIB)
19 pregled, 15 pregled (79) pregled, 4 pregled (21) pregled, IV
18 pregled 14
(78) pregled, 4 pregled (22) pregled UICC faza pregled 0,003 * pregled i (IA i IB)
21 pregled, 21 pregled (100) pregled 0 pregled (0) pregled II
20
20 pregled (100) pregled, 0 pregled (0)
III (IIIa i IIIb)
16
13 pregled (81) pregled 3 pregled (19) pregled, IV
20 pregled, 15 pregled (75) pregled 5 pregled (25) pregled, Fluorescentna in situ hibridizacijske analize
fluorescentne in situ hibridizacije (FISH) je izvedena kako je prethodno opisano [11]. PRL-3 pregled, nalazi se na kromosomu 8q24.3 (broj GenBank pristupanja NT 000.008,9), a kromosom 8 centromerni sonda se koristi za procjenu broja kopija. Budući da nije bio standardiziran PRL-3 pregled FISH bodovni algoritmi, procjena se temelji na kriterijima HER2 pregled [21]. Za svaki uzorak, najmanje 60 stanice raka su postignuti. Pozitivan PRL-3 pregled genomske amplifikacija je definirana kao omjer PRL-3
prema kromosomu 8 centromere više od 2,2, a negativna bio je omjer manji od 1,8. Ako je omjer PRL-3
na kromosomu 8 centromere je 1,8 do 2,2, još stanice su izbrojene, te je omjer veći od 2,0 konačno smatra pozitivnim [21]. Polysomy definiran kao srednja kromosom 8 centromerni signala više od 3,0 po jezgri [22]. Pregled kvantitativna-genomic PCR pregled Uzorci tkiva iz tumora i odgovarajućeg normalne sluznice, dobivenog najmanje 5 cm od ruba tumora bili oštro secira na hematoksilinom i eozinom umrljan dijapozitiva, genomska DNA je naknadno ekstrahirana korištenjem jednog QIAamp DNA FFPE opreme (Qiagen znanosti, Hilden). Kvantitativno-genomska lančana reakcija polimeraze (Q-PCR) kvantificirati PRL-3 pregled gena brojeve kopiranja pomoću iQ ™ Mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), u tri primjerka na iCycler iQ ™ Real-Time PCR Detection sustav (Bio-Rad). Da bi se normalizirali PRL-3 pregled gena broj kopija po stanici, Adam metalopeptidaze domenu 2 (ADAM2
, NT 923.907,1), koji se nalazi na kromosomu 8p11.2, korišten je kao endogeni referencu jer je pojačanje gen definira kao kopija broj povećanje ograničenoj regiji kromosoma rukom [10]. ΔCt vrijednosti izračunate su kao Ct (PRL-3 pregled) -Ct (ADAM2 pregled) za svaki uzorak. Relativan broj kopija određen je kao 2 - ΔΔ Ct, gdje ΔΔC t = ΔC t (tumor) -ΔC t (odgovara normalno) [23]. Povećanje više od dva puta u odnosu na odgovarajući normalno se smatralo da su genomske pojačanja. Dodatne datoteke 1 prikazuje detaljan PCR stanja i sekvencije primera i sonde koja se koristi u ovom istraživanju. Pregled Western blot
cijelih stanični lizati se ekstrahira u RIPA puferom (Pierce, Rockford, IL), uz dodatak 10 ul /ml Halt ™ inhibitora proteaze koktel Kit (Pierce) i zaustaviti ™ fosfataza Inhibitor Cocktail Kit (Pierce), a protein se razdvoje na NuPAGE® ® 4-12% bis-Tris gel (Invitrogen) prema uputama proizvođača. Oba otkrivanje i kvantifikacija specifičnih proteina su provedena pomoću ato Light Capture (ato Corporation, Tokyo, Japan). Dva kolorektalnog raka stanične linije DLD-1 i SW480 stanice (Riken BioResource) korišteni su kao niske i visoke kontrole ekspresije, pojedinačno, kao što je prethodno opisano [11] pregled PRL-3 mišje monoklonsko antitijelo (R &, D Systems, Minneapolis , MN) i β-aktin monoklonsko antitijelo miša (Sigma, St. Louis, MO), korišteni su kao što je prethodno opisano [11]. pregled PRL-3 mala interferirajuća RNA transfekcija pregled Stanice su transficirane s 1 umol /L Accell SMARTpool, siRNA-PRL-3 (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) pomiješan s Accell siRNA isporuke medije (Thermo Fisher Scientific) u skladu s Thermo Scientific Dharmacon ® Accell ™ siRNA Protokola isporuke [24]. Bazen Accell Non-ciljanje (siRNA CTR) i Accell siRNA isporuke medija sami su korišteni kao kontrola za efekte ne specifičnim za pojedini slijed i kao tobožnji tretmana, respektivno.
Pričvršćivanje neovisan testu koloniziranje
sidrište neovisno rast stanica je analizirana na ploču 0,36% gornji agaroze (Bacto ™ Agar, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) koji sadrži 1 × 10 5 stanica na površini 0,72% donjeg agaroze u 6 jažica ploče [11]. Stanice su hranjeni tjednim leže svježeg mekog otopinom agara, a kolonije su fotografirani nakon 2 tjedna inkubacije. 50% učinkovita koncentracija (EZ 50) vrijednost PRL-3 tretmana inhibitora je izračunata na temelju mjerenja mikroorganizama. Pregled, proliferacije i invaziju test pregled Test proliferacije je izveden korištenjem premiksa WST-1 proliferacije stanica sustava (Takara Bio, Tokyo). Stanice (2 x 10 3) su zasijane u 96 jažica, a proliferativna aktivnost je izmjerena apsorbancijom na 450 nm određenih dana uzorkovanja. Osjetljivost na PRL-3 inhibitora na antiproliferativni određena je pomoću koncentracije od 50% inhibicijski (IC 50) vrijednosti nakon liječenja tijekom 72 sata.
Test invazije se provodi u 24 jažica BD Biocoat ™ Matrigel ™ Invazija komora (BD bioznanosti Otkriće Labware, Bedford, MA). One stanice koje su izvršile invaziju kroz membrane, su izbrojene u četiri odvojena polja po jažici. Oba eksperimenta su izvršene u triplikatu.
Pokusima apoptoze Apoptoza
ispitivanja izvedena su pomoću Guava PCA System (Guava Technologies, Inc, Hayward, CA). Stanice (2 x 10 5) pomiješa se s inhibitorom PRL-3 u naznačenoj koncentraciji u mediju dodacima s 1,0% FBS tijekom 72 sata, zatim su obojene s Annexin V i 7-AAD (Gujava neksin reagens). Pokus je učinjeno u tri primjerka i analizirani pomoću Cytosoft 2.1.5 softver (Guava Technologies). Pregled, Statistička analiza
Fisherov egzaktni test, ili Mann-Whitney U-test
korišten je statistički analizira odnos između PRL-3 pregled gena pojačanje i kliničkopatološkim varijable. Jednosmjerna analiza varijance (ANOVA) s post-hoc test je korišten za usporedbu između tri skupine za siRNA liječenja (siRNA-PRL-3, siRNA-CTR i lažna). Studentov t pregled test korišten je za procjenu terapeutskog učinka za pojedine koncentracije PRL-3 inhibitora, u usporedbi sa 0 umol /L PRL-3 inhibitora. Kaplan-Meier postupak se koristi za procjenu kumulativnih stope preživljavanja, a razlike u postotku preživljavanja su ocijenjeni s uporabom log-rank testa. Sve smrti bolesnika su povezana s karcinomom, a bolest specifična za preživljavanje (DSS) mjerena od datuma operacije do datuma smrti ili posljednjeg nastavka. P izvoznici < 0,05 ukazuju na statističku značajnost. Sve statističke analize provedene su uz JMP 7.0 softvera (SAS Institute, Cary, NC). Pregled Rezultati
PRL-3 izražavanja i genomske pojačanje u želučanom staničnim linijama karcinoma pregled početku, PRL-3 Status izraz je procijenjena korištenjem western blot u staničnim linijama 8 GC (Slika 1A). PRL-3 ekspresije je promatrana na odredive razine u sve stanične linije, od kojih 5 stanica (KatoIII, H111, MKN7, MKN74 i NUGC4 stanice) i 3-stanica (GCIY, AZ521 i SH10 stanice) izlaže visoko i relativno niska ekspresija, respektivno. Nakon toga, FISH analiza provedena je ispitati da li PRL-3 ekspresije nastala kroz svoje genomske pojačanje (Slika 1B). Genomska pojačanje je očito bio pozitivan na 2 staničnih linija (MKN7 i MKN74 stanice), a negativan u 6 staničnim linijama. 3. šest su dysomic (AZ521, GCIY i NUGC4 stanica), a tri su polysomic (KatoIII, SH10 i H111 stanica). PRL-3 pregled genomske pojačanja često se dogodila u različitim regijama iz kromosoma 8, tzv raspoređenih umetanja, na metafazi [10], a bilo je podudarno s visokim izražavanja. Slika 1 Ekspresija i genetski status PRL-3 u 8GC staničnim linijama. (A) razina ekspresije PRL-3 pomoću 'Western blot-a. (B) Analiza ribu na metafazi PRL-3 pregled gena (zeleno). Kromosomu 8 centromerni sonda (narančasta) korišten je za procjenu broja kopija.
Karakteristiku PRL-3 pregled genomske pojačanja u ljudskim primarnim želučanog karcinoma
U našem prethodnom istraživanju, PRL-3 ekspresije je otkriven u 95 (55%) od 173 osnovnih GCS od IHC [6]. Istražiti vezu između PRL-3 ekspresije i njegove genomske pojačanje, Q-PCR i za 40 tumora s pozitivnim PRL-3 ekspresije i 37 tumora s negativnim izraza, koji su nasumce izabrani iz diferencijalne faze u 173 primarnih tumora. Svi primarni tumori bez PRL-3 ekspresije nisu pojačani dok 8 (20%) od 40 primarnih tumora PRL-3 ekspresije su pojačani (slika 2A). FISH analiza potvrdila očiti genomske pojačanje kao karcinom specifične promjene (slika 2B) i izlaže na gotovo homogenom uzorku kako u središnjem dijelu, invazivnim području unutar tumora. Nakon toga, odnos s kliničkopatološkim faktora je određena za PRL-3
genomske pojačanjem (Tablica 1), gdje je značajno povezana ne samo sa svojim izrazom (P
= 0.006), ali i sa dubinom invazije tumora ( P pregled = 0.006), prisutnost LNM (P pregled = 0,022), LNM status (P = 0,004 pregled u JCGC, P = 0,002 pregled u UICC), a faza (P pregled = 0.005 u JCGC, P Netlogu = 0,003 u UICC). Osim toga, svi su primarni tumori s genomske pojačanja su stadij III ili IV bolest (40%, 8/20). Štoviše, genomska pojačanje negativno utjecati na rezultate čvora pozitivnih pacijenata histološki (P
= 0,021, Slika 2c), iako je PRL-3 ekspresije se nije u našoj i drugim prethodnim izvješćima [6, 25]. Slika 2 Učestalost i prognoza PRL-3 genomske pojačanja u 77 ljudskoj GC. (A) Učestalost PRL-3 pregled genomske pojačavanja korištenjem Q-PCR u 77 ljudskoj GC. Q-PCR i za 40 tumora s pozitivnim PRL-3 ekspresije i 37 tumora s negativnim izražavanja. Da bi se normalizirali PRL-3 pregled gena broj kopija po stanici, ADAM2 pregled, koji se nalazi na kromosomu 8p11.2, korišten je kao endogeni referencu. ΔCt vrijednosti izračunate su kao Ct (PRL-3 pregled) -Ct (ADAM2 pregled) za svaki uzorak. Relativan broj kopija određen je kao 2-ΔΔCt, gdje ΔΔCt = ΔCt (tumora) -ΔCt (odgovara normalno). (B) predstavnik FISH analiza PRL-3
gena u primarnom tumoru i odgovarajućim normalnim (slučaj 82). (c) Kaplan Meier krivulje od 5 godina DSS prema pozitivnosti ili negativnosti PRL-3 pregled genomske pojačanje u čvoru-pozitivnim pacijentima histološki. pregled, PRL-3 kao konvergentne terapeutski cilj Netlogu U GC, funkcionalne uloge PRL-3, uključujući invaziju i proliferaciju sposobnosti, su dokumentirani Stupci pogrešaka, standardna devijacija (SD). samo u SGC7901 stanicama [25] , Za potvrdu ovih metastatskih svojstva pomoću 3 stanične linije s različitim PRL-3 izražavanja i genetskom statusu, knock-down endogenog PRL-3 ekspresije provedena je pomoću siRNA transfekcije; AZ521 stanice (niske ekspresije i disomije), H111 stanica (visoku ekspresiju i polysomy), MKN74 stanice (visoka ekspresije i genomske amplifikacije). Ove stanične linije su transficirane s siRNA-PRL-3 ili siRNA-CTR, western bloting pokazala je smanjenje razine PRL-3 proteina siRNA PRL-3 stanice, ali ne i siRNA CTR stanice, u usporedbi sa stanicama koje su lažno liječenja ( slika 3A). Jedna od važnih karakteristika metastatske fenotipa je trebao kao sposobnost za stanice raka da raste pod pričvršćivanje, neovisno uvjetima [26], ali je sudjelovanje u PRL-3 ostaje nepoznata u GC. Svi siRNA-PRL-3 stanice je pokazao da je značajno smanjio veličinu i broj kolonija, u odnosu na siRNA-CTR stanica ili stanica lažno tretmana (Slika 3b). Osim toga, u skladu s prethodnim izvješćima za drugim GC stanične linije [25, 27], također je potvrdio da siRNA-PRL-3 stanice je pokazao znatno manje proliferativne aktivnosti (slika 3c) i invazivne sposobnosti (Slika 3d). Slika 3 Inhibicija metastatskih svojstava nakon transfekcije s siRNA u stanicama s izrazom. (A) Western blotting 72 sata nakon transfekcije. Western blot je također kvantificirati. mock, tretman sa samim Accell siRNA isporuke medija; CTR, liječenje siRNA-CTR; si, liječenje siRNA-PRL-3. (B) testovi tvorbe kolonija u Anchorage neovisan. Reprezentativni slike formiranja kolonija na AZ521 stanica prikazan na gornjoj ploči. S mock-liječenja kao 1,0, relativna brzina broja kolonija je prikazan u donjem panelu. Barovi, 200 pm. (C) proliferacije. Je proliferativna aktivnost AZ521 stanica na 1, 2, 3, 4 ili 5 dana nakon transfekcije (gornja ploča), i relativnu brzinu proliferacije na 5 dana nakon transfekcije (donji panel) su prikazani. (D) Test invazije. Stanice su nasađene na 4 dana nakon transfekcije, i zatim inkubiraju 22 sata. Reprezentativni slike AZ521 stanica (gornja ploča) i relativne invazivne stopa (donji panel) su prikazani. Barovi, 200 mm; *, P izvoznici < 0,05 po ANOVA s post-hoc testom; stupci pogreške, SD. pregled Terapijski potencijal PRL-3 inhibitora, 1-4-brom-2-benziliden rodamina pregled u procjeni terapeutskog potencijala i ispitati orijentir vođenje odgovor na PRL-3-ciljane terapije, mi ocijenili antikancerogeno djelovanje PRL-3 inhibitora, stanice propusna benziliden rodamina spoj [16], protiv 6 staničnim linijama s različitim PRL-3 izražavanja i genetskom statusu; GCIY i AZ521 stanice (niske ekspresije i disomije), KatoIII stanice (visoku ekspresiju i polysomy), SH10 stanice (niske ekspresije i polysomy), MKN7 i MKN74 stanice (visoka ekspresije i genomske amplifikacije). Stanice su tretirane s PRL-3 inhibitora pri koncentracijama u rasponu od 0 do 50 umol /L. PRL-3 inhibitor je pokazao dozi i vremenski ovisne antiproliferativno učinkovitost na svim ispitivanim staničnim linijama, bez obzira na drugačiji PRL-3 razine ekspresije i genetskog statusa, i IC 50 Vrijednosti GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, MKN7 i još MKN74 stanice su 26.77, 9.98, 24.26, 23.95, 22.29 i 9.45 umol /L (Slika 4A). AZ521 i MKN74 stanice su više osjetljivi na PRL-3 tretmana inhibitora nego GCIY i MKN7 stanica koje su kategorizirane kao identične grupe u smislu izražavanja i genetskog statusa, respektivno. Naime, genetski ili izraz status nije bila povezana s osjetljivošću GC stanicama protiv inhibitora PRL-3. Slično učinkovitost je prikazano na formiranje kolonija sidrište neovisan, a EK 50 Vrijednosti GCIY, AZ521, SH10, a MKN74 stanice su 6,99, 9,52, 13,05, 9,09 umol /L (slika 4b). GCIY stanice pokazivale su više osjetljivi inhibicije u suprotnosti s anti-proliferacije. Osim toga, ovaj inhibitor i robusno ukinuta u invazivni sposobnost GC stanicama (slika 4c). Dalje karakterizirati antitumornu aktivnost PRL-3 liječenja inhibitorom, apoptoza test je izveden (slika 5A). Iako je jedan umol /L inhibitora nije bila dovoljna da inducira apoptozu iza osnovne linije (0 umol /L), 10 umol /L inhibitora robusno uzrokovao drastičan apoptozu na svim ispitivanim staničnim linijama, gdje je bilo 3 puta i 11-struki porast izvan osnovne linije u GCIY i MKN74 stanica. Tako, PRL-3 inhibitor potisnuti ta metastatskih svojstva na sve testirane stanične linije na način ovisan o dozi, a niti stupanj ekspresije, niti genetski status pokazao jasnu korelaciju sa osjetljivošću. Slika 4 Anticancer aktivnost PRL-3 inhibitora. (A) proliferacije nakon tretmana s PRL-3 inhibitora pri koncentracijama u rasponu od 0 do 50 umola /L od 6 staničnih linija s različitim PRL-3 ekspresije i genetskog statusa. Sa stanice tretirane kemijsku otopinu sama (0 umol /L PRL-3 inhibitora) kao 1.0, relativna proliferativna stopa na 5 dana nakon tretmana je prikazano na lijevoj ploči. Je proliferativna aktivnost AZ521 stanica na 1, 2, 3, ili 4 dana nakon tretmana je prikazano na desnoj ploči. L, niska izraz; H, visoka ekspresija; D, disomije; P, polysomy; A, pojačanje; IC50, koncentracija inhibicije od 50%. (B) testovi tvorbe kolonija u Anchorage neovisan. Reprezentativni slike formiranja kolonija na AZ521 stanica (gornja ploča) i relativnoj stopi od broja kolonija (donji panel) su prikazani. Barovi, 200 mm; EC50, 50% efektivna koncentracija. (C) Test invazije. prikazani su reprezentativni slika (gornja ploča), a relativna invazivna stopa (donji dio slike). Barovi, 200 mm; *, P izvoznici < 0.05 Student t
testa, u usporedbi s 0 umol /L PRL-3 inhibitora; stupci pogreške, SD.
Slika 5 PRL-3 inhibitora posredovana apoptoza. (A) Apoptoza je analiza provedena 72 sata nakon tretmana s PRL-3 inhibitora (0 do 10 umol /L). Reprezentativni figure apoptoze testa na AZ521 i C2C12 stanice su prikazani u lijevom panelu, a postotak i SD rane apoptoze (donji desni kvadrant) i krajem apoptoze (gornji desni kvadrant) prikazana su na svakoj ploči. Sa stanice tretirane kemijsku otopinu sama (0 umol /L PRL-3 inhibitora) kao 1.0, relativna kasno stopa apoptoza nakon tretmana je prikazano na desnoj ploči. *, P izvoznici < 0.05 Student t
testa, u usporedbi s 0 umol /L PRL-3 inhibitora. (B) PRL-3 inhibitor tretman protiv uobičajenih skeletnih mišića C2C12 stanice. C2C12 stanice pokazuju nižu razinu ekspresije PRL-3 od GC stanica pomoću Western blot-a. Test proliferacije nakon obrade PRL-3 inhibitora provedena. Stupci pogrešaka, SD.
Konačno, procjenjuje da li PRL-3 inhibitora inducirana citotoksičnost u normalnom skeletnim mišićima, gdje PRL-3 uglavnom se izražava [28]. Proliferacije i apoptoze određivanja se provode uporabom uobičajene skeletnih mišića C2C12 stanice tretirane inhibitora, te su pokazali da 10 umol /L inhibitora nije uspjela dovesti do antiproliferativne i apoptotičnog odgovora na C2C12 nasuprot Djelovanja na svim ispitivanim GC stanične linije ( Slika 5a i 5b). pregled Rasprava pregled kao LNM se smatra kao važan prognostički faktor za GC [29], istraživanja ih uzrokuju molekule koje odražavaju LNM je obećavajući put za poboljšanje ishoda. Uska povezanost od LNM sa PRL-3 izražavanja, dakle, ima potencijal kao novi terapijski cilj [6, 25]. Međutim, kriteriji za terapiju PRL-3-ciljani nije utvrđena, a važno je pojasniti karakteristike PRL-3 pregled genomske pojačanje u oba mehaničko i terapeutskih gledišta, jer je glavni mehanizam njegovog posljedična izražavanje i razvoj raka [10]. U ovom istraživanju, u ponudi imamo vitalne naznake za razvoj ove strategije liječenja protiv GC.
Odnos između PRL-3 izražavanja i njegove genomske pojačanje nikada do sada ispituje. PRL-3 pregled genomske amplifikacije je podudarno sa ekspresijskim statusa u staničnim linijama, i pronađen je u 20% (8/40) među ljudskim primarnim tumora izraza, koji su svi stadij III ili IV bolest (40%, 8 /20), ali niti u jednom (0/37) među onima bez izraza. Osim toga, PRL-3 pregled genomske pojačanje bio povezan s LNM status, što dovodi do poodmakloj fazi i time lošim rezultatima u bolesnika s LNM (P
= 0,021). Dakle, PRL-3 pregled genomske pojačanje može biti relevantniji promjena za LNM, a kao jedan od dominantnih mehanizama induciranim svoj izraz u višem stupnju. Međutim, većina tumora koji eksprimiraju PRL-3 nisu pojačani, osobito u earler fazi. U embrionalne stanice fibroblasti miševa s divljeg tipa, ali ne i p53 - /-, PRL-3 je inducirana u p53 ovisan način [30]. P53 mutacija ili gubitak funkcije, međutim, zabilježena je u svim staničnim linijama GC koji se koriste u ovom istraživanju, osim NUGC4 stanice (TP53 web stranice, http:.. //P53 besplatno fr /) , što znači da ne postoji drugi mehanizam neovisno p53 puta. PRL-3 ekspresije se izvještavalo da regulira na razini transkripcije mitogenim citokina kao što je IL-6, IL-21, HGF ili IGF-1 u stanične linije mijeloma [24], ili kako je TGF-P u debelom staničnim linijama raka [ ,,,0],31]. Nedavno, PolyC-RNA-vezujući protein 1 (PCBP1) je identificiran kao translacijski regulator PRL-3 [32]. Alternativni mehanizmi razini transkripcije ili prevođenja može biti uključen da regulira PRL-3 izraz. Pregled Također je potvrdio da siRNA posredovanog PRL-3 obaranje značajno potisnula proliferaciju stanica i invaziju u skladu s prethodnim izvješćima za druge GC stanične linije [25 27], a nadalje po prvi puta otkriva smanjeni učinak tvorbe kolonija pod pričvršćivanje neovisno uvjetima podržava da PRL-3 može biti zanimljiv terapeutski cilj prema GC.

• Mikrornk-645, regulira prema gore u ljudskom adencarcinoma želučanog jednjaka čvora, inhibira apoptozu ciljajući tumor supresor IFIT2
• Prognostički utjecaj otkrivanje održivih cirkulirajućih stanica tumora u bolesnika s karcinomom želuca pomoću telomeraze specifične virusne agent: ciljana studija