Terapeutisk potentiale PRL-3 målretning og kliniske betydning af PRL-3 genomisk forstærkning i gastrisk cancer

Terapeutisk potentiale PRL-3 målretning og kliniske betydning af PRL-3
genomisk forstærkning i mavekræft
Abstract
Baggrund
Phosphatase regenerere lever-3 (PRL-3) har fortjente opmærksomhed som et afgørende molekyle i de multiple trin i metastase. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi de mekanismer, der regulerer PRL-3-ekspression, og vurderede kliniske potentiale af PRL-3-målrettet terapi i gastrisk cancer. Salg Metoder
PRL-3 genomisk amplifikation blev analyseret som kvantitative-polymerasekædereaktion reaktion og /eller fluorescens in situ hybridisering i 77 primære gastriske tumorer. Anticancer aktivitet af PRL-3 inhibitor (1-4-brom-2-benzyliden rhodanin) behandling blev evalueret mod cancerceller med forskellige genetiske og ekspression status.
Resultater Salg PRL-3 genomisk amplifikation var nært overensstemmende med høj niveau for vedkommendes proteinekspression i cellelinjer, og blev fundet i 20% (8/40) blandt humane primære tumorer med sit udtryk, som var alle stadie III /IV sygdom (40%, 8/20), men i ingen (0 /37) blandt dem uden ekspression. Desuden blev PRL-3 genomisk forstærkning forbundet med metastatisk lymfeknude status, hvilket fører til fremskredent stadium og dermed dårlige resultater hos patienter med lymfeknude metastaser (P
= 0,021). PRL-3 små interfererende RNA håndfast undertrykt metastatiske egenskaber, herunder celleproliferation, invasion, og forankringsuafhængig kolonidannelse. Selv om hverken PRL-3 genomisk forstærkning eller udtryk niveau var ansvarlig for følsomhed over for PRL-3-hæmmer behandling, viste hæmmer dosisafhængig anticancer effekt, og bemærkelsesværdigt induceret apoptose på alle de testede cellelinjer med PRL-3-ekspression.
konklusioner
Vi har for første gang, viste, at PRL-3 genomisk forstærkning er en af ​​de dominerende mekanismer fremkalde sit udtryk, især i mere fremskredent stadium, og at PRL-3-målrettet behandling kan have et stort potentiale mod mavekræft med sit udtryk.
Nøgleord
PRL-3 mavekræft genomisk forstærkning målrettet terapi lymfeknude Baggrund
gastric kræft (GC) er den fjerde mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1 ]. Nylige forbedringer i diagnostiske værktøjer og metoder har lettet detektion af tidlig GC og dermed fremragende langsigtede overlevelse. Men patienter med fremskreden sygdom på tidspunktet for diagnosen forbliver dårlige resultater. Metastase er en flertrins proces, der involverer lokal invasion, formidling og genetablering i fjerntliggende organer, og er den vigtigste faktor for dødelighed [2]. Derfor kan en bedre forståelse af metastaser bane vejen for et væld af innovative terapeutiske strategier i GC.
Den protein tyrosinphosphataser (PTP'er) udgør en stor familie af enzymer, der tjener som centrale regulatoriske elementer i signaltransduktionsveje [3] . De phosphataser af regenererende lever (PRL-1, -2, og -3), der tilhører en lille klasse af PTP-superfamilien, har en unik COOH-terminal prenylering motiv, som kritisk påvirker deres cellulære lokalisering og funktion [4]. PRL-3 blev først identificeret til at være specifikt overudtrykt i levermetastaser afledt af kolorektal cancer [5], og efterfølgende dens overekspression blev dokumenteret i forskellige tumor typer, herunder GC [6]. PRL-3 kan fremme kræft invasion, migration, vækst og angiogenese, enten gennem dephosphorylering der katalyseres af katalytiske domæne eller lokalisering til plasmamembranen instrueret af COOH-terminale prenylering motiv [7-9]. Således har PRL-3 fortjente opmærksomhed som et afgørende molekyle i de multiple trin i metastase og derfor som ny terapeutisk mål. På den anden side er de mekanismer inducerer PRL-3-ekspression ikke fuldt afklaret. Amplifikation af genomiske regioner, der indeholder onkogener er den største mekanisme deraf følgende overekspression og cancerudvikling, og har derfor betydning for målrettede behandlinger [10]. PRL-3
genamplifikation delvist tegner sig for den overekspression i kolorektal cancer og kræft i spiserøret [5, 11]. Men forholdet mellem genomisk forstærkning og GC er fortsat undvigende i både mekaniske og terapeutiske synspunkter. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi karakteristika PRL-3
genomisk amplifikation i GC, og yderligere vurderet det kliniske potentiale PRL-3-målrettet terapi. Salg Metoder Salg cellelinier og vævsprøver
GC cellelinje MKN7 blev venligst stillet til rådighed fra Cell Resource center for Biomedical Research Institute of Development, Aldring og Kræft, Tohoku Universitet (Sendai, Japan). Syv andre GC cellelinjer (GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, H111, MKN74, og NUGC4) blev købt fra Riken Bioresource Center (Ibaraki, Japan). Disse cellelinjer dække de to hovedtyper af GC [12], intestinal type (MKN7, MKN74, AZ521, og H111 celler) og diffus typen (GCIY, KatoIII, SH10 og NUGC celler) [13-15]. MKN7, NUGC4, og AZ521 celler blev etableret fra lymfeknudemetastaser (LNM), og MKN74 celler var fra levermetastaser. KATOIII og GCIY celler blev etableret fra metastatisk pleural effusion og ascites, henholdsvis. H111 og SH10 celler blev etableret fra xenotransplantation. Normale skeletmuskel C2C12 celler blev indkøbt fra DS Pharma Biomedical Co, Ltd (Osaka, Japan). AZ521 og C2C12 celler blev dyrket i DMEM-medium (GIBCO, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). De øvrige celler blev dyrket i RPMI1640-medium (GIBCO) suppleret med 10% FBS. 1-4-brom-2-benzyliden rhodanin blev indkøbt fra Calbiochem Corp (San Diego, CA), der blev identificeret som en PRL-3-inhibitor gennem high throughput screening under anvendelse af kemisk bibliotek Korea Chemical Bank, og inhiberede PRL-3 phosphataseaktivitet [16]. Faktisk phosphorylering af KRT8, PRL-3-interagerende protein, induceret ved katalytisk inaktiv mutant af PRL-3, men ikke af vildtype, blev bekræftet ved PRL-3-inhibitor behandling på en dosis-afhængig måde [17]. Endvidere anticancer effekt af PRL-3-inhibitor behandling viste også at svare til den for siRNA behandling i esophageal cancer eller kolorektal cancer [11, 17].
Ud af 173 formalinfikseret, paraffinindlejret, vævsprøver serie, hvor vi tidligere vurderede PRL-3 udtryk status ved hjælp af immunhistokemisk farvning (IHC) i GC [6], 77 matchede par af primære tumorvæv og de tilsvarende normale slimhinde væv blev tilfældigt udvalgt fra patienter med differentierede etaper efter 13 th udgave af den japanske Klassificering af gastrisk karcinom (JCGC) [18]; 40 par med positiv PRL-3-ekspression (10 patienter i fase I, 10 i II, 10 i III, og 10 i IV) og 37 par med negative udtryk (10 patienter i fase I, 10 i II, 9 i III, og 8 i IV). Alle patienter gennemgik gastrektomi ifølge mavens retningslinjer kræftbehandling i Japan [19], og histopatologiske undersøgelser blev foretaget i overensstemmelse med JCGC. Den 6 th udgave af International Union Against Cancer (UICC) /blev også brugt TNM klassifikationen [20]. Tabel 1 viser detaljerede oplysninger om 77 patienter. Alle vævsprøver blev indsamlet ved Kitasato Universitetshospital, og informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. Den foreliggende undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Kitasato University.Table 1 Sammenhæng mellem PRL-3 genamplifikation og klinisk-patologiske variabler i 77 patienter med mavekræft


PRL-3 genamplifikation

variabler
Samlet antal
negativitet
Positivitet
p Drømmeholdet værdi


Number
(%)

Number
(%)

PRL-3 udtryk
0,006
negativitet
37
37 Hotel (100 )
0
(0)
positivitet
40
32 Hotel (80)
8 Hotel (20) Salg Alder (år)
0,726
< 60
34
30 Hotel (88)
4
(12)
≥60
43
39 Hotel (91)
4
(9)
Køn
0.710
Mand
51
45 Hotel (88)
6
(12)
Female
26
24 Hotel (92)
2 Hotel (8)
lymfatisk permeation
0,343
Fravær
15
15 Hotel (100)
0
(0)
Presence
62
54 Hotel (87)
8 Hotel (13)
vaskulær gennemtrængning
0,263
Fravær
25
24 Hotel (96)
1 Hotel (4)
Presence
52
45 Hotel (87)
7
(13)
Differentiering
0,134
Godt og moderat
31
30 Hotel (97)
1 Hotel (3)
Poor
46
39 Hotel (85)
7 Hotel (15)
dybde invasion
0,006 *
T1 (m og sm)
15
15
(100)
0
(0)
T2 (mp og ss)
35
33 Hotel (94)
2 Hotel (6)
T3 (se)
19
16 Hotel (84)
3 Hotel (16)
T4 (si)
8
5 Hotel (63)
3 Hotel (38)
lymfeknudemetastase
0,022
Fravær
29
29 Hotel (100)
0
(0)
Presence
48
40 Hotel (83)
8 Hotel (17)
JCGC lymfeknude status †
0,004 *
n0
29
29
(100)
0
(0)
N1
21
20 Hotel (95)
1 Hotel (5)
N2
20
14 Hotel (70)
6
(30)
N3 og fjernt lymfeknuder
7
6
(86)
1
(14)
UICC lymfeknude status ‡
0,002 *
n0
29
29 Hotel (100)
0
(0)
N1
18
17 Hotel (94)
1
(6)
N2
16
13 Hotel (81)
3
(19)
N3 og fjernt lymfeknuder
14
10 Hotel (71)
4
(29)
JCGC etape
0,005 *
I (IA og IB )
20
20 Hotel (100)
0
(0)
II
20
20 Hotel (100)
0
(0)
III (IIIA og IIIB)
19
15 Hotel (79)
4
(21)
IV
18
14
(78)
4
(22)
UICC stadium
0,003 *
I (IA og IB)
21
21 Hotel (100)
0
(0)
II
20
20 Hotel (100)
0
(0)
III (IIIA og IIIB)
16
13 Hotel (81)
3 Hotel (19)
IV
20
15 Hotel (75)
5 Hotel (25)
Fluorescens in situ hybridiseringsanalyse
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse blev udført som tidligere [11] beskrevne. PRL-3
er placeret på kromosom 8q24.3 (GenBank accessionsnummer NT 000.008,9), og kromosomet 8 centromere probe blev anvendt til at estimere kopitallet. Fordi PRL-3
FISH scoring algoritmer ikke var blevet standardiseret, blev vurderingen baseret på kriterierne i HER2
[21]. For hver prøve blev mindst 60 cancerceller scoret. Positiv PRL-3
genomisk forstærkning blev defineret som et forhold mellem PRL-3
til kromosom 8 centromer mere end 2,2, og negative var på mindre end 1,8. Hvis forholdet mellem PRL-3
til kromosom 8 centromer var 1,8 til 2,2, blev yderligere celler talt, og forholdet mellem mere end 2,0 blev endelig betragtet som positiv [21]. Polysomy blev defineret som de gennemsnitlige kromosom 8 centromere signaler mere end 3,0 pr kerne [22].
Kvantitativ-genomisk PCR
Vævssnit fra tumor og tilsvarende normale slimhinde, opnået mindst 5 cm fra tumoren kant, var skarpt dissekeret på hæmatoxylin og eosin-farvede slides, og genomisk DNA blev efterfølgende udvundet ved hjælp af et QIAamp DNA FFPE (Qiagen Sciences, Hilden). Kvantitativ-genomisk polymerasekædereaktion (Q-PCR) blev udført for at kvantificere PRL-3
gen kopiantal ved hjælp iQ ™ Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) i tre eksemplarer på iCycler iQ ™ Real-Time PCR Detection systemet (Bio-Rad). At normalisere PRL-3
genkopital per celle, ADAM metallopeptidase domæne 2 (ADAM2
, NT 923907,1), placeret på kromosom 8p11.2, blev anvendt som en endogen reference, fordi der genamplifikation er defineret som en kopi antal forøgelse af en begrænset region af et kromosom arm [10]. ACt-værdier blev beregnet som Ct (PRL-3
) -Ct (ADAM2
) for hver prøve. Relativ kopi nummer blev bestemt som 2 - ΔΔ Ct, hvor ΔΔC t = ΔC t (tumor) -ΔC t (svarende normal) [23]. Stigningerne med mere end 2 gange i forhold til de tilsvarende normale blev betragtet som genomisk amplifikation. Supplerende fil 1 viser detaljeret PCR tilstand og sekvenser af primer og probe anvendes i den foreliggende undersøgelse.
Western blotting
Hele cellelysater blev ekstraheret i RIPA-buffer (Pierce, Rockford, IL) tilsat 10 uL /​​mL Halt ™ protease Inhibitor Cocktail Kit (Pierce) og Halt ™ Phosphatase Inhibitor Cocktail Kit (Pierce), og proteinet blev separeret på NuPAGE ® 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Både detektion og kvantificering af de specifikke proteiner blev udført ved hjælp af ATTO Light Capture (ATTO Corporation, Tokyo, Japan). To kolorektale cancercellelinjer DLD-1 og SW480-celler (RIKEN Bioresource) blev anvendt som de lave og høje ekspressionsniveauer kontroller, henholdsvis, som tidligere beskrevet [11]
PRL-3 muse monoklonalt antistof (R &. D Systems, Minneapolis , MN) og β-actin-monoklonalt museantistof (Sigma, St. Louis, MO) blev anvendt som tidligere beskrevet [11].
PRL-3 lille interfererende RNA transfektion
Celler blev transficeret med 1 pmol /L Accell SMARTpool, siRNA-PRL-3 (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) blandet med Accell siRNA Delivery Media (Thermo Fisher Scientific) i henhold til Thermo Scientific Dharmacon ® Accell ™ siRNA Delivery protokollen [24]. Den Accell Ikke-targeting Pool (siRNA-ctr) og Accell siRNA Delivery Media alene blev anvendt som kontrol for ikke-sekvensspecifikke virkninger og som en mock-behandling hhv.
Forankringsuafhængig kolonidannelse assayet
forankringsuafhængig cellevækst blev analyseret ved udpladning 0,36% topagarose (Bacto ™ Agar, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) indeholdende 1 x 10 5 celler på en overflade på 0,72% bottom agarose i 6 brønde plader [11]. Celler blev fodret ugentligt ved overliggende frisk blød-agar-opløsning, og kolonier blev fotograferet efter 2 ugers inkubation. De 50% effektiv koncentration (EF 50) Værdien af ​​PRL-3-hæmmer behandling blev beregnet på grundlag af måling af kimtal.
Spredning assay og invasion assay
spredning udførtes ved hjælp Premix WST-1 celleproliferationsassay System (Takara Bio, Tokyo). Celler (2 x 10 3) blev podet i 96-brønds, og den proliferative aktivitet blev målt ved absorbans ved 450 nm på prøvetagningssteder dage. Følsomheden over for PRL-3-inhibitor på antiproliferative blev bestemt under anvendelse af 50% hæmmende koncentration (IC 50) værdi efter behandling i 72 timer.
Invasion assay blev udført i 24-brønd BD BioCoat ™ Matrigel ™ invasion Chamber (BD Biosciences Discovery Labware, Bedford, MA). Celler, som havde invaderet gennem membranen blev talt i fire adskilte felter pr brønd. Begge eksperimenter blev udført tre gange.
Apoptoseassays Salg Apoptosis assays blev udført under anvendelse af Guava PCA System (Guava Technologies, Inc., Hayward, CA). Celler (2 x 10 5) blev behandlet med PRL-3-inhibitor ved den angivne koncentration i medium supplerende med 1,0% FBS i 72 timer, derefter farvet med Annexin V og 7-AAD (Guava nexin reagens). Eksperimentet blev udført tre gange og analyseret under anvendelse CytoSoft 2.1.5 software (Guava Technologies).
Statistiske analyser
Fishers eksakte test, eller Mann-Whitney U
-test blev anvendt til statistisk analyse af forholdet mellem PRL-3
genamplifikation og klinisk-patologiske variabler. Envejs variansanalyse (ANOVA) med post-hoc test blev anvendt til sammenligning mellem tre grupper for siRNA behandling (siRNA-PRL-3, siRNA-ctr, og mock). Student t
test blev anvendt til at evaluere terapeutisk virkning for de enkelte koncentrationer af PRL-3-inhibitor sammenlignet med 0 pmol /L i PRL-3 inhibitor. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere kumulative overlevelsesrater, og forskelle i overlevelsesrater blev vurderet ved anvendelse af log-rank test. Alle dødsfald blandt patienterne var cancer-relaterede, og sygdomsspecifikke overlevelse (DSS) blev målt fra tidspunktet for kirurgi til dødsdagen eller den sidste opfølgning. P
< 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans. Alle statistiske analyser blev udført med JMP 7.0 software (SAS Institute, Cary, NC).
Resultater
PRL-3 ekspression og genomisk forstærkning i gastrisk cancer cellelinjer
Oprindeligt var PRL-3 udtryk status evalueret ved brug western blotting i 8 GC cellelinjer (figur 1A). PRL-3-ekspression blev observeret ved et påviseligt niveau i alle cellelinjer, blandt hvilke 5 cellelinjer (KatoIII, H111, MKN7, MKN74, og NUGC4 celler) og 3 cellelinier (GCIY, AZ521, og SH10 celler) udviste høj og relativt lav ekspression hhv. Efterfølgende blev FISH-analyse udført for at undersøge, om PRL-3-ekspression blev forårsaget ved dets genomiske amplifikation (figur 1B). Genomisk forstærkning var selvfølgelig positiv i 2 cellelinjer (MKN7 og MKN74 celler) og negativ i 6 cellelinjer. 3 af de seks var dysomic (AZ521, GCIY, og NUGC4 celler), og tre var polysomic (KatoIII, SH10, og H111 celler). PRL-3
genomisk forstærkning ofte fandt sted i de forskellige regioner fra kromosom 8, såkaldt distribuerede indsættelser på metafase [10], og var samstemmende med sin høje udtryk. Figur 1 Ekspression og genetiske status PRL-3 i 8GC cellelinier. (A) Ekspression niveau af PRL-3 ved Western blotting. (B) FISH-analyse på metafase af PRL-3
genet (grøn). Kromosom 8 centromere probe (orange) blev anvendt til at estimere kopitallet.
Karakteristisk for PRL-3
genomisk amplifikation i humane primære gastriske cancere
I vores tidligere undersøgelse blev PRL-3-ekspression påvist i 95 (55%) ud af 173 primære GCS ved IHC [6]. At udforske sammenhængen mellem PRL-3-ekspression og dens genomisk forstærkning, blev Q-PCR udført for både de 40 tumorer med positiv PRL-3-ekspression og 37 tumorer med negativ udtryk, der tilfældigt blev udvalgt fra differentiale stadier i de 173 primære tumorer. Alle de primære tumorer uden PRL-3-ekspression blev ikke forstærket, mens 8 (20%) ud af de 40 primære tumorer med PRL-3-ekspression blev forstærket (figur 2A). FISH analyser også bekræftet indlysende genomisk amplifikation som kræft-specifikke ændring (figur 2B), og udstillet på næsten homogen mønster i både det centrale område og invasive område inden tumor. Efterfølgende blev forholdet til klinisk-patologiske faktorer vurderet for PRL-3
genomisk amplifikation (tabel 1), hvor den blev signifikant associeret ikke kun med dets ekspression (P
= 0,006), men også med dybden af ​​tumorinvasion ( P
= 0,006), tilstedeværelse af LNM (P
= 0,022), LNM status (P
= 0,004 i JCGC, P
= 0,002 i UICC), og fase (P
= 0,005 i JCGC, P
= 0,003 i UICC). Derudover har alle de primære tumorer med genomisk forstærkning var stadie III eller IV sygdom (40%, 8/20). Desuden genomiske forstærkning negativt påvirket resultaterne af de histologisk node-positive patienter (P
= 0,021, figur 2C), selv om PRL-3-ekspression ikke i vores og andre tidligere rapporter [6, 25]. Figur 2 Frekvens og prognose af PRL-3 genomisk forstærkning i 77 menneskelige GC. (A) Hyppigheden af ​​PRL-3
genomisk forstærkning ved hjælp af Q-PCR i 77 menneskelige GC. Q-PCR blev udført for både de 40 tumorer med positiv PRL-3-ekspression og 37 tumorer med negativ ekspression. At normalisere PRL-3
genkopital per celle, ADAM2
, placeret på kromosom 8p11.2, blev anvendt som en endogen reference. ACt-værdier blev beregnet som Ct (PRL-3
) -Ct (ADAM2
) for hver prøve. Relativ kopi nummer blev bestemt som 2-ΔΔCt, hvor ΔΔCt = ACt (tumor) -ΔCt (svarende normal). (B) repræsentant FISH-analyse af PRL-3
gen i primær tumor og tilsvarende normale (tilfælde 82). (C) Kaplan Meier kurver af 5-års DSS henhold til positivitet eller negativitet af PRL-3
genomisk forstærkning i histologisk node-positive patienter. Fejl barer, standardafvigelse (SD).
PRL-3 som en konvergent terapeutisk target
I GC, de funktionelle roller PRL-3, herunder invasion og spredning evner, er blevet dokumenteret kun SGC7901 celler [25] . For at bekræfte disse metastatiske egenskaber ved hjælp af 3 cellelinjer med forskellige PRL-3 ekspression og genetisk status, knock-down af endogen PRL-3-ekspression blev udført ved hjælp af siRNA transfektion; AZ521 celler (lav ekspression og disomi), H111 celler (høje ekspressionsniveauer og polysomy), MKN74 celler (høje ekspressionsniveauer og genomisk forstærkning). Disse cellelinier blev transficeret med siRNA-PRL-3 eller siRNA-ctr, og western blotting viste nedsat niveau af PRL-3 protein i siRNA-PRL-3 celler, men ikke siRNA-CTR celler, sammenlignet med mock-behandling celler ( Figur 3A). En af de vigtige kendetegn ved den metastatiske fænotype formodes som evnen til cancerceller til at vokse under forankringsuafhængige betingelser [26], men inddragelse i PRL-3 er ukendt i GC. Alle siRNA-PRL-3 celler viste signifikant nedsat størrelsen og antallet af kolonier, sammenlignet med siRNA-ctr celler eller mock-behandling celler (figur 3B). Desuden i overensstemmelse med tidligere rapporter for andre GC cellelinjer [25, 27], vi bekræftede også, at siRNA-PRL-3 celler viste signifikant mindre proliferative aktivitet (figur 3C) og invasive evne (figur 3D). Figur 3 Inhibering af metastatiske egenskaber efter transfektion med siRNA i celler med ekspression. (A) Western blotting 72 timer efter transfektion. Den western blotting blev også kvantificeret. mock, behandling med Accell siRNA Delivery Media alene; ctr, behandling med siRNA-ctr; si, behandling med siRNA-PRL-3. (B) forankringsuafhængig kolonidannelse assays. Repræsentative billeder af kolonidannelse på AZ521 celler blev vist i toppanelet. Med mock-behandling som 1,0, blev den relative koloni nummer vist i nederste panel. Barer, 200 um. (C) Proliferation assay. Den proliferative aktivitet af AZ521 celler på 1, 2, 3, 4, eller 5 dage efter transfektion (øverste felt) og den relative proliferationshastighed på 5 dage efter transfektion (nederste panel) blev vist. (D) Invasion assay. Celler blev podet på 4 dage efter transfektion, og derefter inkuberet i 22 timer. Repræsentative billeder af AZ521 celler (top panel) og den relative invasive sats (nederste panel) blev vist. Barer, 200 um; *, P
< 0,05 ved ANOVA med post-hoc test; fejllinjer, SD.
terapeutiske potentiale for PRL-3-inhibitor, 1-4-brom-2-benzyliden rhodanin
For at vurdere det terapeutiske potentiale og undersøge en milepæl lede reaktion på PRL-3-målrettet terapi, vi evalueret anticancer aktivitet af PRL-3-inhibitor, celle-permeable benzyliden rhodanin forbindelse [16], mod 6 cellelinier med forskellig PRL-3-ekspression og genetisk status; GCIY og AZ521 celler (lav udtryk og disomi), KatoIII celler (høj udtryk og polysomy), SH10 celler (lav udtryk og polysomy), MKN7 og MKN74 celler (høj udtryk og genomisk forstærkning). Celler blev behandlet med PRL-3-inhibitor ved koncentrationer i området fra 0 til 50 pmol /L. PRL-3-inhibitor viste dosis- og tidsafhængig antiproliferativ effekt på alle de testede cellelinjer, uanset forskellige PRL-3 ekspressionsniveauet og genetisk status, og IC 50 værdier af GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, MKN7 , og MKN74 celler var 26,77, 9,98, 24,26, 23,95, 22,29, og 9,45 mmol /l, henholdsvis (figur 4A). AZ521 og MKN74 celler var mere følsomme over for PRL-3-hæmmer behandling end GCIY og MKN7 celler, der blev kategoriseret som de identiske grupper i form af udtryk og genetisk status hhv. Blev nemlig genetisk eller ekspressionsstatus ikke er forbundet med følsomhed GC celler mod PRL-3 inhibitor. Lignende virkning blev vist i forankringsuafhængig kolonidannelse, og EF 50 værdier af GCIY, AZ521, SH10, og MKN74 celler var 6,99, 9,52, 13,05, 9,09 mmol /l, henholdsvis (figur 4B). GCIY celler udviste mere følsomme hæmning i modsætning til anti-proliferation. Desuden er denne inhibitor også robust ophævet den invasive evne GC-celler (figur 4C). Til yderligere karakterisering af anticancer effekt af PRL-3-inhibitor behandling blev apoptose assay udført (figur 5A). Selvom 1 pmol /l af inhibitoren var utilstrækkelig til at fremkalde apoptose ud over baseline (0 pmol /L), 10 pmol /l af inhibitoren robust forårsagede drastiske apoptose på alle de testede cellelinjer, hvor der var 3 gange og 11-fold forhøjelser ud over baseline i GCIY og MKN74 celler, hhv. Således PRL-3-inhibitor undertrykt disse metastatiske egenskaber på alle de testede cellelinjer i dosisafhængig måde, og hverken ekspressionsniveauet eller genetisk status viste klar sammenhæng med følsomheden. Figur 4 Anticancer aktiviteten af ​​PRL-3 inhibitor. (A) Proliferation assay efter behandling med PRL-3-inhibitor ved koncentrationer i området fra 0 til 50 mmol /l mod 6 cellelinier med forskellig PRL-3-ekspression og genetisk status. Med celler behandlet med kemisk opløsning alene (0 pmol /L PRL-3-inhibitor) som 1,0, blev den relative proliferationshastighed på 5 dage efter behandlingen er vist i venstre panel. Den proliferative aktivitet af AZ521 celler på 1, 2, 3, eller 4 dage efter behandlingen blev vist i højre panel. L, lav udtryk; H, høj ekspression; D, disomi; P, polysomy; A, amplifikation; IC50, den 50% inhiberende koncentration. (B) forankringsuafhængig kolonidannelse assays. Repræsentative billeder af kolonidannelse på AZ521 celler (top panel) og den relative hastighed af koloni nummer (nederste panel) blev vist. Barer, 200 um; EC50, den 50% effektive koncentration. (C) Invasion assay. Repræsentative billeder (top panel) og den relative invasive sats (nederste panel) blev vist. Barer, 200 um; *, P
< 0,05 ved Student t
test, sammenlignet med 0 pmol /L i PRL-3 inhibitor; fejllinjer, SD.
Figur 5 PRL-3-inhibitor-medieret apoptose. (A) Apoptose assay blev udført 72 timer efter behandling med PRL-3 inhibitor (0 til 10. pmol /L). Repræsentative tal for apoptose assay på AZ521 og C2C12-celler er vist i venstre panel, og procentdelen og SD af tidlig apoptose (nederste højre kvadrant) og sen apoptose (øverste højre kvadrant) er vist i hvert panel. Med celler behandlet med kemisk opløsning alene (0 pmol /L PRL-3-inhibitor) som 1,0, blev den relative sent apoptose efter behandling er vist i højre panel. *, P
< 0,05 ved Student t
test, sammenlignet med 0 pmol /L i PRL-3 inhibitor. (B) PRL-3-hæmmer behandling mod normale skelet muskel C2C12 celler. C2C12 celler udviste lavere ekspressionsniveau af PRL-3 end GC-celler ved Western blotting. Proliferationsassay efter behandling med PRL-3-inhibitor blev udført. Fejllinjer, SD.
Endelig har vi vurderet, om PRL-3-inhibitor induceret cytotoksicitet i normal skeletmuskel, hvor PRL-3 udtrykkes overvejende [28]. Både celleproliferation og apoptose assays blev udført ved anvendelse af normale skeletmuskel C2C12 celler behandlet med inhibitoren, og viste, at 10 pmol /l af inhibitoren ikke forårsage antiproliferativ og apoptotisk respons på C2C12 i modsætning til de effektiviteter på alle de testede GC cellelinier ( 5A og 5B).
diskussion
som LNM betragtes som en vigtig prognostisk faktor for GC [29], forskning af sygdomsfremkaldende molekyler afspejler LNM er en lovende vej til at forbedre resultaterne. Den tætte forbindelse mellem LNM med PRL-3 udtryk har derfor potentiale som en ny terapeutisk target [6, 25]. Imidlertid er kriterierne for PRL-3-målrettet terapi ikke etableret, og det er afgørende at præcisere de særlige kendetegn ved PRL-3
genomisk amplifikation i både mekanistiske og terapeutiske synspunkter, på grund af den større mekanisme for deraf følgende udtryk og kræft udvikling [10]. I den foreliggende undersøgelse, tilbyder vi de afgørende spor for udviklingen af ​​denne terapeutiske strategi mod GC.
Forholdet mellem PRL-3 Udtrykket og genomisk forstærkning er aldrig blevet undersøgt indtil videre. PRL-3
genomisk amplifikation var overensstemmende med dets ekspression status i cellelinier, og blev fundet i 20% (8/40) hos humane primære tumorer med ekspression, som alle blev stadium III eller IV sygdom (40%, 8 /20), men i ingen (0/37) blandt dem uden udtryk. Desuden blev PRL-3
genomisk forstærkning forbundet med LNM status, hvilket fører til fremskredent stadium og dermed dårlige resultater hos patienter med LNM (P
= 0,021). Således kan PRL-3
genomisk forstærkning være mere relevant ændring for LNM, og være en af ​​de fremherskende mekanismer inducerer sit udtryk i den mere fremskredent stadium. Imidlertid blev de fleste tumorer, der udtrykker PRL-3 ikke amplificeret, især i buhet fase. I muse embryonale fibroblastceller med vildtype men ikke p53 - /-, PRL-3 induceres i en p53-afhængig måde [30]. P53 mutation eller tab af funktion, dog er dokumenteret i alle GC cellelinjer, der anvendes i den foreliggende undersøgelse, bortset fra NUGC4 celler (The TP53 web-stedet, http:.. //P53 fr fri /) , hvilket indikerer, at der er anden mekanisme uafhængigt af p53 pathway. PRL-3-ekspression blev rapporteret skal reguleres på transkriptionelt niveau ved mitogene cytokiner, såsom IL-6, IL-21, HGF eller IGF-1 i myelomcellelinjer [24], eller som TGF-β i colon cancercellelinier [ ,,,0],31]. For nylig er PolyC-RNA-bindende protein 1 (PCBP1) blevet identificeret som en translationel regulator af PRL-3 [32]. De alternative mekanismer på transkriptionel eller translationel niveau kan være involveret til at regulere PRL-3-ekspression.
Vi bekræftede også, at siRNA-medieret PRL-3 knockdown betydeligt undertrykt celleproliferation og invasion i overensstemmelse med tidligere rapporter for andre GC cellelinjer [25 , 27], og desuden for første gang afslørede reduceret effekt af kolonidannelse under forankringsuafhængige betingelser, støtte, at PRL-3 kan være attraktive terapeutisk mål imod GC.

• MicroRNA-645, opreguleret i human adencarcinoma af gastrisk esophageal vejkryds, hæmmer apoptose ved at målrette tumor suppressor IFIT2
• Prognostisk betydning detektere levedygtige cirkulerende tumorceller i mavecancerpatienter ved hjælp af en telomerase-specifik viral agent: en prospektiv undersøgelse