Potenziale terapeutico di PRL-3 targeting e significato clinico di PRL-3 amplificazione genomica nel cancro gastrico

Potenziale terapeutico di PRL-3 targeting e significato clinico di PRL-3
amplificazione genomica nel carcinoma gastrico
Abstract
sfondo
fosfatasi di rigenerare il fegato-3 (PRL-3) ha meritato attenzione come un cruciale molecola nelle molteplici fasi di metastasi. Nel presente studio, abbiamo esaminato i meccanismi che regolano PRL-3 espressione e valutato il potenziale clinico della terapia PRL-3-mirata nel carcinoma gastrico.
Metodi
PRL-3 amplificazione genomica è stato analizzato utilizzando una catena della polimerasi quantitativa- reazione e /o ibridazione in situ fluorescente in 77 tumori gastrici primari. L'attività antitumorale di PRL-3 inibitore (1-4-bromo-2-benzilidene rodanina) il trattamento è stata valutata contro le cellule tumorali con diversi status genetico e di espressione.
Risultati
PRL-3 amplificazione genomica era strettamente concorde con alta livello della sua espressione della proteina in linee cellulari, ed è stato trovato nel 20% (8/40) fra i tumori primari umani con la sua espressione, che erano tutti stadio III /IV malattia (40%, 8/20), ma in nessuno (0 /37), tra quelli senza espressione. Inoltre, PRL-3 amplificazione genomica è stata associata con metastatico stato dei linfonodi, che porta alla fase avanzata e risultati così scarsi nei pazienti con metastasi linfonodali (p = 0,021)
. PRL-3 piccoli RNA interferenti robusto represso proprietà metastatiche, tra cui la proliferazione cellulare, l'invasione, e la formazione di colonie di ancoraggio-indipendente. Sebbene né genomico livello di amplificazione né espressione PRL-3 era responsabile della sensibilità PRL-3 trattamento inibitore, l'inibitore mostrato efficacia antitumorale dose-dipendente, e apoptosi indotta notevolmente su tutte le linee cellulari testate con PRL-3 espressione.
Conclusioni
abbiamo per la prima volta, hanno dimostrato che PRL-3 amplificazione genomica è uno dei meccanismi predominanti inducendo la sua espressione, soprattutto in fase più avanzata, e che la terapia PRL-3-targeting possono avere un grande potenziale contro il cancro gastrico con la sua espressione.
Parole
PRL-3 cancro gastrico genomica amplificazione terapia mirata linfonodo Sfondo
cancro gastrico (GC) è la quarta più comune di cancro e la seconda causa di morte per cancro in tutto il mondo [1 ]. Recenti miglioramenti in strumenti e metodi diagnostici hanno facilitato il rilevamento di GC precoce e quindi eccellente sopravvivenza a lungo termine. Tuttavia, i pazienti con malattia avanzata al momento della diagnosi rimangono scarsi risultati. Metastasi è un processo a più fasi, che coinvolge invasione locale, la diffusione, e il ripristino in organi distanti, ed è il principale determinante della mortalità [2]. Pertanto, una migliore comprensione delle metastasi può aprire la strada a una serie di strategie terapeutiche innovative in GC.
Le fosfatasi della proteina tirosina (PTP) formano una grande famiglia di enzimi che servono componenti normativi come chiave nelle vie di trasduzione del segnale [3] . Le fosfatasi di fegato rigenerante (PRL-1, -2, e -3), appartenenti ad una piccola classe di PTP superfamiglia, hanno un motivo prenilazione COOH-terminale unico, che colpisce criticamente la loro localizzazione e funzione cellulare [4]. PRL-3 è stato in primo luogo identificato per essere specificamente over-espresso in metastasi epatiche derivate da cancro del colon [5], e, successivamente, la sua sovraespressione è stata documentata in vari tipi di tumore, tra cui GC [6]. PRL-3 può promuovere l'invasione del cancro, la migrazione, la crescita, e l'angiogenesi, attraverso sia defosforilazione che viene catalizzata da dominio catalitico o la localizzazione di membrana plasmatica diretto da motivo prenilazione COOH-terminale [7-9]. Così, PRL-3 ha meritato attenzione come molecola cruciale nelle molteplici fasi di metastasi e quindi come un nuovo bersaglio terapeutico. D'altra parte, i meccanismi che inducono PRL-3 espressione non sono completamente chiariti. Amplificazione delle regioni genomiche contenenti oncogeni è il principale meccanismo della sua conseguente sovraespressione e lo sviluppo del cancro, e quindi ha importanza per terapie mirate [10]. PRL-3
gene amplificazione spiega in parte per la sovraespressione nel cancro del colon-retto e cancro esofageo [5, 11]. Tuttavia, il rapporto tra l'amplificazione genomica e GC rimane sfuggente nei punti sia meccanicistici e di vista terapeutico. Nel presente studio, abbiamo esaminato le caratteristiche di PRL-3
amplificazione genomica in CG, e valutato ulteriormente il potenziale clinico della terapia PRL-3-mirato.
Metodi
cellulare linee e campioni di tessuto
la linea cellulare GC MKN7 è stato gentilmente fornito dal cellulare Resource center for Biomedical Research Institute di sviluppo, l'invecchiamento e il cancro, Università di Tohoku (Sendai, Giappone). Sette altre linee cellulari GC (GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, H111, MKN74, e NUGC4) sono stati acquistati da RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Giappone). Queste linee cellulari coprire i due principali tipi di GC [12], tipo intestinale (MKN7, MKN74, AZ521, e le cellule H111) e di tipo diffuso (GCIY, KatoIII, SH10, e cellule NUGC) [13-15]. MKN7, NUGC4, e AZ521 le cellule sono state stabilite da metastasi linfonodali (LNM), e le cellule MKN74 erano da metastasi epatiche. cellule KATOIII e GCIY sono state stabilite dal metastatico versamento pleurico e ascite, rispettivamente. cellule H111 e SH10 sono stati stabiliti dal xenotrapianti. C2C12 muscolo scheletrico normali sono stati acquistati da DS Pharma Biomedical Co., Ltd (Osaka, Giappone). cellule AZ521 e C2C12 sono state coltivate in DMEM media (GIBCO, Carlsbad, CA) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS). Le altre cellule sono state coltivate in terreno RPMI1640 (GIBCO) supplementato con 10% FBS. 1-4-bromo-2-benzilidene rodanina è stato acquistato da Calbiochem Corp (San Diego, CA), che è stato identificato come un PRL-3 inibitore attraverso un elevato throughput screening utilizzando libreria chimica della Corea Chemical Bank, e inibito PRL-3 attività di fosfatasi [16]. Infatti, fosforilazione di KRT8, proteine, indotta dal mutante cataliticamente inattivo del PRL-3 PRL-3-interagenti, ma non da wild type, è stato confermato da PRL-3 trattamento inibitore in modo dose-dipendente [17]. Inoltre, antitumorale efficacia di PRL-3 trattamento inibitore ha anche mostrato di essere simile a quella del trattamento siRNA in cancro esofageo o cancro del colon [11, 17].
Di 173 fissati in formalina, inclusi in paraffina, campioni di tessuto serie in cui abbiamo precedentemente valutato PRL-3 stato espressione utilizzando colorazione immunoistochimica (IHC) in GC [6], 77 abbinati coppie di tessuti tumorali primarie e tessuti mucosa normale corrispondenti stati scelti a caso da pazienti con stadi differenziali in base al 13 edizione della Classificazione giapponese di gastrico Carcinoma (JCGC) [18]; 40 coppie con positivo PRL-3 espressione (10 pazienti in stadio I, 10 nella seconda, 10 nella III, e 10 in IV) e 37 coppie con espressione negativa (10 pazienti in stadio I, 10 in II, 9 a III, e 8 in IV). Tutti i pazienti sono stati sottoposti a gastrectomia secondo le linee guida di trattamento del cancro gastrico in Giappone [19], e gli esami istopatologici sono state fatte in base alla JCGC. Il 6 a edizione della Union Against Cancer (UICC) /TNM classificazione è stata utilizzata anche [20]. La tabella 1 illustra le informazioni dettagliate su 77 pazienti. Tutti i campioni di tessuto sono stati raccolti presso l'Ospedale Kitasato University e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti. Il presente studio è stato approvato dal Comitato Etico della Kitasato University.Table 1 Correlazione tra l'amplificazione PRL-3 gene e variabili clinico-in 77 pazienti con cancro gastrico


PRL-3 amplificazione genica

Variabili
numero totale
negatività
positività
p valore


Numero
(%)

Numero
(%)

PRL-3 espressione
0.006
negatività
37
37
(100 )
0 (0)
positività
40
32
(80) Pagina 8
(20)
Età (anni)
0,726
< 60
34
30
(88) 4
(12)
≥60
43
39
(91)
4
(9)
genere
0,710
Maschio
51
45
(88)
6
(12)
femminile
26
24
(92) 2
(8)
linfatico permeazione
0,343
Assenza
15
15
(100)
0
(0)
Presenza
62
54
(87) Pagina 8
(13)
vascolare permeazione
0,263
assenza
25
24
(96)
1 (4) Presenza

52
45
(87) 7
(13)
Differenziazione
0,134
Bene e moderata
31
30
(97)
1 (3)
Poor
46
39
(85) 7
(15)
profondità dell'invasione
0.006 *
T1 (m sm)
15
15
(100)
0
(0)
T2 (mp e ss)
35
33
(94) 2
(6)
T3 (SE)
19
16
(84) 3
(16)
T4 (SI) Pagina 8
5
(63)
3
(38)
metastasi linfonodali
0,022
Assenza
29
29
(100)
0
(0)
Presenza
48
40
(83) Pagina 8
(17)
JCGC stato dei linfonodi †
0,004 *
N0
29
29
(100)
0
(0)
N1
21
20
(95)
1 (5)
N2
20
14
(70)
6
(30)
N3 e linfonodi distanti 7
6
(86)
1 (14)
UICC linfonodo stato ‡
0,002 *
N0
29
29
(100)
0
(0)
N1
18
17
(94)
1 (6)
N2
16
13
(81) 3
(19)
N3 e linfonodi distanti
14 10
(71) 4
(29)
JCGC fase
0.005 *
I (IA e IB )
20
20
(100)
0
(0)
II
20
20
(100)
0
(0)
III (IIIA e IIIB)
19
15
(79) 4
(21)
IV
18
14
(78) 4
(22)
UICC fase
0.003 *
I (IA e IB)
21
21
(100)
0
(0)
II
20
20
(100)
0
(0)
III (IIIA e IIIB)
16
13
(81) 3
(19)
IV
20
15
(75)
5
(25)
fluorescenza analisi di ibridazione in situ
ibridazione in situ fluorescente (FISH) analisi è stata effettuata, come descritto in precedenza [11]. PRL-3
è localizzato sul cromosoma 8q24.3 (numero di accesso GenBank NT 000.008,9), e la sonda centromeric cromosoma 8 è stato utilizzato per stimare il numero di copie. Poiché gli algoritmi di punteggio PRL-3
pesce non erano stati standardizzati, la valutazione si è basata sui criteri di HER2
[21]. Per ogni campione, sono stati segnati almeno 60 cellule tumorali. Positive PRL-3
amplificazione genomico è stato definito come un rapporto di PRL-3
al cromosoma 8 centromero più di 2,2, e negativo era il rapporto inferiore a 1,8. Se il rapporto di PRL-3
al cromosoma 8 centromero era di 1,8 a 2.2, celle aggiuntive sono state contate, e il rapporto di oltre 2.0 è stato finalmente considerati positivi [21]. Polisomia è stata definita come la media cromosoma 8 segnali centromeriche più di 3,0 per nucleo [22].
Quantitativa-genomica PCR
Le sezioni di tessuto dal tumore e il corrispondente mucosa normale, ottenuto almeno 5 cm dal bordo del tumore, sono stati acutamente sezionato in ematossilina e eosina diapositive macchiati, e il DNA genomico è stato successivamente estratto utilizzando un kit di QIAamp DNA FFPE (Qiagen, Hilden Sciences). Quantitative-genomica reazione a catena della polimerasi (Q-PCR) è stata effettuata per quantificare PRL 3-
numero di copie del gene utilizzando iQ ™ Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) in triplice copia sul iCycler iQ ™ Real-Time PCR Detection sistema (Bio-Rad). Per normalizzare PRL-3 numero
copia del gene per cella, ADAM metallopeptidasi dominio 2 (ADAM2
, NT 923.907,1), localizzato sul cromosoma 8p11.2, è stato utilizzato come riferimento endogena perché amplificazione del gene è definito come una copia numero aumento di una regione ristretta di un braccio cromosomico [10]. I valori ΔCt sono stati calcolati come Ct (PRL-3
) -Ct (ADAM2
) per ogni campione. numero di copie relativo è stato determinato come 2 - ΔΔ Ct, dove ΔΔC t = ΔC t (tumore) -ΔC t (corrispondente normale) [23]. Gli aumenti di relativa superiore a 2 volte al corrispondente normale sono stati considerati come amplificazione genomica. file aggiuntivo 1 raffigura dettagliate condizioni di PCR e sequenze di primer e della sonda utilizzato nel presente studio.
Western blotting
lisati cellulari interi sono stati estratti in tampone RIPA (Pierce, Rockford, IL) supplementato con 10 microlitri /ml Halt ™ inibitore della proteasi Kit da cocktail (Pierce) e Halt ™ Kit Cocktail fosfatasi inibitore (Pierce), e la proteina sono stati separati su NuPAGE ® 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) secondo il protocollo del produttore. Sia il rilevamento e la quantificazione delle proteine ​​specifiche sono state effettuate utilizzando ATTO catturano la luce (ATTO Corporation, Tokyo, Giappone). Due linee di cellule di cancro del colon-retto DLD-1 e SW480 cellule (RIKEN Bioresource) sono stati utilizzati come controlli bassa e alta espressione, rispettivamente, come descritto in precedenza [11]
PRL-3 anticorpo monoclonale del mouse (R &. D Systems, Minneapolis , MN) e anticorpo monoclonale murino β-actina (Sigma, St. Louis, MO) sono stati utilizzati come descritto in precedenza [11].
PRL-3 small interfering RNA trasfezione
Le cellule sono state trasfettate con 1 mmol /L Accell SmartPool, siRNA-PRL-3 (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) miscelato con Accell siRNA consegna media (Thermo Fisher Scientific) secondo il Thermo Scientific Dharmacon ® Accell ™ siRNA protocollo di consegna [24]. Il Pool Accell non-targeting (siRNA-CTR) e Accell siRNA consegna media solo sono stati utilizzati come controllo per gli effetti specifici del non-sequenza e come un mock-trattamento, rispettivamente.
Ancoraggio-indipendente saggio di formazione di colonie
Anchorage-indipendenti crescita cellulare è stata analizzata dalla placcatura 0,36% agarosio superiore (Bacto ™ Agar, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) contenente 1 × 10 5 cellule su una superficie di 0,72% agarosio inferiore a 6-bene piastre [11]. Le cellule sono state alimentate dal settimanale sovrastante soluzione soft-agar fresca, e le colonie sono stati fotografati dopo 2 settimane di incubazione. La concentrazione efficace al 50% (CE 50) valore della PRL-3 trattamento inibitore è stato calcolato sulla base della misurazione del conteggio delle colonie. Saggio
proliferazione e il dosaggio di invasione
Il saggio di proliferazione è stata effettuata utilizzando Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System (Takara Bio, Tokyo). Le cellule (2 × 10 3) sono state seminate in 96 pozzetti, e l'attività proliferativa è stata misurata mediante assorbimento a 450 nm nei giorni di prelievo designati. La sensibilità di PRL-3 inibitore sulla antiproliferation è stato determinato utilizzando la concentrazione inibitoria del 50% (IC 50) valore dopo il trattamento per 72 ore.
Il saggio di invasione è stata eseguita in 24 pozzetti BD BIOCOAT ™ Matrigel ™ Invasion camera (BD Biosciences Discovery Labware, Bedford, MA). Le cellule che avevano invaso attraverso la membrana sono state contate in quattro campi separati per pozzetto. Entrambi gli esperimenti sono stati fatti in triplicato.
Apoptosis Assays
saggi di apoptosi sono state eseguite utilizzando Guava PCA System (Guava Technologies, Inc., Hayward, CA). Le cellule (2 × 10 5) sono stati trattati con il PRL-3 inibitore alla concentrazione indicata in media supplementare con il 1,0% FBS per 72 ore, poi macchiato di annessina V e 7-AAD (Guava Nexin reagente). L'esperimento è stato fatto in triplice copia e analizzati utilizzando il software CytoSoft 2.1.5 (Guava Technologies)
. Analisi statistica
test esatto di Fisher, oppure il Mann-Whitney U-test
è stato utilizzato per analizzare statisticamente il rapporto tra PRL-3 di amplificazione genica
e variabili clinico-patologiche. analisi della varianza ad una via (ANOVA) con test post-hoc è stato utilizzato per confrontare tra i tre gruppi per il trattamento siRNA (siRNA-PRL-3, siRNA-ctr, e finto). test t di Student
stato utilizzato per valutare effetto terapeutico per le singole concentrazioni di PRL-3 inibitore, rispetto allo 0 mmol /L di PRL-3 inibitore. Il metodo di Kaplan-Meier è stato utilizzato per stimare i tassi di sopravvivenza cumulativi, e le differenze nei tassi di sopravvivenza sono stati valutati con l'uso del log-rank test. Tutti i decessi di pazienti erano correlate al cancro, e la sopravvivenza specifica malattia (DSS) è stata misurata a partire dalla data di intervento chirurgico per la data della morte o all'ultimo follow-up. P
< 0,05 è stato considerato per indicare la significatività statistica. Tutte le analisi statistiche sono state condotte con JMP software 7.0 (SAS Institute, Cary, NC).
Risultati
PRL-3 espressione e l'amplificazione genomica nelle linee di cellule di cancro gastrico
Inizialmente, PRL-3 stato espressione è stata valutata utilizzando western blotting in linee cellulari 8 GC (Figura 1A). PRL-3 espressione è stata osservata a un livello rilevabile in tutte le linee cellulari, tra cui 5 linee cellulari (KatoIII, H111, MKN7, MKN74, e cellule NUGC4) e 3 linee cellulari (GCIY, cellule AZ521 e SH10) esposto ad alta e relativamente bassa espressione, rispettivamente. Successivamente, l'analisi FISH è stata effettuata per verificare se PRL-3 espressione è stato causato attraverso la sua amplificazione genomica (Figura 1B). amplificazione genomica era ovviamente positivo in 2 linee di cellule (cellule MKN7 e MKN74) e negativo in 6 linee cellulari. 3 del sei erano dysomic (cellule AZ521, GCIY, e NUGC4), e tre erano polysomic (cellule KatoIII, SH10, e H111). PRL-3
amplificazione genomica frequente verificato nelle diverse regioni di cromosoma 8, cosiddetta inserimenti distribuiti, sulla metafase [10], ed era concorde con la sua elevata espressione. Figura 1 Espressione e status genetico di PRL-3 in linee cellulari 8GC. (A) livello di espressione di PRL-3 mediante western blotting. (B) analisi FISH in metafase di PRL-3
gene (verde). La sonda cromosoma 8 centromerica (arancione) è stato utilizzato per stimare il numero di copie.
Caratteristica di PRL-3
amplificazione genomica nei tumori gastrici primari umani
Nel nostro precedente studio, PRL-3 espressione è stata rilevata nel 95 (55%) di 173 CV primari da IHC [6]. Per esplorare il legame tra PRL-3 espressione e la sua amplificazione genomica, Q-PCR è stata effettuata sia per i 40 tumori con positivo PRL-3 espressione e 37 tumori con espressione negativa, che sono stati selezionati in modo casuale da stadi differenziali nei 173 tumori primari. Tutti i tumori primari senza PRL-3 espressione non sono stati amplificati, considerando 8 (20%) dei 40 tumori primari con PRL-3 espressione sono stati amplificati (Figura 2A). FISH analisi ha inoltre confermato evidente l'amplificazione genomica come l'alterazione cancro-specifica (Figura 2B), ed espone alla modello quasi omogeneo sia nella zona centrale e zona invasivo all'interno del tumore. Successivamente, il rapporto con i fattori clinico-patologici è stata valutata per il PRL-3
amplificazione genomica (Tabella 1), dove è stato significativamente associato non solo con la sua espressione (P
= 0.006), ma anche con profondità di invasione tumorale ( P
= 0.006), la presenza di LNM (P = 0.022
), lo stato LNM (P = 0.004
in JCGC, P = 0,002
in UICC), e la fase (P =
0.005 in JCGC, P = 0.003
in UICC). Inoltre, tutti i tumori primari con amplificazione genomica erano stadio III o IV della malattia (40%, 8/20). Inoltre, l'amplificazione genomica influenzato negativamente gli esiti dei pazienti con linfonodi positivi istologicamente (P = 0,021
, Figura 2C), anche se PRL-3 espressione non ha nelle nostre e di altre precedenti relazioni [6, 25]. Figura 2 Frequenza e prognosi di PRL-3 amplificazione genomica in 77 GC umana. (A) Frequenza di PRL-3
amplificazione genomica mediante Q-PCR in 77 GC umana. Q-PCR è stata effettuata sia per i 40 tumori con positivo PRL-3 espressione e 37 tumori con espressione negativa. Per normalizzare PRL-3 numero di copie del gene
per cella, ADAM2
, localizzato sul cromosoma 8p11.2, è stato utilizzato come riferimento endogeno. I valori ΔCt sono stati calcolati come Ct (PRL-3
) -Ct (ADAM2
) per ogni campione. numero di copie relativo è stato determinato come 2-ΔΔCt, dove ΔΔCt = ΔCt (tumore) -ΔCt (corrispondente normale). (B) Analisi Rappresentante FISH di PRL-3
gene in tumore primario e corrispondente normale (caso 82). curve (C) di Kaplan Meier su 5 anni DSS in base alla positività o negatività di PRL-3
amplificazione genomica nei pazienti con linfonodi positivi istologicamente. Le barre di errore, la deviazione standard (SD).
PRL-3 come un convergente terapeutica bersaglio
In GC, i ruoli funzionali di PRL-3, tra cui invasione e proliferazione abilità, sono stati documentati solo in SGC7901 cellule [25] . A conferma di queste proprietà metastatiche con 3 linee di cellule con diversi PRL-3 espressione e status genetico, knock-down di endogena PRL-3 espressione è stata eseguita utilizzando siRNA trasfezione; cellule AZ521 (bassa espressione e disomia), cellule H111 (alta espressione e polisomia), cellule MKN74 (alta espressione ed amplificazione genomica). Queste linee cellulari sono state trasfettate con siRNA-PRL-3 o siRNA-ctr, e Western Blotting mostrato la diminuzione del livello di PRL-3 proteina siRNA-PRL-3 celle, ma le cellule non siRNA-CTR, confrontati con le cellule mock-trattamento ( Figura 3A). Una delle caratteristiche importanti del fenotipo metastatico è supposto come la capacità di cellule tumorali di crescere in condizioni ancoraggio-indipendente [26], ma il coinvolgimento in PRL-3 rimane sconosciuto in GC. Tutte le cellule siRNA-PRL-3 hanno mostrato la diminuito in modo significativo le dimensioni e il numero di colonie, rispetto alle cellule siRNA-CTR o cellule mock-trattamento (figura 3b). Inoltre, in linea con le precedenti relazioni per altre linee cellulari GC [25, 27], abbiamo anche confermato che siRNA-PRL-3 celle hanno mostrato l'attività proliferativa significativamente inferiore (Figura 3C) e la capacità invasiva (Figura 3D). Figura 3 Inibizione di proprietà metastatico dopo trasfezione con siRNA in cellule con espressione. (A) Western Blotting 72 ore dopo la trasfezione. Il western blotting è stato anche quantificato. finto, il trattamento con il solo Accell siRNA consegna di media; ctr, il trattamento con siRNA-ctr; SI, il trattamento con siRNA-PRL-3. (B) saggi di formazione di colonie ancoraggio-indipendente. immagini rappresentative della formazione di colonie sulle cellule AZ521 sono stati mostrati in pannello superiore. Con mock-trattamento 1.0, la velocità relativa del numero delle colonie è stato mostrato nel pannello inferiore. Bar, 200 micron. (C) saggio di proliferazione. L'attività proliferativa delle cellule AZ521 su 1, 2, 3, 4, o 5 giorni dopo la transfezione (pannello superiore) e il tasso di proliferazione relativa sul 5 giorni dopo la transfezione (pannello inferiore) sono stati mostrati. dosaggio (D) Invasion. Le cellule sono state seminate in 4 giorni dopo la transfezione, e poi incubate per 22 ore. sono state mostrate le immagini rappresentative di cellule AZ521 (pannello superiore) e il tasso di invasivo relativa (pannello inferiore). Bar, 200 micron; *, P
< 0.05 da ANOVA con test post-hoc; barre di errore, SD
. Potenziale terapeutico di PRL-3 inibitore, 1-4-bromo-2-benzilidene rodanina
Per valutare il potenziale terapeutico ed esaminare un punto di riferimento che guida la risposta alla terapia PRL-3-mirati, abbiamo valutata l'attività antitumorale di PRL-3 inibitore, cellula-permeabile composto benzylidene rodanina [16], contro i 6 linee cellulari con diversi PRL-3 espressione e lo status genetico; GCIY e le cellule AZ521 (bassa espressione e disomia), cellule KatoIII (alta espressione e polisomia), cellule SH10 (bassa espressione e polisomia), cellule MKN7 e MKN74 (alta espressione ed amplificazione genomica). Le cellule sono state trattate con PRL-3 inibitore a concentrazioni comprese fra 0 e 50 mmol /l. PRL-3 inibitore mostrato dose e tempo-dipendente efficacia antiproliferativa su tutte le linee cellulari testate, a prescindere dalla diversa PRL-3 livelli di espressione e lo status genetico, e l'IC 50 valori di GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, MKN7 , e MKN74 cellule erano 26.77, 9.98, 24.26, 23.95, 22.29 e 9.45 mmol /L, rispettivamente (Figura 4A). cellule AZ521 e MKN74 erano più sensibili al PRL-3 trattamento inibitore rispetto alle cellule GCIY e MKN7 che sono stati classificati come i gruppi identici, in termini di espressione e di status genetico, rispettivamente. Vale a dire, lo stato genetico o l'espressione non è stata associata con la sensibilità delle cellule GC contro il PRL-3 inibitore. un'efficacia simile è stato mostrato in formazione di colonie ancoraggio-indipendente, e la CE 50 valori di GCIY, AZ521, SH10, e le cellule MKN74 erano 6.99, 9.52, 13.05, 9.09 mmol /L, rispettivamente (Figura 4B). cellule GCIY esposti inibizione più sensibile in contrasto con l'anti-proliferazione. Inoltre, questo inibitore anche robusta abrogato la capacità invasiva delle cellule GC (Figura 4C). Per caratterizzare ulteriormente l'efficacia antitumorale di PRL-3 trattamento inibitore, dosaggio apoptosi è stata eseguita (Figura 5A). Sebbene 1 mol /L dell'inibitore era insufficiente per indurre apoptosi oltre la linea di base (0 mmol /L), 10 mmol /L dell'inibitore robustamente causato l'apoptosi drastica su tutte le linee cellulari testate, dove c'erano 3 volte e 11-fold aumenta oltre la linea di base nelle cellule GCIY e MKN74 rispettivamente. Così, PRL-3 inibitore represso queste proprietà metastatiche su tutte le linee cellulari testate in modo dose-dipendente, e né livello di espressione né status genetico ha mostrato chiara correlazione con la sensibilità. Figura 4 attività antitumorale di PRL-3 inibitore. (A) saggio di proliferazione dopo trattamento con PRL-3 inibitore a concentrazioni comprese fra 0 e 50 mmol /L contro 6 linee cellulari con diversi PRL-3 espressione e status genetico. Con cellule trattate con la sola soluzione chimica (0 micromol /L PRL-3 inibitore) come 1.0, il tasso di proliferazione relativi a 5 giorni dopo il trattamento è stato mostrato nel pannello di sinistra. L'attività proliferativa delle cellule AZ521 su 1, 2, 3, o 4 giorni dopo il trattamento è stato mostrato nel pannello di destra. L, bassa espressione; H, alta espressione; D, disomia; P, polisomia; A, l'amplificazione; IC50, la concentrazione di inibizione al 50%. (B) saggi di formazione di colonie ancoraggio-indipendente. sono state mostrate le immagini rappresentative della formazione di colonie sulle cellule AZ521 (pannello superiore) e il relativo tasso di numero di colonie (pannello inferiore). Bar, 200 micron; CE50, la concentrazione effettiva del 50%. saggio (C) Invasion. sono state mostrate le immagini rappresentative (pannello superiore) e il tasso di invasivo relativa (pannello inferiore). Bar, 200 micron; *, P
< 0.05 da Student t test
, rispetto allo 0 mmol /L di PRL-3 inibitore; barre di errore, SD.
Figura 5 PRL-3 apoptosi inibitore-mediata. assay (A) L'apoptosi è stata eseguita 72 ore dopo il trattamento con PRL-3 inibitore (0 to 10 mmol /L). figure rappresentative di test apoptosi in cellule AZ521 e C2C12 sono stati mostrati in pannello di sinistra, e la percentuale e SD di apoptosi precoce (quadrante in basso a destra) e in ritardo l'apoptosi (quadrante in alto a destra) sono mostrati in ogni pannello. Con cellule trattate con la sola soluzione chimica (0 micromol /L PRL-3 inibitore) come 1.0, il tasso di apoptosi in ritardo relativo dopo il trattamento è stato mostrato nel pannello di destra. *, P
< 0.05 da Student t test
, rispetto allo 0 mmol /L di PRL-3 inibitore. (B) PRL-3 trattamento inibitore contro normali cellule C2C12 muscolo scheletrico. C2C12 esposti più basso livello di espressione di PRL-3 rispetto alle cellule di GC di western blotting. saggio di proliferazione dopo trattamento con PRL-3 inibitore è stata eseguita. Le barre di errore, SD.
Infine, abbiamo valutato se PRL-3 inibitore induceva citotossicità in normali muscoli scheletrici, dove PRL-3 è prevalentemente espresso [28]. Entrambi i saggi di proliferazione e apoptosi sono state eseguite utilizzando normali cellule C2C12 muscolo scheletrico trattati con l'inibitore, ed hanno mostrato che il 10 mmol /L dell'inibitore riuscito a causare antiproliferativa e risposta apoptotica in C2C12 in contrasto con i valori di efficacia su tutte le linee cellulari GC testati ( Figura 5A e 5B).
Discussione
come LNM è considerato come un importante fattore prognostico per GC [29], la ricerca delle molecole causali che riflettono LNM è una strada promettente per migliorare i risultati. Lo stretto legame di LNM con PRL-3 espressione, di conseguenza, ha un potenziale come un nuovo bersaglio terapeutico [6, 25]. Tuttavia, i criteri per la terapia PRL-3-targeting non sono stati stabiliti, ed è fondamentale per chiarire le caratteristiche di PRL-3
amplificazione genomica nei punti sia meccanicistici e terapeutici di vista, a causa della grande meccanismo della sua conseguente espressione e lo sviluppo del cancro [10]. Nel presente studio, offriamo gli indizi vitali per lo sviluppo di questa strategia terapeutica contro il GC.
Il rapporto tra PRL-3 espressione e la sua amplificazione genomica non sono mai stati esaminati finora. PRL-3
amplificazione genomica era concorde con il suo status di espressione in linee cellulari, ed è stato trovato nel 20% (8/40) tra i tumori primari umani con l'espressione, che erano tutti stadio III o IV della malattia (40%, 8 /20), ma in nessuno (0/37), tra quelli senza espressione. Inoltre, PRL-3
amplificazione genomica è stata associata con lo stato LNM, che porta alla fase avanzata e risultati così scarsi nei pazienti con LNM (P = 0,021)
. Così, PRL-3
amplificazione genomico può essere la modifica più rilevante per LNM, ed essere uno dei meccanismi predominanti inducono la sua espressione nella fase più avanzata. Tuttavia, la maggior parte dei tumori che esprimono PRL-3 non sono stati amplificati, soprattutto nella fase earler. Nel topo cellule di fibroblasti embrionali di tipo selvatico ma non p53 - /-, PRL-3 viene indotta in maniera p53-dipendente [30]. La mutazione p53 o perdita di funzionalità, tuttavia, è stato documentato in tutte le linee cellulari GC utilizzati nel presente studio, ad eccezione di NUGC4 cellule (il sito Web TP53, http:.. //P53 free fr /) , indicando che non vi è altro meccanismo indipendentemente dal percorso di p53. PRL-3 espressione è stato segnalato per essere regolato a livello trascrizionale da citochine mitogeni, come IL-6, IL-21, HGF o IGF-1 nelle linee di cellule di mieloma [24], o come TGF-β in linee cellulari di cancro del colon [ ,,,0],31]. Recentemente, proteine ​​Polyc-RNA-binding 1 (PCBP1) è stato identificato come un regolatore traduzionale di PRL-3 [32]. I meccanismi alternativi a livello trascrizionale o traduzionale possono essere coinvolti per regolare PRL-3 espressione.
Abbiamo anche confermato che il siRNA-mediata PRL-3 atterramento in modo significativo represso la proliferazione cellulare e l'invasione in linea con le precedenti relazioni per altre linee cellulari GC [25 , 27], ed inoltre per la prima volta rivelato il ridotto effetto di formazione di colonie in condizioni ancoraggio indipendente, sostiene che PRL-3 può essere attraente bersaglio terapeutico contro GC.

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