Terapevtski potencial PRL-3 ciljno usmerjenostjo in klinični pomen PRL-3 genomske pomnoževanje pri raku želodca

Terapevtski potencial PRL-3 ciljno usmerjenost in klinični pomen PRL-3
genomske ojačanje pri raku želodca
Abstract
Ozadje
fosfataze regeneriranje je jeter-3 (PRL-3) zasluženo pozornost kot odločilni molekulo v več korakih metastaz. V tej študiji smo pregledali mehanizme, ki urejajo PRL-3 izražanja, in ocenila klinični potencial PRL-3-ciljnega zdravljenja raka želodca v.
Metode
PRL-3 genomske pomnoževanje smo analizirali s pomočjo kvantitativne-polimerazo verigo reakcijo in /ali fluorescence in situ hibridizacijo v 77 primarnih želodčnih tumorjev. Aktivnost proti raku na PRL-3 inhibitor (1-4-bromo-2-benzi rhodanine) zdravljenja smo ocenili proti rakavih celic z različno genetsko in izražanja statusa.
Rezultati
PRL-3 genomske pomnoževanje je tesno skladnih z visoko raven njegove beljakovin izražanja v celičnih linijah, in je bilo v 20% (8/40) med človekovih primarnih tumorjev pri svojem izrazu, ki so bili vsi fazi III /IV bolezni (40%, 20/08), in pri nobenem (0 /37) med tistimi, brez izraza. Poleg tega je bil PRL-3 genomske pomnoževanje povezana z metastatskim statusa bezgavk, ki vodi k višji stopnji in tako slabih rezultatov pri bolnikih s bezgavkah metastaze (P
= 0,021). PRL-3 majhne interferenčne RNA odločno zatrl metastaznih lastnosti, vključno s celično proliferacijo, invazije, in oblikovanje kolonije pritrditve neodvisen. Čeprav ni bilo niti genomske ojačanje ne izraz stopnja PRL-3 odgovoren za občutljivost na PRL-3 zdravljenje z zaviralci, inhibitor pokazala odmerka odvisno učinkovitost proti raku, in izredno inducira apoptozo pri vseh testiranih celičnih linij z PRL-3 izražanja.
sklepi
Imamo prvič, je pokazala, da je PRL-3 genomske pomnoževanje eden izmed prevladujočih mehanizmov induciranje izražanju, zlasti v več fazi, in da je terapija usmerjena PRL-3-imajo lahko velik potencial proti raku želodca z izrazom.
Ključne besede
PRL-3 želodčni rak genomske ojačanje usmerjena terapija bezgavko Ozadje
raka želodca (GC) je četrti najpogostejši rak in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka na svetu [1 ]. Nedavne izboljšave v diagnostičnih orodij in metod, ki so olajšali odkrivanje zgodnjega GC in s tem odlično dolgoročno preživetje. Vendar pa so bolniki z napredovalo boleznijo ob diagnozi ostajajo slabe rezultate. Metastaze je večstopenjski proces, ki vključuje lokalne invazije, širjenje in ponovno vzpostavitev v oddaljene organe, in je glavni dejavnik umrljivosti [2]. Zato lahko boljše razumevanje metastaz odpreti pot do gostitelja inovativnih terapevtskih strategij v GC.
Protein tirozin fosfataze The (PTP) tvorijo veliko družino encimov, ki služijo kot glavne regulativne komponent v prenos signalov poteh [3] . V fosfataze za regeneracijo jeter (PRL-1, -2 in -3), ki pripadajo majhni skupini PTP naddružine, imajo edinstveno COOH-terminal prenylation motiv, ki je kritično vpliva na njihovo celično lokalizacijo in funkcijo [4]. PRL-3 je najprej ugotovil, da se specifično prekomerno izražen v jetrih metastazami, pridobljene iz kolorektalnega raka [5], nato je bila njena prekomerno dokumentirano v različnih vrst tumorjev, vključno z GC [6]. PRL-3 lahko spodbujajo raka invazijo, migracije, rast in angiogenezo, bodisi prek fosforilacijo, ki jo katalizira katalitične domene ali lokalizacije na plazemske membrane režiji COOH-terminal prenylation motiv [7-9]. Tako je PRL-3 zaslužila pozornosti kot ključni molekulo v več korakih metastaze in zato kot novo terapevtsko tarčo. Po drugi strani so mehanizmi za povzročanje PRL-3 ekspresije ni popolnoma pojasnjena. Pomnoževanje genomskih regij, ki vsebujejo onkogenov je glavni mehanizem njenega posledičnega prekomerno in razvoj raka, in ima zato pomembno za ciljno zdravljenje [10]. PRL-3
pomnožitev gena delno predstavlja čezmerni v debelem črevesu in požiralniku [5, 11]. Vendar pa je razmerje med genomske ojačanje in GC še vedno težko v tako mehaničnih in terapevtskih vidikov. V tej študiji smo analizirali značilnosti PRL-3
genomske ojačanja v GC, in nadalje ocenila klinični potencial PRL-3-ciljnega terapije.
Metode
Cell linije in tkiv Vzorci
GC celično linijo MKN7 smo sami pripravili iz celice Resource Center za biomedicinske raziskave inštituta za razvoj, staranje in rakava obolenja, Tohoku University (Sendai, Japonska). Sedem drugih GC celične linije (GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, H111, MKN74 in NUGC4) smo dobili od RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Japonska). Te celične linije zajemajo dve glavni vrsti GC [12], črevesnih tip (MKN7, MKN74, AZ521 in H111 celice) in razpršeno tipa (GCIY, KatoIII, SH10 in NUGC celice) [13-15]. MKN7, NUGC4 in AZ521 celice so bile določene z bezgavkah metastaze (LNM) in MKN74 celice so bile od metastaz jeter. KATOIII in GCIY celice so bile določene z metastatskim plevralni izliv in ascites, oz. H111 in SH10 celice so bile določene z ksenotransplantaciji. Normalne C2C12 celice skeletne mišice so bile kupljene od DS Pharma biomedicinsko Co, Ltd (Osaka, Japonska). AZ521 in C2C12 celice gojimo v DMEM mediju (GIBCO, Carlsbad, CA), dopolnjenem z 10% fetalni goveji serum (FBS). Druge celice gojimo v mediju RPMI1640 (GIBCO) z dodatkom 10% FBS. 1-4-bromo-2-benzi rhodanine je bila kupljena od Calbiochem Corp (San Diego, CA), ki je bila opredeljena kot PRL-3 inhibitor z visoko prepustnostjo presejalni s kemijsko knjižnico Koreja Chemical Bank, in zaviral PRL-3 fosfatazo [16]. Dejansko fosforilacije KRT8, PRL-3-interakcijo protein, ki ga katalitično neaktivno mutanta PRL-3 inducirano, vendar ne z divjim tipom, so potrdili PRL-3 zdravljenju inhibitorja na način, odvisen od doze [17]. Poleg tega je učinkovitost proti raku na PRL-3 zdravljenje z zaviralci je tudi pokazala, da je podobno kot pri zdravljenju siRNA v požiralniku raka ali kolorektalnega raka [11, 17].
Iz 173-formalinom določen,-parafinske vgrajeni, vzorce tkiva serije, kjer je smo že ocenili PRL-3 statusa izraz uporablja imunohistokemijsko (IHC) v GC [6], 77 ujema parov primarnih tumorskih tkiv in pripadajoče normalne sluznice tkiva je bilo naključno izbranih bolnikih z diferencialno stopnjah glede na 13 th izdaja japonske klasifikacije želodca karcinomom (JCGC) [18]; 40 parov s pozitivno PRL-3 izražanja (10 bolnikov v fazi I, 10 v II, 10 v III, in 10 v IV) in 37 parov z negativnim izražanja (10 bolnikov v fazi I, 10 v II, 9 v III, in 8 v IV). Vsi bolniki doživel želodca v skladu s smernicami želodca za zdravljenje raka na Japonskem [19], in histopatološka preiskave so bile izvedene v skladu z JCGC. Številka 6 th izdaji Mednarodnega proti raku unije (UICC) /je bila uporabljena tudi klasifikacija TNM [20]. Tabela 1 prikazuje podrobne informacije o 77 bolnikih. Vse vzorce tkiva so bili zbrani v Univerzitetni bolnišnici Kitasato, privolitev je bila pridobljena iz vseh bolnikih. Sedanja študija je odobril Odbor za etiko v Kitasato University.Table 1 Korelacija med PRL-3 genov pomnoževanje in clinicopathological spremenljivk pri 77 bolnikih z rakom želodca


PRL-3 gena pomnoževanje

spremenljivke
Skupno število
negativnost
pozitivnosti
p
vrednost


Število
(%)

Število
(%)

PRL-3 izraz
0,006
negativnost
37
37
(100 )
0
(0)
pozitivnosti
40
32
(80)
8
(20)
Starost (leta)
0.726
< 60
34
30
(88)
4
(12)
≥60
43
39
(91)
4
(9)
Spol
0,710
Male
51
45
(88)
6
(12)
Moški
26
24
(92)
2
(8)
Limfna prepustnost
0,343
Odsotnost
15
15
(100)
0
(0)
prisotnosti
62
54
(87)
8
(13)
žilno prepustnost
0.263
odsotnost
25
24
(96)
1
(4)
prisotnosti
52
45
(87)
7
(13)
diferenciacija
0,134
No in zmerno
31
30
(97)
1
(3)
Poor
46
39
(85)
7
(15)
Globina invazije
0,006 *
T1 (m in sm)
15
15
(100)
0
(0)
T2 (mp in ss)
35
33
(94)
2
(6)
T3 (se)
19
16
(84)
3
(16)
T4 (si)
8
5
(63)
3
(38)
limfnega vozla metastaze
0,022
Odsotnost
29
29
(100)
0
(0)
prisotnost
48
40
(83)
8
(17)
JCGC stanje bezgavk †
0,004 *
N0
29
29
(100)
0
(0)
N1
21
20
(95)
1
(5)
N2
20
14
(70)
6
(30)
N3 in oddaljene bezgavke
7
6
(86)
1
(14)
UICC limfnega vozla stanja ‡
0,002 *
n0
29
29
(100)
0
(0)
N1
18
17
(94)
1
(6)
N2
16
13
(81)
3
(19)
N3 in oddaljene bezgavke
14
10
(71)
4
(29)
JCGC fazi
0,005 *
I (IA in IB )
20
20
(100)
0
(0)
II
20
20
(100)
0
(0)
III (IIIA in IIIB)
19
15
(79)
4
(21)
IV
18
14
(78)
4
(22)
UICC faza
0,003 *
I (IA in IB)
21
21
(100)
0
(0)
II
20
20
(100)
0
(0)
III (IIIA in IIIB)
16
13
(81)
3
(19)
IV
20
15
(75)
5
(25)
fluorescence situ analizi hibridizacije
fluorescence in situ hibridizacija je (FISH) analiza je bila opravljena, kot je bilo prej [11] opisano. PRL-3
se nahaja na kromosom 8q24.3 (GenBank pristopno številko NT 000.008,9) in kromosom 8 centromerne sonda je bila uporabljena za oceno števila kopij. Ker so algoritmi točkovanja PRL-3
FISH ni standardiziran, je bila ocena, ki temelji na merilih HER2
[21]. Za vsak vzorec, smo dosegel najmanj 60 rakave celice. Pozitiven PRL-3
genomske pomnoževanja je definirana kot razmerje med PRL-3
na kromosomu 8 Centromera več kot 2,2 in negativno bilo razmerje manj kot 1,8. Če je razmerje PRL-3
na kromosomu 8 centromero 1.8 do 2.2, so bili prešteti dodatne celice, in razmerje več kot 2,0 bil končno šteje kot pozitivno [21]. Polysomy je bil opredeljen kot srednji kromosoma 8 centromerne signale več kot 3,0 na jedru [22].
Kvantitativna-genomske PCR
tkiva odsekov iz tumorja in ustrezno normalno sluznico, pridobljenih vsaj 5 cm od roba tumorja, so bili močno razrezali na hematoksilinom in-eozin obarvajo diapozitivov in genomske DNA smo nato ekstrahirali s pomočjo iz QIAamp DNA FFPE Kit (Qiagen vede, Hilden). Kvantitativno-genomske verižna reakcija s polimerazo (Q-PCR) je bila izvedena za količinsko PRL-3
genskih število kopij z uporabo iQ ™ Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), v treh izvodih na iCycler iQ ™ realnem času odkrivanje PCR sistem (Bio-Rad). Normalizirati PRL-3
genov število kopij na celico, ADAM metalopeptidazno domeno 2 (ADAM2
, NT 923.907,1), ki se nahaja na kromosomu 8p11.2 je bil uporabljen kot endogeni referenca, ker je ta pomnožitev gena opredeljeno kot kopija število povečanje regiji kromosoma roke [10] omejitvami. Vrednosti ΔCt so bile izračunane kot Ct (PRL-3
) -Ct (ADAM2
) za vsak vzorec. Relativno število kopij je bil določen kot 2 - ΔΔ Ct, kjer ΔΔC t = ΔC t (tumor) -ΔC t (kar ustreza normalni) [23]. Povečanja več kot 2-krat v primerjavi z istim normalno je štelo, da genomske ojačanja. Dodatna datoteka 1 prikazuje podroben stanje in sekvence primerjem in sondo PCR uporabili v tej raziskavi.
Western blotting
Celi lizate celičnih bili pridobljeni v RIPA pufra (Pierce, Rockford, IL), dopolnjenem z 10 ml /ml zaustaviti ™ proteaze Inhibitor cocktail Kit (Pierce) in zaustaviti ™ Fosfataza zaviralcem cocktail Kit (Pierce), in beljakovino ločimo na NuPAGE ® 4-12% bis-Tris Gel (Invitrogen) po protokolu proizvajalca. Oba zaznavanje in količinsko posebnih proteinov smo izvedli s pomočjo ATTO luč Capture (ATTO Corporation, Tokio, Japonska). Dve kolorektalnega raka celične linije DLD-1 in SW480 celice (RIKEN Bioresource) so bili uporabljeni kot kontrole nizko in visoko izražanja, v tem zaporedju, kot je opisano prej [11]
PRL-3 miške monoklonsko protitelo (R &. D Systems, Minneapolis , MN) in β-aktina miške monoklonsko protitelo (Sigma, St. Louis, MO) smo uporabili kot je prej opisano [11].
PRL-3 mala interferenčna RNA transfekciji
Celice smo transficirali z 1 mol /L Accell SMARTpool, siRNA-PRL-3 (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO), v mešanici z Accell siRNA Delivery medije (Thermo Fisher Scientific), v skladu s termo znanstvenega Dharmacon ® Accell ™ siRNA Delivery protokola [24]. Pool Accell Non-ciljanje (siRNA-ctr) in Accell siRNA dostava Media so sami uporabljajo kot kontrola za non-sekvenčno specifičnih učinkov in kot modelno ravnanja oz.
Anchorage-samostojno oblikovanje kolonija Preskusno
sidrišče neodvisni celično rast je bila analizirana z nasaditvijo 0,36% zgornjo Agarozo (Bacto ™ Agar, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ), ki vsebuje 1 x 10 5 celic na površini 0,72% spodnjega agaroze v 6-dobro plošče [11]. Celice smo hranili tedensko ga prekriva svežo raztopino mehkega agarja in kolonije smo fotografirali po 2 tednih inkubacije. Vrednost 50% učinkovita koncentracija (ES 50) za PRL-3 zdravljenja z zaviralcem je bila izračunana na podlagi meritev števila kolonij.
orožja test in invazija test
bil proliferacije izvede z uporabo krmil WST-1 Cell orožja Vsebnost sistem (Takara Bio, Tokyo). Celice (2 x 10 3) smo zasejali v 96-dobro in proliferativna aktivnost smo izmerili z absorbanco pri 450 nm na določenih dnevih vzorčenja. Občutljivost na inhibitor PRL-3 na antiproliferation bila določena z uporabo 50% inhibitorno koncentracijo (IC 50) vrednost po zdravljenju 72 ur.
Invazijo test je bil izveden v 24-tudi BD BioCoat ™ Matrigelove ™ Invasion komoro (BD Biosciences Discovery Labware, Bedford, MA). Celice, ki so vdrli skozi membrano bili prešteti v štirih ločenih področjih, na vodnjaku. Oba eksperimente smo izvedli v treh izvodih.
Apoptoze testih
apoptoze teste smo izvedli s pomočjo Guava PCA sistem (guava Technologies, Inc., Hayward, CA). Celice (2 x 10 5) smo obdelali z zaviralcem PRL-3 na navedeni koncentraciji v srednji Dodatni z 1,0% FBS 72 ur, nato obarvamo z aneksinom V in 7-AAD (guave neksinom reagentu). Poskus smo izvedli v treh izvodih in analizirali z CytoSoft 2.1.5 programske opreme (guava Technologies).
Statistična analiza
Fisherjev test, ali Mann-Whitney U
-test je bila uporabljena za statistično analizo odnosa med PRL-3
pomnožitev gena in clinicopathological spremenljivke. Enosmerna analiza variance (ANOVA) s testom post-hoc smo uporabili za primerjavo med tremi skupinami za zdravljenje siRNA (siRNA-PRL-3, siRNA-CTR in mock). Studentov t
testu smo uporabili za oceno terapevtski učinek za posamezne koncentracije inhibitorja PRL-3, v primerjavi z 0 mol /L zaviralca PRL-3. Metoda Kaplan-Meier je bila uporabljena za ocenjevanje kumulativnih stopenj preživetja, in razlike v stopnjah preživetja so bile ocenjene z uporabo testa log-ranga. Vse smrti bolnikov je bilo povezanih z rakom, in specifično preživetje bolezni (DSS) je bila izmerjena od datuma operacije do dneva smrti ali od zadnjega spremljanja. P
< 0.05 se je štelo, da kažejo statistično značilna. Vse statistične analize so bile opravljene z JMP 7,0 programske opreme (SAS Institute, Cary, NC).
Rezultati
PRL-3 izražanja in genomske ojačanje v želodcu raka celičnih linijah
Sprva je bil ovrednoten PRL-3 Stanje izraz uporablja western blot v celičnih linijah 8 GC (slika 1A). PRL-3 izraz opazili na zaznavni ravni v vseh linij celic, med katerimi 5 celične linije (KatoIII, H111, MKN7, MKN74 in NUGC4 celice) in 3 celičnih linij (GCIY, AZ521 in SH10 celice) razstavljena visoka in relativno nizek izraz oz. Kasneje je bila analiza FISH izvedli preučiti, ali je PRL-3 izraz utrpela zaradi genomske ojačanja (slika 1B). Genomske ojačanje bil očitno pozitiven v 2 celičnih linijah (MKN7 in MKN74 celic) in negativen v 6 celičnih linijah. 3 od šestih so dysomic (AZ521, GCIY in NUGC4 celice), in trije so bili polisomske (KatoIII, SH10 in H111 celice). PRL-3
genomske ojačanje pogosto pojavila v različnih regijah iz kromosoma 8, tako imenovane porazdeljene vstavljanje, na metafazo [10], in je bilo skladnih z visoko ekspresijo. Slika 1 Ekspresija in genetski status PRL-3 v celičnih linijah 8GC. (A) Raven Izražanje PRL-3 z Western blotting-om. (B) Analiza FISH na metafazo od PRL-3
genov (zeleno). centromerne sonda kromosoma 8 (oranžne barve) je bila uporabljena za oceno števila kopij.
značilnost PRL-3
genomske ojačanje v primarnih želodčnih rakov človekovih
V naši prejšnji raziskavi, je PRL-3 izraz odkrili pri 95 (55%) od 173 primarnih GK z imunohistokemijo [6]. Raziskati povezave med PRL-3 izražanja in njeno genomske ojačanja, je Q-PCR izvedli za obe 40 tumorjev s pozitivnim PRL-3 izražanja in 37 tumorjev z negativno izražanja, ki so bili naključno izbrani iz diferencialnih stopenj v 173 primarnih tumorjev. Vsi primarni tumorji brez PRL-3 izražanja niso pomnožili, ker je bilo 8 (20%) od 40 primarnih tumorjev z PRL-3 izražanja ojačani (slika 2A). FISH analize potrjujejo tudi očitno genomsko ojačanje kot raka specifične spremembe (slika 2B), in razstavljena na skoraj homogen vzorec tako v osrednjem delu in invazivne območja znotraj tumorja. Pozneje je bil odnos z clinicopathological dejavnikov oceniti za PRL-3
genomske ojačanja (tabela 1), kjer je bilo bistveno povezano ne samo z izrazom (P
= 0,006), ampak tudi z globino tumorske invazije ( P
= 0,006), prisotnost LNM (P
= 0,022), LNM status (P
= 0,004 v JCGC, P
= 0,002 v UICC), in stopnja (P
= 0,005 na JCGC, P
= 0,003 v UICC). Poleg tega so bili vsi primarni tumorji so z genomsko pomnoževanju faza III ali IV bolezen (40%, 8/20). Poleg tega genomske pomnoževanje negativno vplivali na rezultate bolnikov s pozitivnimi bezgavkami histološko (P
= 0,021, slika 2C), čeprav PRL-3 izraz ni v naših in drugih prejšnjih poročilih [6, 25]. Slika 2 Pogostost in prognoza PRL-3 genomske pomnoževanje v 77 humanega GC. (A) Pogostost PRL-3
genomske ojačanje z uporabo Q-PCR pri 77 človeški GC. Q-PCR smo izvedli tako za 40 tumorjev s pozitivnim PRL-3 izražanja in 37 tumorjev z negativno izražanja. Normalizirati PRL-3
genov število kopij na celico, ADAM2
, ki se nahaja na kromosomu 8p11.2, je bila uporabljena kot endogene referenco. Vrednosti ΔCt so bile izračunane kot Ct (PRL-3
) -Ct (ADAM2
) za vsak vzorec. Relativno število kopij je bil določen kot 2-ΔΔCt, kjer ΔΔCt = ΔCt (tumor) -ΔCt (kar ustreza normalni). (B) Analiza predstavnik FISH od PRL-3
gena v primarnega tumorja in ustrezne normalno (primer 82). (C) Kaplan Meier krivulje 5 let DSS po pozitivnosti ali negativnosti PRL-3
genomske ojačanje pri bolnikih s pozitivnimi bezgavkami histološko. Napaka palice, standardni odklon (SD).
PRL-3 kot konvergentno terapevtski ciljno
in GC, funkcionalne vloge PRL-3, vključno z invazijo in orožja sposobnosti, so bili dokumentirani le v SGC7901 celic [25] . Za potrditev te metastaznih lastnosti s pomočjo 3 celičnih linij z različnimi PRL-3 izražanja in genetsko stanje, knock-down endogenega PRL-3 izražanja smo izvedli s pomočjo siRNA transfekciji; AZ521 celice (nizko izražanje in disomija), H111 celice (visoka izraz in polysomy), MKN74 celice (visoka izraz in genomske pomnoževanja). Te celične linije so transfekciji s siRNA-PRL-3 ali siRNA-CTR in western-blot pokazala zmanjšano stopnjo PRL-3 beljakovin v 3 siRNA-PRL celic, vendar ne siRNA-ctr celice, v primerjavi s celicami modelno zdravljenja ( slika 3A). Eden od pomembnih značilnost metastatskega fenotipa naj kot zmožnost rakavih celic za gojenje pod pritrdišč neodvisen od pogojev [26], vendar je sodelovanje v PRL-3 ostaja neznan v GC. Vse celice siRNA-PRL-3 je pokazala bistveno zmanjšal velikost in število kolonij, v primerjavi s siRNA-ctr celice ali celice mock-zdravljenja (slika 3b). Poleg tega je v skladu s prejšnjimi poročili za druge GC celičnih linij [25, 27], smo tudi potrdili, da siRNA-PRL-3 celice pokazala bistveno manj proliferativni aktivnosti (slika 3C) in invazivne sposobnosti (slika 3D). Slika 3 Zaviranje metastaznih lastnosti po transfekciji s siRNA v celicah z ekspresijo. (A) Western blot 72 ur po transfekciji. Zahodni blot je tudi izmeriti. mock, zdravljenje s samim Accell siRNA Delivery medije; ctr, zdravljenje z siRNA-CTR; si, zdravljenje z siRNA-PRL-3. (B) za sestavo kolonije teste Pritrdilne neodvisni. Reprezentativni slike tvorbe kolonij na AZ521 celic so bili prikazani v zgornjem delu okna. Z modelnim ravnanja kot 1,0, se je relativni delež števila kolonij je prikazano na spodnji plošči. Bari, 200 um. (C) orožja testom. Proliferativna aktivnost AZ521 celic za 1, 2, 3, 4 ali 5 dni po transfekciji (zgornji panel) in relativne proliferativno mero za 5 dni po transfekciji (spodnjega panela) so bili prikazani. (D) invazija testom. Celice zasejemo na 4 dni po transfekciji, nato inkubiramo 22 ur. so pokazale, reprezentativne slike AZ521 celic (zgornja slika) in relativna invazivno stopnji (spodnja slika). Bari, 200 mikrometrov; * P
< 0.05 s ANOVA s testom post-hoc; napak palice, SD.
terapevtski potencial PRL 3-inhibitor, 1-4-bromo-2-benzi rhodanine
Za oceno terapevtskega potenciala in preuči mejnik vodenje odziv na PRL-3-ciljano terapijo, smo ocenili aktivnost proti raku PRL 3-inhibitor, celic prepustne benzi rhodanine spojina [16], pred 6 celičnih linij z različnimi PRL-3 izražanja in genetske statusa; GCIY in AZ521 celice (nizko izražanje in disomija), KatoIII celice (visoka izraz in polysomy), SH10 celice (nizko izražanje in polysomy), MKN7 in MKN74 celice (visoka izraz in genomov pomnoževanja). Celice smo obdelali z zaviralcem PRL-3 pri koncentracijah v območju od 0 do 50 mol /L. PRL-3 inhibitor pokazala od odmerka in časovno odvisne antiproliferativno učinkovitost na vseh testiranih celičnih linij, ne glede na drugačne PRL-3 ravni izražanja in genetsko stanje, in IC 50 vrednosti GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, MKN7 so bile in MKN74 celice 26.77, 9.98, 24.26, 23.95, 22.29 in 9.45 mol /L, v tem zaporedju (slika 4A). AZ521 in MKN74 celice so bolj občutljive na PRL-3 zdravljenja z zaviralcem kot GCIY in MKN7 celice, ki so bili opredeljeni kot identičnih skupin v smislu izražanja in genetskega stanja oz. Namreč, genetski ali izraz stanja ni bila povezana z občutljivostjo GC celic proti zaviralcem PRL-3. Podobno je bila učinkovitost pokazala tvorbe pritrditve neodvisen kolonije v in EC 50 vrednosti GCIY, AZ521, SH10 in MKN74 celice so bile 6.99, 9.52, 13.05, 9.09 mol /L, v tem zaporedju (slika 4B). GCIY celice razstavljene bolj občutljive zaviranje v nasprotju z anti orožja. Poleg tega je ta inhibitor tudi robustni razveljavil invazivno sposobnost GC celic (slika 4c). Za nadaljnjo opredelitev učinkovitost proti raku PRL-3 zdravljenja z zaviralcem je apoptoza test izvedli (slika 5A). Čeprav je bil 1 mol /L inhibitorja ne zadostuje za indukcijo apoptoze presegajo izhodiščno (0 mol /L), 10 umol /L inhibitorja robustni povzročila drastično apoptozo na vseh testiranih celičnih linij, kjer je bilo 3-krat in 11-krat poveča nad izhodiščem v GCIY in MKN74 celic, oz. Tako inhibitor PRL-3 zatrta te metastaznih lastnosti na vseh testiranih linij celic v način, odvisen od odmerka, in ne na ravni izraza niti genetsko stanje je pokazala jasno zvezo z občutljivostjo. Slika 4 Anticancer aktivnost zaviralca PRL-3. (A) orožja testom po zdravljenju s PRL-3 inhibitor pri koncentraciji v območju od 0 do 50 mol /L proti 6 celičnih linij z različnimi PRL-3 izražanja in genskega stanja. S celicami, ki so se zdravili s kemično raztopino samega (0 mol /L zaviralca PRL-3) kot 1,0, je relativna proliferativni mera za 5 dni po obdelavi je prikazano na levi plošči. Proliferativna aktivnost AZ521 celic za 1, 2, 3 ali 4 dni po obdelavi je prikazano na desni strani zaslona. L nizko izražanje; H, visoka ekspresija; D, disomija; P, polysomy; A pomnoževanje; IC50, 50% zaviralni koncentraciji. (B) za sestavo kolonije teste Pritrdilne neodvisni. so pokazale, reprezentativne slike tvorjenja kolonij na AZ521 celic (zgornja slika) in relativni delež števila kolonij (spodnja slika). Bari, 200 mikrometrov; EC50, 50% učinkovita koncentracija. (C) invazija testom. so pokazale, reprezentativne slike (zgornja slika) in relativno invazivne stopnja (spodnja slika). Bari, 200 mikrometrov; * P
< 0,05 s Student testom t
, v primerjavi z 0 mol /L zaviralca PRL-3; napak palice, SD.
Slika 5 PRL-3-inhibitor posredovano apoptozo. (A) apoptoza test smo izvedli 72 ur po obdelavi z PRL-3 inhibitor (0-10 mol /L). Reprezentativni podatki apoptoze testom na AZ521 in C2C12 celic je bilo prikazano v levem podoknu, in odstotek in SD zgodnje apoptoze (spodaj desno kvadrant) in pozno apoptoze (zgoraj desno kvadrant), so prikazani v vsaki plošči. S celicami, ki so se zdravili s kemično raztopino samega (0 mol /L zaviralca PRL-3) kot 1,0, je relativno pozno stopnjo apoptoze po obdelavi je prikazano na desni strani zaslona. * P
< 0.05 s testom t
Student, v primerjavi z 0 mol /L zaviralca PRL-3. (B) PRL-3 zdravljenje inhibitor proti normalnih skeletnih mišic C2C12 celic. C2C12 celice razstavljena nižjo stopnjo ekspresije PRL-3 kot GC celic po zahodni blot. Proliferacijo testa po zdravljenju z zaviralcem PRL-3 smo izvedli. Napaka palice, SD.
koncu smo ocenili, ali inhibitor PRL-3 povzroča citotoksičnost v normalnem skeletne mišice, kjer je PRL-3 pretežno izražena [28]. Oba testa proliferacije in apoptosis smo izvedli ob uporabi običajnih C2C12 celic skeletnih mišic obdelane z zaviralcem in pokazali, da 10 mol /l inhibitorja ni povzročila antiproliferativno in apoptotske odziva na C2C12 v nasprotju s izkoristke pri vseh testiranih GC celičnih linij ( Slika 5a in 5b).
Razprava
Ker LNM se šteje kot pomemben prognostični dejavnik za GC [29], raziskave molekul povzročajo odražajo LNM je obetavna pot za izboljšanje rezultatov. Tesna povezava LNM z PRL-3 izražanja, zato ima potencial, da postane nov terapevtski cilj [6, 25]. Vendar pa še niso ugotovili merila za terapijo ciljno PRL-3, in je ključnega pomena za pojasnitev značilnosti PRL-3
genomske ojačanja v oba mehanizma delovanja in terapevtske vidika, zaradi velikega mehanizma njenega posledično izražanja in razvoj raka [10]. V tej študiji, nudimo vitalne namige za razvoj te terapevtske strategije za boj proti GC.
Razmerje med PRL-3 izražanja in njeno genomske ojačanje še nikoli doslej preučiti. PRL-3
genomske pomnoževanju bilo skladnih s statusom ekspresije v celičnih linijah, in je bilo v 20% (8/40) med človekovih primarnih tumorjev z izrazom, ki so bile vse faze III ali IV bolezni (40%, 8 /20), vendar v nobenem (0/37) med tistimi, brez izraza. Poleg tega je bil PRL-3
genomske ojačanje povezana s statusom LNM, kar vodi k višji stopnji in tako slabih rezultatov pri bolnikih s LNM (P
= 0,021). Tako lahko PRL-3
genomske ojačanja je bolj pomembna sprememba za LNM, in je ena glavnih mehanizmov za indukcijo izraža v bolj napredni fazi. Vendar je večina tumorjev, ki izražajo PRL-3 ni bilo pomnožili, zlasti v earler fazi. V mišjih embrionalnih fibroblastne celice z divjega tipa, vendar ne p53 - /-, PRL-3 je povzročil v p53-odvisen način [30]. P53 mutacija ali izguba funkcije, vendar pa je bila dokumentirana v vseh celičnih linijah GC, ki se uporabljajo v tej študiji, razen za NUGC4 celic (Na TP53 Spletna stran, http:.. //P53 fr prosto /) To kaže, da je drugi mehanizem neodvisno p53 poti. PRL-3 izraz so poročali, da se regulira na transkripcijski ravni mitogeno citokinov, kot so IL-6, IL-21, HGF ali IGF-1 pri mielomom celičnih linijah [24], ali TGF-P v debelo črevo rak celičnih linij [ ,,,0],31]. V zadnjem času je bilo PolyC-RNA-vezavni protein 1 (PCBP1) opredeljena kot translacijsko regulator PRL-3 [32]. Alternativni mehanizmi na transkripcijske in translacijske ravni lahko sodelujejo urediti PRL-3 izraza.
Tudi Potrdili smo, da siRNA posredovano PRL-3 rasklapanje močno potlačeno celično proliferacijo in invazijo v skladu s prejšnjimi poročili za druge GC celičnih linij [25 27], poleg tega pa je prvič razkril zmanjšani učinek tvorbe kolonij pod sidranja neodvisen od pogojev, ki podpirajo, da lahko PRL-3 privlačne terapevtski tarča proti GC.

• MicroRNA-645, up-urejena v človeški adencarcinoma želodčne požiralnika križišča, zavira apoptozo z usmerjanjem zaviralnih IFIT2
• Prognostični vpliv odkrivanju uspešnih krožijo tumorskih celic pri bolnikih z rakom želodca uporabo virusno sredstvo telomeraze specifične: bodoči study