Gydomasis potencialas PRL-3 nukreipimą ir klinikinė reikšmė PRL-3 genomo amplifikacijos skrandžio vėžio

Gydomasis potencialas PRL-3 tikslingumą ir klinikinė reikšmė PRL-3
genomo amplifikacijos skrandžio vėžio
tezės
Background pervežimas fosfatazės regeneruoti kepenų-3 (PRL-3) nusipelnė dėmesio kaip esminis molekulę kelis žingsnius nuo metastazių. Šioje studijoje, mes išnagrinėjome mechanizmus, reguliuojančius PRL-3 išraišką, ir įvertinti klinikinę potencialą PRL-3-tikslinio gydymo skrandžio vėžio.
Metodai
PRL-3 genomo amplifikacija buvo analizuojami naudojant kiekybinio-polimerazės grandinės reakcija ir /arba chromosomų dažymas 77 pirminių skrandžio navikų. Priešvėžinio aktyvumo PRL-3 inhibitoriumi (1-4-brom-2-benzilidenkamparas rhodanine) gydymui buvo tirtas su vėžio ląstelių su skirtingų genetinių ir ekspresijos būklė.
Rezultatai
PRL-3 genomo amplifikacija buvo glaudžiai sutinkantis su aukštos lygis jo baltymų raiškos ląstelių linijų ir buvo rastas tarp žmogaus pirminius navikus su savo išraiška, kuri buvo visi Stage 20% (8/40) III /IV liga (40%, 8/20), tačiau nė (0 /37) tarp tų, be išraiškos. Be to, PRL-3 genomo amplifikacija buvo susijęs su metastazavusiu limfmazgių būklę, todėl pažengęs ir taip prastos rezultatus pacientams, sergantiems limfmazgių metastazių (P
= 0,021). PRL-3 sirnr tvirtai represuoti neišplitusios savybės, įskaitant ląstelių proliferaciją, invazijos ir tvirtinimo nepriklausomas kolonijos formavimas. Nors nei PRL-3 genomo stiprinimas, nei išraiškos lygis buvo atsakingas už jautrumą PRL-3 inhibitorių gydymo inhibitorius pasireiškė nuo dozės priklausomą nuo vėžio veiksmingumą ir nepaprastai sukeltas apoptozę apie visų tirtų ląstelių linijų su PRL-3 išraiška.
išvados
Mes turime pirmą kartą, parodė, kad PRL-3 genominės amplifikacija yra vienas iš vyraujančių mechanizmų paskatinti savo išraiška, ypač daugiau pažengęs, ir kad PRL-3 nukreiptas gydymas gali turėti didelį potencialą prieš skrandžio vėžio su savo išraiška.
Raktiniai žodžiai
PRL-3 skrandžio vėžio genomo amplifikacija skirta terapija limfmazgis faktai
skrandžio vėžys (GC) yra ketvirtoji dažniausia vėžio ir antroji pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių visame pasaulyje [1 ]. Naujausi patobulinimai diagnostikos įrankius ir metodus, padėjo nustatyti ankstyvąsias GC ir taip puikiai ilgalaikiam išlikimui. Tačiau pacientams, sergantiems progresavusia liga tuo diagnozės nustatymo metu tebėra prastos rezultatus. Metastazės yra daugiapakopį procesą, įtraukiant vietos invazija, platinimas ir naujo sukūrimą į tolimus organus ir yra pagrindinis veiksnys, lemiantis mirtingumo [2]. Todėl geriau suprasti metastazių gali atverti kelią į terapiniais novatoriškų strategijų GC kompiuterio.
Baltymų tirozino fosfatazės (PTPs) sudaro didelę šeimą fermentų, kurie naudojami kaip pagrindiniai reguliavimo komponentų signalo perdavimo kelius [3] , Regeneruoti kepenis fosfatazės (PRL-1, -2, -3), priklausančių mažą klasės PTP superfamily, turi unikalią COOH terminalo prenylation motyvas, kuris kritiškai įtakos jų ląstelių lokalizavimą ir funkciją [4]. PRL-3 buvo pirma susieta su konkrečiai per-išreikštas kepenų metastazių, gautų iš gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio [5], ir vėliau jos raiškos užfiksuotas įvairių auglių tipų ir žiurkių, įskaitant GC [6]. PRL-3 gali skatinti vėžio invazijos, migracijos, augimo, bei angiogenezę, per abiejų dephosphorylation kad katalizuoja katalizinio domeno ar buvimo vietos plazminės membranos režisieriaus COOH terminalo prenylation motyvas [7-9]. Taigi, PRL-3 nusipelnė dėmesio kaip itin molekulės per kelis žingsnius nuo metastazių, todėl kaip naujos terapinės taikinį. Kita vertus, mechanizmai iniciavimo PRL-3 išraiška nėra visiškai aiškūs. Stiprinimas genomo regionuose, kuriuose yra onkogenų yra pagrindinis mechanizmas jos sukelto raiškos ir vėžio išsivystymo, todėl turi reikšmę tikslinių gydymo [10]. PRL-3
geno amplifikacija iš dalies sudaro į gaubtinės žarnos vėžio ir stemplės vėžio [5, 11] raiškos. Tačiau tarp genomo stiprinimas ir GC santykiai išlieka silpnas per tiek mechaninė, tiek terapinių požiūriais. Šiame tyrime mes išnagrinėjo PRL-3
genomo amplifikacijos savybes GC, ir toliau vertinamas klinikinių potencialą PRL-3-tikslingai terapija.
Metodai
ląstelių linijų ir audinių mėginių
GC ląstelių linija MKN7 buvo maloniai jei nuo ląstelės išteklių centro Biomedicininių tyrimų instituto plėtros, senėjimas ir vėžys, Tohoku universiteto (Sendai, Japonija). Kitas septynias GC ląstelių linijas (GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, H111, MKN74 ir NUGC4) buvo nupirkta iš RIKEN Bioresource centro (Ibaraki, Japonija). Šios ląstelių linijos apima du pagrindinius tipus GC [12], žarnyno tipas (MKN7, MKN74, AZ521 ir H111 ląstelės) ir pasklidųjų taršos tipas (GCIY, KatoIII, SH10, ir NUGC ląstelės) [13-15]. MKN7, NUGC4 ir AZ521 ląstelės buvo nustatytas nuo limfmazgių metastazių (LNM), ir MKN74 ląstelės buvo kepenų metastazių. KATOIII ir GCIY ląstelės buvo nustatytas nuo metastazavusiu pleuros ertmėje ir ascitu, atitinkamai. H111 ir SH10 ląstelės buvo nustatytas nuo ksenotransplantacijai. Normalus skeleto raumenų C2C12 ląstelės buvo įsigytas iš DS Pharma Biomedicininių Co, Ltd (Osaka, Japonija). AZ521 ir C2C12 ląstelės buvo auginamos DMEM terpėje (GIBCO, Carlsbad, CA), papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS). Kiti ląstelės buvo auginamos RPMI1640 terpės (Gibco), papildytoje su 10% FBS. 1-4-brom-2-benzilidenkamparas rhodanine buvo įsigytas iš CalBiochem Corp (San Diego, CA), kuri buvo nustatyta kaip PRL-3 inhibitorius per didelio pralaidumo patikrą naudojant cheminį biblioteką Korėja Chemical Bank ir slopinamas PRL-3 fosfatazės aktyvumą [16]. Iš tiesų, fosforilinimas KRT8, PRL-3-sąveikauja baltymą, sukeltas kataliziškai neaktyvaus mutantas pagal PRL-3, bet ne laukinio tipo, buvo patvirtinta PRL-3 inhibitorių gydymo priklausomai nuo dozės priklausomu būdu [17]. Be to, nuo vėžio veiksmingumas PRL-3 inhibitorių gydymo taip pat parodė, kad panašus į siRNA gydymo stemplės vėžio ar tiesiosios žarnos vėžiu [11, 17].
Iš 173 formalino fiksuotas, parafiną integruotas, audinio mėginiai serijos kur mes anksčiau įvertintas PRL-3 ekspresijos būklė naudojant imunohistocheminis dažymas (IHC) GC [6], 77 atitiko poros pirminių navikų audiniuose ir atitinkamas normalus gleivinė audiniai buvo atsitiktinai atrinkti pacientus, kuriems nustatytas diferencialinių etapais pagal 13 -asis leidimas Japonijos klasifikatoriaus Skrandžio vėžio (JCGC) [18]; 40 porų su teigiamu PRL-3 išraiška (10 pacientų iš I etapas, 10 II 10 III ir 10 IV) ir 37 porų su neigiamu išraiška (10 pacientų iš I etapo, 10 II, 9 III ir 8 IV). Visi pacientai patyrė pašalintas skrandis pagal skrandžio vėžio gydymo gairių Japonijoje [19], ir histopatologinis tyrimai buvo atlikti pagal JCGC. 6 -asis leidimas Tarptautinės Sąjungos kovos su vėžiu (UICC) /TNM klasifikacija taip pat buvo naudojama [20]. 1 lentelė vaizduoja išsamią informaciją apie 77 pacientų. Visi audinio mėginiai buvo surinkti tuo Kitasato universitetinės ligoninės, informavo sutikimas buvo gautas iš visų pacientų. Šis tyrimas patvirtino Etikos komiteto Kitasato University.Table 1 Koreliacija tarp PRL-3 geno amplifikacija ir klinikos kintamųjų 77 pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu


PRL-3 geno amplifikacijos

Kintamieji
viso skaičius
Negatyvumas
Pozityvumas
psl
vertė


Taškų
(%)

Taškų
(%)

PRL-3 išraiška
0,006
negatyvumo
37
37
(100 )
0
(0)
Pozityvumas
40
32
(80)
8
(20)
Amžius (metais)
0.726
< 60
34
30
(88)
4
(12)
≥60
43
39
(91)
4
(9)
Lytis
0.710
Vyras
51
45
(88)
6
(12)
Panelių
26
24
(92)
2
(8)
limfinės prasiskverbimas
0,343
nebuvimas
15
15
(100)
0
(0)
buvimas
62
54
(87)
8
(13)
kraujagyslių pralaidumo
0.263
Nėra
25
24
(96)
1
(4)
buvimas
52
45
(87)
7
(13)
diferencijavimas
0,134
gerai ir vidutinio
31
30
(97)
1 (3)
Prastas
46
39
(85)
7
(15)
invazijos gylis
0,006 *
T1 (m ir cm)
15
15
(100)
0
(0)
T2 (MP ir SS)
35
33
(94)
2
(6)
T3 (SE)
19
(84)
3

16 (16)
T4 (SI)
8
5
(63)
3
(38)
Limfmazgių metastazės
0,022 nebuvimas
29
29
(100)
0
(0)
Artumo
48
40
(83)
8
(17)
JCGC limfmazgių būklė †
0,004 *
N0
29
29
(100)
0
(0)
N1
21
20
(95)
1
(5)
N2
20
14
(70)
6
(30)
N3, ir tolimi limfmazgiai
7
6
(86)
1
(14)
UICC limfmazgių būklės ‡
0,002 *
N0
29
29
(100)
0
(0)
N1
18
17
(94)
1
(6)
N2
16
13
(81)
3
(19)
N3, ir tolimi limfmazgiai
14
10
(71)
4
(29)
JCGC etapo
0,005 *
aš (IA ir IB )
20
20
(100)
0
(0)
II
20
20
(100)
0
(0)
III (IIIA bei IIIB)
19
15
(79)
4
(21)
IV
18
14
(78)
4
(22)
UICC etapas
0,003 *
aš (IA ir IB)
21 21
(100)
0
(0)
II
20
20
(100)
0
(0)
III (IIIa ir IIIb)
16
13
(81)
3
(19)
IV
20
15
(75)
5
(25)
Fluorescencinis in situ hibridizacijos analizės
fluorescencijos in situ hibridizacijos (FISH) analizė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau [11]. PRL-3
įsikūręs chromosoma 8q24.3 (GenBank inventorinį numerį NT 000.008,9), o chromosoma 8 centromerinės zondas buvo naudojamas įvertinti kopijos numeris. Kadangi PRL-3
ŽUVIES balais algoritmai nebuvo standartizuotas, vertinimas buvo grindžiamas HER2
[21] nustatytus kriterijus. Kiekvienam mėginiui pelnė bent 60 vėžinės ląstelės. Teigiamas PRL-3
genomo amplifikacija buvo apibrėžiamas kaip PRL-3
santykis chromosomos 8 Centromera daugiau kaip 2,2, ir neigiamas buvo mažiau nei 1,8 santykis. Jei PRL-3
santykis su chromosomų 8 centromeros buvo 1,8 iki 2,2, papildomi ląstelės buvo skaičiuojamas, ir daugiau nei 2,0 santykis buvo pagaliau reiškia teigiamus [21]. Polysomy buvo apibrėžiamas kaip vidutinis chromosoma 8 centromerinės signalų daugiau nei 3,0 už branduolio [22].
Kiekybinis-genomo PGR
audinių skyriuose nuo naviko ir atitinkamą normalaus gleivinės, gautų ne mažiau kaip 5 cm nuo naviko krašto, buvo smarkiai išpjaustytų į hematoksilinu ir eozinas tamsintas skaidres, o vėliau genomo DNR buvo išskirta naudojant iš QIAamp DNR FFPE Kit (Qiagen mokslų Hilden). Kiekybinis-genomo polimerazės grandininė reakcija (K-PGR) buvo atliktas siekiant įvertinti PRL-3
genų kopijų skaičiaus naudojantis IQ ™ SUPERMIX (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) trimis egzemplioriais dėl iCycler iQ ™ Realaus laiko PGR aptikimas sistema (Bio-Rad). Normalizuoti PRL-3
genų kopijos numeris vienoje ląstelėje, Adomas metallopeptidase domeną 2 (ADAM2
, NT 923907,1), įsikūrusi chromosomos 8p11.2, buvo naudojamas kaip endogeninio nuoroda nes genų amplifikacija yra apibrėžiamas kaip kopija skaičius padidėjo ribotame regione chromosomos rankos [10]. ΔCt vertės apskaičiuotos kaip Ct (PRL-3
) -Ct (ADAM2
) už kiekvieną mėginį. Santykinis kopija skaičius buvo nustatyta kaip 2 - ΔΔ KT, kur ΔΔC T = ΔC T (navikas) -ΔC T (atitinka normalus) [23]. Daugiau nei 2 kartus, palyginti padidėja iki atitinkamo normalus buvo laikomi genomo stiprinimas. Papildoma failą 1 vaizduoja išsamią PGR būklę ir sekas gruntu ir Zondas, naudojamas šiame tyrime.
Imunoblotingu
Sveikos ląstelių fragmentai buvo išgauta Ripa buferis (Pierce, Rokfordas, Ilinojus) papildytas 10 įxL /ml Sustok ™ proteazės inhibitorius Kokteilių komplektas (Pierce) ir užkirsti kelią ™ fosfatazės inhibitoriumi Kokteilių rinkinį (Pierce) ir baltymų buvo atskirti nuo NuPAGE ® 4-12% bis-tri gelis (Invitrogen) pagal gamintojo protokolą. Tiek aptikimo ir kiekybinio įvertinimo iš specifinių baltymų buvo atliekama naudojant ATTO Šviesos Capture (ATTO Corporation, Tokijas, Japonija). Du kolorektalinio vėžio ląstelių linijas DLD-1 ir SW480 ląstelių (RIKEN Bioresource) buvo naudojamas kaip mažo ir didelio ekspresijos kontrolės, atitinkamai, kaip aprašyta anksčiau [11]
PRL-3 pelės monokloninis antikūnas (&. D Systems Mineapolis , MN) ir β-aktino pelės monokloninis antikūnas (Sigma, St. Louis, MO) buvo naudojamas kaip aprašyta anksčiau [11].
PRL-3 sirnr transfekcija
Ląstelės buvo transfekuota su 1 mkmol /L Accell SMARTpool, siRNR-PRL-3 ( "Thermo Fisher Scientific", Lafajetas, CO), sumaišyti su Accell siRNA Pristatymo Media (Thermo Fisher Scientific) pagal Thermo Scientific Dharmacon ® Accell ™ siRNA Pristatymo protokolo [24]. Accell Ne nukreipimą Baseinas (siRNR-PR) ir Accell siRNR Pristatymas Žiniasklaida vien buvo naudojamas kaip ne specifinės sekos poveikio kontrolės ir kaip maketas gydymui, atitinkamai.
Ankoridžas nepriklausomas kolonija formavimas Bandymo
Ankoridžas nepriklausomas ląstelių augimas buvo analizuojami dengimo 0,36% top agarozė (Bakto ™ Agaras, Becton, Dickinson and Company ", Franklinas ežerų NJ), kuriame yra 1 × 10 5 ląstelės ant 0,72% apatinio agarozės paviršiaus 6-gerai plokštės [11]. Ląstelės buvo šeriami savaitę iki overlying šviežios minkštos agar sprendimą ir kolonijos buvo nufotografuoti po 2 savaičių inkubacinio. 50% veiksminga koncentracija (EB 50) vertė PRL-3 inhibitorių gydymo buvo apskaičiuojamas remiantis kolonijas sudarančių vienetų skaičių matavimo.
Neplatinimo tyrimas ir invazija tyrimas Viesbutis The platinimu tyrimas buvo atliktas naudojant Pašaro WST-1 ląstelių proliferaciją Analizės sistema (Takara Biografija, Tokijas). Ląstelės (2 × 10 3) buvo pasėjamos 96-gerai, ir proliferacinis aktyvumas buvo matuojamas absorbciją prie 450 nm, naudojamos orlaivio mėginių ėmimo dienų. Jautrumas PRL-3 inhibitorių nuo antiproliferation buvo nustatomas naudojant 50% slopinanti koncentracija (SSD 50) vertė po gydymo 72 val.
Invazijos tyrimą buvo atlikta 24 šulinėlių BD BioCoat ™ Matrigel ™ invazija rūmai (BD biomokslai atradimas laboratory Bedford, MA). Ląstelių, kurios įsiveržė pro membraną buvo skaičiuojami keturių atskirtų laukais viename šulinio. Abu eksperimentai buvo atliekamas tris kartus.
Apoptozę tyrimai
apoptozę tyrimai buvo atliekami naudojant Guava PCA sistema (Guava Technologies, Inc, Hayward, CA). Ląstelės (2 × 10 5) buvo gydomi PRL-3 inhibitoriumi metu nurodytu koncentracija terpėje papildydama su 1,0% FBS 72 valandas, tada tamsintas su aneksinu ir 7-AAD (gvajavos Nexin reagentu). Eksperimentas buvo atliekamas tris kartus ir analizuojami naudojant CytoSoft 2.1.5 programinę įrangą (gvajavos technologijos).
Statistinė analizė
Fisher'io testą, arba Mann-Whitney U
-test buvo statistiškai analizuoti tarp santykius PRL-3
geno amplifikacija ir klinikos kintamieji. Vienpusis dispersinė analizė (ANOVA) su post-hoc testas buvo naudojamas palyginti tarp trijų grupių siRNA gydymo (siRNR-PRL-3, siRNA-PR, o maketas). Stjudent'ot
testas buvo naudojamas įvertinti terapinį poveikį atskirų koncentracijų PRL-3 inhibitorių, palyginti su 0 mkmol /l PRL-3 inhibitorius. Kaplan-Meier metodas buvo naudojamas siekiant įvertinti kaupiamąjį išgyvenimo ir skirtumai išgyvenimo buvo vertinami su log-rank testą naudojimui. Visi pacientai mirčių buvo vėžys susijusi ir specifinių ligos išgyvenamumas (DSS), buvo matuojama nuo operacijos dienos iki mirties dienos arba nuo paskutinio tolesnių. P
< 0,05 buvo laikomas rodo statistinį reikšmingumą. Visi statistinės analizės buvo atliktos su JMP 7,0 programinės įrangos (SAS Institute, Cary, NC).
Rezultatai
PRL-3 Saviraiškos ir genomo amplifikacijos skrandžio vėžio ląstelių linijų
pradžių PRL-3 ekspresijos būklė buvo vertinama naudojant imunoblotingu į 8 GC ląstelių linijas (1A pav.) PRL-3 išraiška buvo stebimas susekamo lygį visose ląstelių linijų, tarp kurių 5 ląstelių linijas (KatoIII, H111, MKN7, MKN74 ir NUGC4 ląstelių) ir 3 ląstelių linijas (GCIY, AZ521 ir SH10 ląstelių) eksponuojama didelė ir palyginti mažas išraiška, atitinkamai. Vėliau ŽUVYS analizė buvo atliekama siekiant patikrinti, ar PRL-3 išraiška sukėlė per savo genomo amplifikacijos (1B pav.) Genomo amplifikacija buvo akivaizdžiai teigiamas 2 ląstelių linijas (MKN7 ir MKN74 ląstelių) ir neigiamas 6 ląstelių linijų. 3 iš šešių buvo dysomic (AZ521, GCIY ir NUGC4 ląstelės) ir trys buvo polysomic (KatoIII, SH10, ir H111 ląstelės). PRL-3
genomo amplifikacijos dažnai įvyko įvairiuose regionuose nuo chromosomos 8, vadinamasis platinami intarpais, ant metafazėje [10], ir buvo sutinkantis su savo aukštos raiškos. 1 pav išraiška ir genetinės statusas PRL-3 dalyvavimo 8GC ląstelių linijų. (A), išraiška lygis PRL-3 Imunoblotingo metodu. (B) žuvų analizė metafazėje iš PRL-3
genų (žalia). Chromosomos 8 centromerinės zondas (oranžinė) buvo naudojama įvertinti kopijos numeris.
Charakteristika PRL-3
genomo amplifikacijos žmogaus pirminių skrandžio vėžio
Mūsų ankstesniame tyrime, PRL-3 išraiška buvo aptiktas 95 (55%) iš 173 pirminių gCS IHC [6]. Tirti tarp PRL-3 išraiškos ir jos genomo amplifikacijos nuorodą, K-PGR buvo atliekama tiek 40 auglių, turinčių teigiamą PRL-3 išraiškos ir 37 auglių neigiami išraiška, kuri buvo atsitiktinai parinkto iš diferencialinių etapais 173 pirminių navikų. Visi pirminiai navikai be PRL-3 išraiškos nebuvo papildytas, o 8 (20%) iš 40 pirminių navikų su PRL-3 išraiška buvo papildyta (2a pav). ŽUVYS analizė taip pat patvirtino akivaizdų genomo amplifikacija kaip vėžio konkretaus pakeitimo (2b pav) ir eksponuojami beveik vienodai modelio abiejose centrinėje zonoje ir viduje naviko invazinės srityje. Vėliau santykiai su klinikos veiksnių buvo įvertintas PRL-3 pervežimas genomo amplifikacijos (1 lentelė), kur jis buvo žymiai susijęs ne tik su jo išraiškos (p pervežimas = 0,006), tačiau taip pat su gylio naviko invazijos ( P
= 0,006), buvimas LNM (p
= 0,022), LNM statusas (p = 0,004
į JCGC, P
= 0,002 ir UICC) ir etapas (P
= 0,005 iš JCGC, P
= 0,003 ir UICC). Be to, visi pirminiai navikai genomo amplifikacijos buvo III ar IV stadijos liga (40%, 20/08). Be to, genomo amplifikacija neigiamai paveikė histologiškai limfmazgius pacientų rezultatus (p
= 0,021, 2c pav), nors PRL-3 išraiška nebuvo kituose mūsų ir ankstesnėse ataskaitose [6, 25]. 2 pav dažnis ir prognozė PRL-3 genomo amplifikacijos 77 žmonių GC. (A), dažnis PRL-3
genomo stiprinimas naudojant Q-PGR 77 žmonių GC. "Q-PGR buvo atliekama tiek 40 auglių, turinčių teigiamą PRL-3 išraiškos ir 37 auglių neigiami išraiška. Normalizuoti PRL-3
genų kopijos numeris vienoje ląstelėje, ADAM2
, įsikūręs ant chromosomos 8p11.2, buvo naudojamas kaip endogeninio nuoroda. ΔCt vertės apskaičiuotos kaip Ct (PRL-3
) -Ct (ADAM2
) už kiekvieną mėginį. Santykinis kopija skaičius buvo nustatytas kaip 2-ΔΔCt, kur ΔΔCt = ΔCt (navikas) -ΔCt (atitinka normalu). (B), atstovas ŽUVYS analizė PRL-3 pervežimas geno pirminio naviko ir atitinkamai normali (byla 82). (C) Kaplanas Meier kreivės 5 metų DSS pagal teigiamos ar negatyvumo iš PRL-3
genomo amplifikacijos su histologiškai limfmazgius pacientų. Klaida barai, standartinis nuokrypis (SD).
PRL-3 kaip linkmės terapinio tikslo
GC, funkciniai vaidmenys PRL-3, įskaitant invazija ir platinimo galimybes, nebuvo užfiksuota tik SGC7901 ląstelių [25] , Norėdami patvirtinti šiuos neišplitusios savybės naudojant 3 mobiliuosius linijos su skirtingais PRL-3 Saviraiškos ir genetinės statusą, trankyti-žemyn endogeninio PRL-3 išraiška buvo atliekama naudojant siRNA transfekcijq; AZ521 ląstelių (žemos raiškos ir disomy), H111 ląstelių (didelės raiškos ir polysomy), MKN74 ląstelių (aukštas išraiška ir genomo amplifikacijos). Šios ląstelių linijos buvo pernešta su siRNA-PRL-3 arba siRNA-PR ir imunoblotingu parodė lygis sumažėjo PRL-3 baltymo siRNA PRL-3 ląstelių, bet ne siRNR-CTR ląstelių, lyginant su maketas valymo ląstelių ( 3A pav.) Vienas iš svarbiausių charakteristika metastazavusiu fenotipo turėtų kaip vėžinių ląstelių sugebėjimą augti pagal tvirtinimo nepriklausomas sąlygas [26], bet ir PRL-3 dalyvavimas lieka nežinoma GC. Visi siRNR-PRL-3 ląstelės parodė dydis ir kolonijų skaičių gerokai sumažėjo, palyginti su siRNA-PR ląstelių arba maketas valymo ląstelių (3b pav.) Be to, atsižvelgiant į ankstesnes ataskaitas dėl kitų GC ląstelių linijų [25, 27], taip pat patvirtino, kad siRNR-PRL-3 ląstelės parodė žymiai mažiau dauginimosi veiklą (Fig.3C) ir invazinės galimybę (3D pav.) 3 pav slopinimas metastazavusiu savybių po transfekciją su siRNA ląstelėse su išraiška. (A), Imunoblotingo 72 valandas po to, kai transfekciją. Vakarų blottingu taip pat buvo įvertintas. maketas, gydymas Accell siRNA Pristatymo Media vien; PR, gydymas siRNA-SR; SI, gydymas siRNA-PRL-3. (B) Ankoridžas nepriklausomas kolonija formavimo tyrimai. Reprezentacinės nuotraukos kolonijos formavimuisi AZ521 ląstelių buvo parodyta viršutiniame tinklinio audeklo gabale. Su juoktis elgesio kaip 1,0, santykinis rodiklis kolonijos skaičius buvo parodyta apatiniame skydelyje. Barai, 200 mkm. (C) proliferacijos tyrimu. Proliferacinis aktyvumas AZ521 ląstelių dėl 1, 2, 3, 4, arba 5 dienų po to, kai transfekciją (viršutinio panelio) ir santykinio proliferacinės norma praėjus 5 dienoms po transfekcijos (iš apačios į skydelyje) buvo parodyta. (D), invazija tyrimas. Ląstelės buvo pasėjamos 4 dienų po to, kai transfekciją, ir tada inkubuojami 22 valandas. buvo parodyta Reprezentacinės nuotraukos AZ521 ląstelių (viršutiniame tinklinio audeklo gabale) ir santykinę invazinės normos (apačioje skydelio). Barai, 200 mkm; *, P
< 0,05 ANOVA su post-hoc testą; Klaida barai, SD.
Terapinės potencialas PRL-3 inhibitorių, 1-4-brom-2-benzilidenkamparas rhodanine
įvertinti terapinį potencialą ir orientyrą išnagrinėti pagrindinius reagavimo į PRL-3-tikslinės terapijos, mes įvertino vėžio aktyvumą PRL-3 inhibitorių, ląstelių pralaidi benzilidenkamparas rhodanine junginys [16], prieš 6 ląstelių linijų skirtingo PRL-3 saviraiškos ir genetinės statuso; GCIY ir AZ521 ląstelių (žemos raiškos ir disomy), KatoIII ląstelių (didelės raiškos ir polysomy), SH10 ląstelių (žemos raiškos ir polysomy), MKN7 ir MKN74 ląstelių (aukštas išraiška ir genomo amplifikacijos). Ląstelės buvo gydomi PRL-3 inhibitorių, kurio koncentracija svyruoja nuo 0 iki 50 mkmol /L. PRL-3 inhibitorius parodė dozės ir laiko priklauso proliferaciją veiksmingumą visų tirtų ląstelių linijas, nepriklausomai nuo skirtingos PRL-3 ekspresijos lygį ir genetinės statusą ir IC 50 vertės GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, MKN7 , ir MKN74 ląstelės buvo 26,77, 9,98, 24,26, 23,95, 22,29 ir 9,45 mkmol /l (atitinkamai 4A pav.) AZ521 ir MKN74 ląstelės buvo jautresni PRL-3 inhibitorių gydymo nei GCIY ir MKN7 ląstelių, kurios buvo priskiriamos identiškų grupių požiūriu išraiškos ir genetinės statusą, atitinkamai. Būtent, genetiniai ar ekspresijos būklė nebuvo susijęs su jautrumo GC ląstelių prieš PRL-3 inhibitorius. Panašus veiksmingumas buvo parodyta tvirtinimo nepriklausomas kolonijos formavimo ir EB 50 vertės GCIY, AZ521, SH10, ir MKN74 ląstelės buvo 6,99, 9,52, 13,05, 9,09 mkmol /l (atitinkamai 4B pav.) GCIY ląstelės eksponuojami jautresnis inhibicija priešingai anti-platinimu. Be to, šis inhibitorius, taip pat tvirtai panaikino invazinių gebėjimas GC ląstelių (4c paveikslą). Norėdami papildomai apibūdinti vėžio veiksmingumą PRL-3 inhibitorių gydymo, apoptozė tyrimas buvo atliktas (5a pav). Nors inhibitoriaus 1 mkmol /l buvo nepakankama, kad sukelti apoptozę už pradinio (0 mkmol /L), 10 mkmol /L inhibitoriaus tvirtai sukėlė drastiškas apoptozę apie visų tirtų ląstelių linijų, kur buvo 3 kartus ir 11 kartų padidėja kitus nei GCIY ir MKN74 ląstelių linijos, atitinkamai. Taigi, PRL-3 inhibitorius represuoti šių neišplitusios Ypatybės visų tirtų ląstelių linijų dozės priklausomu būdu, ir nei išraiška lygis, nei genetinis statusas parodė aiškią koreliaciją su jautrumu. 4 pav priešvėžinis aktyvumas PRL-3 inhibitorius. (A) proliferacijos tyrimu po gydymo su PRL-3 inhibitorių, kurio koncentracija svyruoja nuo 0 iki 50 mikromoliai /L prieš 6 ląstelių linijos su skirtingais PRL-3 išraiškos ir genų statusą. Su ląstelėmis gydomų vien chemijos tirpalo (0 mkmol /l PRL-3 inhibitoriumi) kaip 1,0, santykinis proliferacijos norma 5 dienas po gydymo buvo parodyta kairiajame skydelyje. Proliferacinis aktyvumas AZ521 ląstelių dėl 1, 2, 3, arba 4 dienas po gydymo buvo parodyta dešinės skydelyje. L, mažai išraiška; O, aukštos išraiška; D disomy; P polysomy; A, amplifikacija; IC50, 50% slopinanti koncentracija. (B) Ankoridžas nepriklausomas kolonija formavimo tyrimai. buvo parodyta Reprezentacinės nuotraukos kolonijos formavimuisi AZ521 ląstelių (viršutiniame tinklinio audeklo gabale) ir santykinio kolonijas numeriu (karteczka). Barai, 200 mkm; EC50, 50% veiksminga koncentracija. (C) invazija tyrimas. Reprezentacinės Paveikslėliai (viršutinio panelio), o santykinė invazinės norma (apačioje skydelis) buvo parodyta. Barai, 200 mkm; *, P
< 0,05 Student t pervežimas bandymo, palyginti su 0 mkmol /l PRL-3 inhibitorių; Klaida barai, SD.
5 paveikslas PRL-3 inhibitoriais tarpininkaujant apoptozę. (A), Apoptozę tyrimas buvo atliktas 72 valandas po gydymo su PRL-3 inhibitoriumi (0-10 mkmol /L). Reprezentacinės skaičiai apoptozės tyrimą apie AZ521 ir C2C12 ląstelių buvo parodyta kairiajame skydelyje, o procentais ir SD ankstyvo apoptozės (apačioje dešinėje kvadrantas) ir pabaigoje apoptozės (viršuje dešinėje kvadrantas) rodomi kiekvieno skydelio. Su ląstelėmis gydomų vien chemijos tirpalo (0 mkmol /l PRL-3 inhibitoriumi) kaip 1,0, santykinis vėlai apoptozė norma po gydymo buvo parodyta dešinėje skydelyje. *, P
< 0,05 Student t pervežimas bandymo, palyginti su 0 mkmol /l PRL-3 inhibitorius. (B), PRL-3 inhibitorius gydymas esant įprastiems skeleto raumenų C2C12 ląsteles. C2C12 ląstelės eksponuojami mažesnę raišką lygį PRL-3 nei GC ląstelėse Imunoblotingo. buvo atliktas neplatinimo tyrimas po gydymo PRL-3 inhibitorius. Klaida barai, SD.
Galiausiai, mes įvertinti, ar PRL-3 slopina sukeltą citotoksiškumo normaliai skeleto raumenų, kur PRL-3 daugiausiai išreiškė [28]. Abu proliferaciją ir Apoptozė tyrimai buvo atlikti taikant įprastines skeleto raumenų C2C12 ląsteles elgiamasi su inhibitoriumi, ir parodė, kad 10 mkmol /L inhibitoriaus nepavyko sukelti proliferaciją slopinančius ir Apoptozė atsakymą į C2C12 priešingai su veiksmingumas apie visų tirtų GC ląstelių linijas ( 5a ir 5b pav.)
Diskusijos
kaip LNM yra laikomas svarbiu prognostinis faktorius GC [29], moksliniai tyrimai iš priežastinių molekulių atspindinčių LNM yra perspektyvi alėja pagerinti rezultatus. Yra glaudžiai susiję LNM su PRL-3 išraiška, todėl turi potencialą kaip naują terapinį tikslą [6, 25]. Tačiau nebuvo nustatytos terapijai PRL-3 orientuojasi kriterijai, ir tai yra labai svarbu išaiškinti PRL-3
genomo amplifikacijos charakteristikas tiek mechaninė, tiek terapinių požiūriais, nes iš pagrindinių mechanizmo jos atsirandantys išraiška ir vėžio vystymąsi [10]. Šioje studijoje, siūlome gyvybinius įkalčiais dėl šio gydymo strategija prieš GC plėtrai.
Tarp PRL-3 išraiškos ir jos genomo amplifikacijos santykiai niekada nebuvo iki šiol ištirti. PRL-3
genomo amplifikacija buvo sutinkantis su ekspresijos būklė ląstelių linijas, ir buvo rastas tarp žmogaus pirminius navikus su išraiška, kuri buvo visa III arba IV stadijos liga 20% (8/40) (40%, 8 /20), tačiau nė (0/37) tarp tų be išraiškos. Be to, PRL-3
genomo amplifikacija buvo susijęs su LNM statuso, todėl pažengęs ir taip prastos rezultatus pacientams, sergantiems LNM (P
= 0,021). Taigi, PRL-3
genomo stiprinimas gali būti svarbesnis pokytis dėl LNM, ir būti viena vyraujančių mechanizmų skatinančiais jos išraišką daugiau pažengę. Tačiau dauguma navikų išreiškiantys PRL-3 nebuvo papildyta, ypač earler etape. Pelių embrioninėmis fibroblastus ląstelių su laukinio tipo, bet ne p53 - /-, PRL-3 yra sukeliama į p53 priklausomu būdu [30]. P53 mutacija arba nuostolius funkciją, tačiau buvo dokumentuoti visų GC ląstelių linijų, naudojamų šioje studijoje, išskyrus NUGC4 ląstelės (TP53 Svetainės http:.. //P53 FR nemokama /) tai rodo, kad ten yra kito mechanizmo nepriklausomai nuo p53 keliu. PRL-3 išraiška buvo pranešė, kad turi būti reguliuojama transkripcijos lygiu mitogeninę citokinų, tokių kaip IL-6, IL-21, HGF arba IGF-1 mieloma ląstelių linijų [24], arba kaip TGF- gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijų [ ,,,0],31]. Neseniai PolyC-RNR-surišantis baltymas 1 (PCBP1) buvo nustatyta, kad transliacijos reguliatorius PRL-3 [32]. Alternatyvios mechanizmai transkripcijos arba pritaikymo lygį gali dalyvauti reguliuoti PRL-3 išraiška.
Mes taip pat patvirtino, kad siRNR tarpininkaujant PRL-3 nokdaunas gerokai represuoti ląstelių proliferaciją ir invazija atitinka ankstesnėse ataskaitose kitų GC ląstelių linijų [25 , 27], ir be to, pirmą kartą atskleidė sumažinta poveikį kolonijas sudarančių vienetų formavimo pagal tvirtinimo-nepriklausomas sąlygomis, remti, kad PRL-3 gali būti patraukli Gydymo tikslas prieš GC.

• MicroRNA-645, iki reguliuojama žmogaus adencarcinoma skrandžio stemplės jungties, slopina apoptozę nukreipiant auglio slopinamojo IFIT2
• Prognostinė poveikis nustatant perspektyvias cirkuliuojančių vėžinių ląstelių skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, naudojant telomerazės konkretaus virusinio agentas: būsimasis study