Terapeutiske potensialet av PRL-3 målretting og kliniske betydningen av PRL-3 genomisk forsterkning i magekreft

Terapeutiske potensialet av PRL-3 målretting og kliniske betydningen av PRL-3
genomisk forsterkning i magekreft
Abstract
Bakgrunn
fosfatase regenerere leveren-3 (PRL-3) har fortjent oppmerksomhet som en avgjørende molekyl i flere trinn av metastasering. I denne studien undersøkte vi de mekanismene som regulerer PRL-tre uttrykk, og vurdert den kliniske potensialet i PRL-3-rettet behandling i magekreft.
Metoder
PRL-3 genomisk forsterkning ble analysert ved hjelp av kvantitativ-polymerase chain reaksjon og /eller fluorescens in situ hybridisering i 77 primær gastriske svulster. Anticancer aktivitet av PRL-3-inhibitor (1-4-brom-2-benzyliden rhodanin) behandling ble evaluert mot kreft celler med forskjellig genetisk og uttrykk status.
Resultater
PRL-3 genomisk amplifisering var nært overensstemmende med høy nivået av dets protein ekspresjon i cellelinjer, og ble funnet i 20% (8/40) blant humane primære tumorer med dets ekspresjon, som alle var stadium III /IV sykdom (40%, 8/20), men i ingen (0 /37) blant de uten uttrykk. I tillegg ble PRL-3 genomisk forsterkning i forbindelse med metastatisk lymfeknute status, noe som fører til avansert stadium og dermed dårlige resultater hos pasienter med lymfeknutemetastase (P
= 0,021). PRL-tre små interfererende RNA robust trykt metastatiske egenskaper, inkludert celleproliferasjon, invasjon, og forankringsuavhengig kolonidannelse. Selv om verken PRL-3 genomisk forsterkning eller uttrykk nivå var ansvarlig for følsomheten til PRL-3 hemmer behandling, hemmer viste doseavhengig kreft effekt, og bemerkelsesverdig indusert apoptose på alle de testede cellelinjer med PRL-tre uttrykk.
konklusjoner
Vi har for første gang, viste at PRL-3 genomisk forsterkning er en av de dominerende mekanismene indusere sitt uttrykk, spesielt i mer avansert stadium, og at PRL-3-rettet behandling kan ha et stort potensial mot magekreft med sitt uttrykk.
nøkkelord
PRL-3 magekreft genomisk forsterkning målrettet terapi lymfeknute Bakgrunn
mage~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den fjerde vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis [1 ]. Nylige forbedringer i diagnostiske verktøy og metoder har mulig deteksjon av tidlig GC og dermed utmerket langsiktig overlevelse. Imidlertid pasienter med fremskreden sykdom ved tidspunktet for diagnosen være dårlige resultater. Metastase er en flertrinns prosess, med lokal invasjon, formidling, og re-etablering i fjerne organer, og er den viktigste faktor for dødeligheten [2]. Derfor kan en bedre forståelse av metastaser åpne veien til en rekke nyskapende terapeutiske strategier i GC.
Den protein tyrosin fosfataser (PTP) danner en stor familie av enzymer som fungerer som viktige regulatoriske komponenter i signaloverføringsveier [3] . De fosfataser av regenerere leveren (PRL-1, -2 og -3), som tilhører en liten klasse av PTP super, har en unik COOH-terminal prenylation motiv, som kritisk påvirker deres cellulær lokalisering og funksjon [4]. PRL-3 ble først identifisert til å være spesifikt over-uttrykt i levermetastaser avledet fra kolorektal kreft [5], og deretter dets overekspresjon ble dokumentert i forskjellige tumortyper, inkludert GC [6]. PRL-3 kan fremme kreft invasjon, migrering, vekst, og angiogenese, enten gjennom defosforylering som katalyseres ved katalytisk domene eller lokalisering til plasmamembranen anvist av COOH-terminale prenylation motiv [7-9]. Således har PRL-3 fortjent oppmerksomhet som et viktig molekyl i flere trinn av metastase og derfor som en ny terapeutisk mål. På den annen side, er de mekanismene som induserer PRL-tre uttrykk ikke helt avklart. Forsterkning av genomiske områder som inneholder onkogener er den viktigste mekanisme for dens påfølgende overekspresjon og kreftutvikling, og har derfor betydning for målrettede terapier [10]. PRL-3
genamplifisering delvis står for overekspresjon i tykktarmskreft og spiserørskreft [5, 11]. Imidlertid gjenstår forholdet mellom genomisk forsterkning og GC unnvikende i både mekanistiske og terapeutiske synspunkter. I denne studien undersøkte vi de samme egenskapene av PRL-3
genomisk forsterkning i GC, og videre undersøkt klinisk potensialet i PRL-3-rettet behandling.
Metoder
cellelinjer og vevsprøver
GC cellelinje MKN7 ble vennlig levert fra celle~~POS=TRUNC Resource Center for Biomedical Research Institute of Development, aldring og kreft, Tohoku University (Sendai, Japan). Syv andre GC cellelinjer (GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, H111, MKN74, og NUGC4) ble kjøpt fra Riken Bioresource senter (Ibaraki, Japan). Disse cellelinjene dekke de to hovedtyper av GC [12], intestinal type (MKN7, MKN74, AZ521, og H111 celler) og diffuse typen (GCIY, KatoIII, SH10 og NUGC celler) [13-15]. MKN7, NUGC4, og AZ521 cellene ble etablert fra lymfeknutemetastase (LNM), og MKN74 celler fra levermetastaser. KATOIII og GCIY celler ble etablert fra metastatisk pleuravæske og ascites, henholdsvis. H111 og SH10 celler ble etablert fra xenotransplantasjon. Normal skjelettmuskel C2C12 celler ble kjøpt fra DS Pharma Biomedical Co., Ltd (Osaka, Japan). AZ521 og C2C12-celler ble dyrket i DMEM-medium (GIBCO, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS). De øvrige celler ble dyrket i RPMI1640 medium (GIBCO) supplert med 10% FBS. 1-4-brom-2-benzylidene Rhodanin ble kjøpt fra Calbiochem Corp (San Diego, CA), som ble identifisert som en PRL-3 hemmer gjennom høy gjennomstrømming screening ved hjelp av kjemisk bibliotek av Korea Chemical Bank, og hemmet PRL-3 fosfatase-aktivitet [16]. Faktisk, fosforylering av KRT8, PRL-3-veksel protein, indusert ved katalytisk inaktive mutant av PRL-3, men ikke av villtype, ble bekreftet ved PRL-3-inhibitor behandling på en doseavhengig måte [17]. Videre anticancer effekt av PRL-3-inhibitor behandling viste også å være lik den for siRNA behandling i spiserørskreft eller kolorektal kreft [11, 17].
Ut fra 173 formalinfiksert, parafin-innleiret, vevsprøver serie der vi tidligere vurdert PRL-tre uttrykk status ved hjelp av immunhistokjemisk farging (IHC) i GC [6], 77 matchet par av primær tumor vev og tilsvarende normal slimhinne vev ble tilfeldig valgt fra pasienter med differensialtrinn i henhold til 13 th edition av den japanske Klassifisering av magekarsinom (JCGC) [18]; 40 par med positiv PRL-tre uttrykk (10 pasienter i fase I, 10 i II, 10 i III, og 10 i IV) og 37 par med negative uttrykk (10 pasienter i fase I, 10 i II, 9 i III, og 8 i IV). Alle pasientene gjennomgikk gastrektomi henhold til mage kreft behandling retningslinjer i Japan [19], og histopatologiske undersøkelser ble gjort i henhold til JCGC. Den 6 th utgaven av International Union Against Cancer (UICC) /TNM klassifikasjon ble også brukt [20]. Tabell 1 viser den detaljerte informasjonen på 77 pasienter. Alle vevsprøver var samlet på Kitasato universitetssykehus, og informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Kitasato University.Table en korrelasjon mellom PRL-3 genamplifisering og clinicopathological variabler i 77 pasienter med magekreft


PRL-3 genamplifisering

variabler
Totalt antall
negativitet
Positivitet
p
verdi


Antall product: (%)

Antall product: (%)

PRL-tre uttrykk
0,006
negativitet
37
37 plakater (100 )
0 product: (0)
Positivitet
40
32 product: (80)
8 product: (20)
Alder (år)
0,726
< 60
34
30 product: (88)
4 product: (12)
≥60
43
39 product: (91)
fire plakater (9)
Kjønn
0,710
Mann fra 51
45 product: (88)
6 product: (12)
Kvinne
26
24 product: (92)
to plakater (8)
lymphatic gjennomtrengelighet
0,343
Fravær
15
15 plakater (100)
0 product: (0)
Presence
62
54 product: (87)
8 product: (13)
Vaskulær gjennomtrengelighet
0,263
fravær
25
24 product: (96)
1 (4)
Presence
52
45 product: (87)
7
(13)
Differensiering
0,134
Vel og moderat
31
30 product: (97)
1 (3)
Dårlig
46
39 plakater (85)
7 product: (15)
Dybde invasjon
0,006 *
T1 (m og sm)
15
15
(100)
0 product: (0)
T2 (mp og ss)
35
33 product: (94)
to plakater (6)
T3 (se)
19
16 product: (84)
3 product: (16)
T4 (si)
8
5 product: (63)
3 product: (38)
lymfeknutemetastaser
0,022
Fravær
29
29 product: (100)
0 product: (0)
Presence
48
40 product: (83)
8 product: (17)
JCGC lymfeknute status †
0,004 *
N0
29
29
(100)
0 product: (0)
N1
21
20 product: (95)
1 (5)
N2
20
14 product: (70)
6 product: (30)
N3 og fjerne lymfeknuter
7
6 product: (86)
1 (14)
UICC lymfeknute status ‡
0,002 *
N0
29
29 product: (100)
0 product: (0)
N1
18
17 product: (94)
1 (6)
N2
16
13 product: (81)
3 plakater (19)
N3 og fjerne lymfeknuter
14
10 product: (71)
4 product: (29)
JCGC scenen
0,005 *
I (IA og IB )
20
20 product: (100)
0 product: (0)
II
20
20 product: (100)
0
(0)
III (IIIA og IIIB)
19
15 product: (79)
4 product: (21)
IV
18
14
(78)
4 product: (22)
UICC scenen
0,003 *
I (IA og IB)
21
21 product: (100)
0 product: (0)
II
20
20 product: (100)
0 product: (0)
III (IIIA og IIIB)
16
13 product: (81)
3 product: (19)
IV
20
15 product: (75)
5 product: (25)
Fluorescence in situ hybridisering analyse
fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse ble utført som tidligere beskrevet [11]. PRL-3
er lokalisert på kromosom 8q24.3 (GenBank tilgangsnummer NT 000008,9), og kromosom 8 centromeric probe ble brukt for å estimere kopitallet. Fordi PRL-3
FISH scoring algoritmer ikke hadde blitt standardisert, ble vurdering basert på kriteriene for HER2 product: [21]. For hver prøve ble minst 60 kreftceller scoret. Positive PRL-3
genom-amplifikasjon ble definert som et forhold mellom PRL-3
til kromosom 8 cent mer enn 2,2, og negativ var forhold på mindre enn 1,8. Hvis forholdet av PRL-3
til kromosom 8 cent var 1,8 til 2,2, ble ytterligere celler tellet, og forholdet mellom mer enn 2,0 til slutt ble betraktet som positiv [21]. Polysomy ble definert som gjennomsnitts kromosom 8 centromeric signaler mer enn 3,0 per kjerne [22].
Kvantitativ-genomisk PCR
Tissue seksjoner fra svulst og den tilsvarende normal slimhinne, oppnådd minst 5 cm fra svulsten kanten, var skarpt dissekert på hematoksylin og eosin-farget lysbilder, og genomisk DNA ble deretter hentet ved hjelp av en QIAamp DNA FFPE (Qiagen Sciences, Hilden). Kvantitativ-genomisk polymerase chain reaction (Q-PCR) ble utført for å kvantifisere PRL-3
gen kopiantall ved hjelp av iQ ™ Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) i tre eksemplarer på iCycler iQ ™ Real-Time PCR Detection system (Bio-Rad). For å normalisere PRL-3
genkopitallet per celle, ADAM metallopeptidase domene 2 (ADAM2
, NT 923907,1), lokalisert på kromosom 8p11.2, ble brukt som en endogen referanse fordi det genamplifisering er definert som en kopi antall økning på et begrenset område av en kromosom arm [10]. ΔCt-verdier ble beregnet som Ct (PRL-3
) -Ct (ADAM2
) for hver prøve. Relativ kopiantall ble bestemt som to - ΔΔ Ct, hvor ΔΔC t = A C t (tumor) -ΔC t (tilsvarende normal) [23]. Økningene på mer enn to ganger i forhold til tilsvarende normal ble ansett som genomisk forsterkning. Ytterligere fil 1 viser detaljert PCR tilstand og sekvenser av primer og probe anvendt i denne studien.
Western blotting
Hele cellelysatene ble ekstrahert i RIPA-buffer (Pierce, Rockford, IL) tilsatt 10 ul /ml Halt ™ proteasehemmer Cocktail Kit (Pierce) og Halt ™ fosfatase Inhibitor Cocktail Kit (Pierce), og proteinet ble separert på NuPAGE ® 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. Både deteksjon og kvantifisering av spesifikke proteiner som ble utført med ATTO Lys Capture (ATTO Corporation, Tokyo, Japan). To kolorektal kreft-cellelinjer DLD-1 og SW480-celler (RIKEN Bioresource) ble anvendt som de lave og høye ekspresjonsnivåer kontroller, respektivt, som tidligere beskrevet [11]
PRL-3 mus monoklonalt antistoff (R &. D Systems, Minneapolis , MN) og β-aktin mus monoklonalt antistoff (Sigma, St. Louis, MO) ble anvendt som tidligere beskrevet [11].
PRL-3 små interfererende RNA-transfeksjon
Cellene ble transfektert med 1 pmol /L Accell SMARTpool, siRNA-PRL-3 (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) blandet med Accell siRNA levering Media (Thermo Fisher Scientific) i henhold til Thermo Scientific Dharmacon ® Accell ™ siRNA leveringsprotokoll [24]. Den Accell Non-måls Pool (siRNA-CTR) og Accell siRNA levering Media alene ble brukt som en kontroll for ikke-sekvensspesifikke effekter og som en mock-behandling, henholdsvis.
Anchorage uavhengig kolonidannelse analysen
forankringsuavhengig cellevekst ble analysert ved utsåing 0,36% topp agarose (Bacto ™ Agar, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) inneholdende 1 x 10 5 celler på en overflate på 0,72% bunnen agarose i 6-brønns platene [11]. Celler ble tilført ukentlig av overliggende frisk soft-agar-løsning, og kolonier ble fotografert etter 2 ukers inkubering. Den 50% effektive konsentrasjon (EC 50) verdien av PRL-3-inhibitor behandling ble beregnet på grunnlag av måling av kimtall.
Proliferasjonsanalyse og invasjon assay
proliferasjonsanalyse ble utført ved anvendelse av Premiks WST-1 Cell Proliferation Assay System (Takara Bio, Tokyo). Celler (2 x 10 3) ble sådd ut i 96-brønn, og den proliferative aktivitet ble målt ved absorbans ved 450 nm på utpekte samplings dager. Sensitiviteten til PRL-3-inhibitor på antiproliferation ble bestemt ved anvendelse av 50% hemmende konsentrasjon (IC 50)-verdien etter behandling i 72 timer.
Invasjon Analysen ble utført i 24-brønners BD BioCoat ™ Matrigel ™ invasjon Chamber (BD Biosciences Discovery Labware, Bedford, MA). Celler som hadde invadert gjennom membranen ble tellet i fire adskilte områder per brønn. Begge forsøkene ble utført in triplo.
Apoptose Analyser
apoptose analyser ble utført ved anvendelse av Guava PCA System (Guava Technologies, Inc., Hayward, CA). Celler (2 x 10 5) ble behandlet med den PRL-3-inhibitor ved den angitte konsentrasjon i mediet supplerende med 1.0% FBS i 72 timer, deretter farget med Annexin V og 7-AAD (Guava nexin reagens). Forsøket ble gjort i tre eksemplarer og analysert ved hjelp av CytoSoft 2.1.5 programvare (Guava Technologies) Statistical Analysis.
Fishers eksakte test, eller Mann-Whitney U
-test ble brukt til statistisk analysere forholdet mellom PRL-3
genamplifisering og clinicopathological variabler. Enveis variansanalyse (ANOVA) med post-hoc test ble brukt til å sammenligne mellom tre grupper for siRNA behandling (siRNA-PRL-3, siRNA-ctr, og mock). Student t
test ble anvendt for å evaluere terapeutisk effekt for de enkelte konsentrasjonene av PRL-3-inhibitor, sammenlignet med 0 umol /L av PRL-3 inhibitor. Kaplan-Meier metoden ble brukt til å beregne kumulative overlevelse, og forskjeller i overlevelse ble vurdert med bruk av log-rank test. Alle dødsfall av pasientene var kreft-relatert, og sykdomsspesifikk overlevelse (DSS) ble målt fra tidspunktet for kirurgi til dødsdato eller siste oppfølging. P
< 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans. Alle statistiske analyser ble utført med JMP 7.0 (SAS Institute, Cary, NC).
Resultater
PRL-tre uttrykk og genomisk forsterkning i magekreft cellelinjer
utgangspunktet var PRL-tre uttrykk status evaluert med western-blotting i 8 GC-cellelinjer (figur 1A). PRL-tre uttrykk ble observert ved en påvisbar nivå i alle cellelinjene, hvorav 5 cellelinjer (KatoIII, H111, MKN7, MKN74, og NUGC4 celler) og 3 cellelinjer (GCIY, AZ521, og SH10 celler) viste høy og forholdsvis lav ekspresjon, respektivt. Deretter ble FISH-analyse utført for å undersøke hvorvidt PRL-3-ekspresjon ble forårsaket av dets genomiske forsterkning (figur 1B). Genomisk forsterkning var tydeligvis positiv i 2 cellelinjer (MKN7 og MKN74 celler) og negativ i 6 cellelinjer. 3 av de seks var dysomic (AZ521, GCIY, og NUGC4 celler), og tre var polysomic (KatoIII, SH10, og H111 celler). PRL-3
genomisk forsterkning ofte forekommet i de forskjellige regionene fra kromosom 8, såkalt fordelt innsettinger, på metafase [10], og var overensstemmende med sin høye ekspresjon. Figur 1 Ekspresjon og genetisk status av PRL-3 i 8GC cellelinjer. (A) Ekspresjon nivå av PRL-3 ved western blotting. (B) FISH analyse på metafase av PRL-3
genet (grønn). Kromosomet 8 centromeric probe (oransje) ble brukt for å estimere antall kopier.
Karakteristisk for PRL-3
genomisk forsterkning i humane primære mage kreft
I vår forrige undersøkelse, ble PRL-tre uttrykk påvist i 95 (55%) av 173 primære GCer av IHC [6]. For å utforske koblingen mellom PRL-3 Uttrykket og genomiske forsterkning, ble Q-PCR utføres for både 40 svulster med positiv PRL-tre uttrykk og 37 svulster med negative uttrykk, som ble tilfeldig valgt fra differensialtrinn i de 173 primære svulster. Alle de primære tumorer uten PRL-3-ekspresjon ble ikke forsterket, mens 8 (20%) av de 40 primære tumorer med PRL-3 ekspresjon ble amplifisert (figur 2A). FISH analyser bekreftet også opplagt genomisk forsterkning som kreft-spesifikke endringen (figur 2B), og utstilt på nesten homogen mønster i både det sentrale området og invasive område innenfor svulst. Deretter ble forholdet til clinicopathological faktorer vurderes for PRL-3
genomisk amplifisering (tabell 1), hvor det var signifikant assosiert ikke bare med sin uttrykket (P
= 0,006), men også med dybden av tumorinvasjon ( P
= 0,006), tilstedeværelse av LNM (P
= 0,022), LNM status (P
= 0.004 i JCGC, P
= 0,002 i UICC), og scene (P
= 0.005 i JCGC, P
= 0,003 i UICC). I tillegg har alle de primære tumorer med genom-amplifikasjon ble stadium III eller IV sykdom (40%, 8/20). Videre genomisk forsterkning negativt påvirket utfallet av histologisk node-positive pasienter (P
= 0,021, figur 2C), selv om PRL-tre uttrykk ikke i våre og andre tidligere rapporter [6, 25]. Figur 2 Frekvens og prognose for PRL-3 genomisk forsterkning i 77 menneske GC. (A) Frekvens av PRL-3
genomisk forsterkning ved hjelp av Q-PCR i 77 menneske GC. Q-PCR ble utført for både 40 svulster med positiv PRL-tre uttrykk og 37 svulster med negative uttrykk. For å normalisere PRL-3
genkopitallet per celle, ADAM2
, lokalisert på kromosom 8p11.2, ble brukt som en endogen referanse. ΔCt-verdier ble beregnet som Ct (PRL-3
) -Ct (ADAM2
) for hver prøve. Relativ kopiantall ble bestemt som 2-ΔΔCt, hvor ΔΔCt = ΔCt (tumor) -ΔCt (tilsvarende normal). (B) Representant FISH analyse av PRL-3
genet i primærtumor og tilsvarende normal (sak 82). (C) Kaplan Meier kurver for 5-årige DSS i henhold til positivitet og negativitet av PRL-3
genomisk forsterkning i histologisk node-positive pasienter. Feilfelt, standardavvik (SD).
PRL-3 som et konvergent terapeutisk mål
I GC, de funksjonelle rollene til PRL-3, inkludert invasjon og spredning evner, har blitt dokumentert bare i SGC7901 celler [25] . For å bekrefte disse metastatiske egenskaper ved hjelp av 3 cellelinjer med forskjellig PRL-tre uttrykk og genetiske status, knock-down av endogen PRL-tre uttrykk ble utført ved hjelp av siRNA transfeksjon; AZ521 celler (lavt uttrykk og disomy), H111 celler (høy uttrykk og polysomy), MKN74 celler (høy uttrykk og genomisk forsterkning). Disse cellelinjene ble transfektert med siRNA-PRL-3 eller siRNA-ctr, og western blotting viste redusert nivå av PRL-3 protein i siRNA-PRL-3 celler, men ikke siRNA-CTR celler, sammenlignet med mock-behandling celler ( Figur 3A). Ett av de viktige trekk ved den metastatiske fenotype er ment som muligheten for kreftceller til å vokse under forankrings-uavhengig betingelser [26], men involvering i PRL-3 er ukjent i GC. Alle siRNA-PRL-3 celler viste signifikant redusert størrelse og antall kolonier, sammenlignet med siRNA-ctr celler eller mock-behandling celler (Figur 3B). Videre, i samsvar med tidligere rapporter for GC-cellelinjer [25, 27], også bekreftet vi at siRNA-PRL-3-celler viste betydelig mindre proliferativ aktivitet (figur 3C) og invasive egenskaper (figur 3D). Figur 3 Hemming av metastatiske egenskaper etter transfeksjon med siRNA i celler med uttrykk. (A) Western blotting 72 timer etter transfeksjon. Den vestlige blotting ble også kvantifisert. mock, behandling med Accell siRNA levering Media alene; ctr, behandling med siRNA-ctr; si, behandling med siRNA-PRL-3. (B) krings-uavhengig koloni formasjons analyser. Representative bilder av kolonidannelse på AZ521 celler ble vist i toppanelet. Med mock-behandling som 1.0, ble den relative frekvensen av kolonien tall vist i nedre panelet. Barer, 200 mikrometer. (C) proliferasjonsanalyse. Den proliferative aktivitet av AZ521-celler på 1, 2, 3, 4 eller 5 dager etter transfeksjon (øvre panel) og den relative proliferative hastighet på 5 dager etter transfeksjon (nedre panel) ble vist. (D) Invasion assay. Celler ble sådd på 4 dager etter transfeksjon, og deretter inkubert i 22 timer. Representative bilder av AZ521 celler (øverste panel) og den relative invasive rate (nedre panel) ble vist. Barer, 200 mikrometer; *, P
< 0,05 av ANOVA med post-hoc test; feilfelt, SD.
Terapeutisk potensiale av PRL-3-inhibitor, 1-4-brom-2-benzyliden rhodanin
For å vurdere potensiell terapeutisk og undersøke et fjell førings responsen på PRL-3-målrettet terapi, vi evaluert anticancer aktivitet av PRL-3-inhibitor, celle-permeabel benzyliden rhodanin forbindelse [16], mot 6 cellelinjer med forskjellig PRL-3 ekspresjon og genetisk status; GCIY og AZ521 celler (lavt uttrykk og disomy), KatoIII celler (høy uttrykk og polysomy), SH10 celler (lav uttrykk og polysomy), MKN7 og MKN74 celler (høy uttrykk og genomisk forsterkning). Celler ble behandlet med PRL-3-inhibitor ved konsentrasjoner i området fra 0 til 50 umol /L. PRL-3-inhibitor viste dose- og tidsavhengig antiproliferativ effekt på alle de testede cellelinjer, uavhengig av forskjellig PRL-3 ekspresjonsnivået og genetisk status, og IC 50 verdier av GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, MKN7 , og MKN74 celler var 26,77, 9,98, 24,26, 23,95, 22,29 og 9,45 mikromol /l, henholdsvis (figur 4A). AZ521 og MKN74 cellene var mer følsomme for PRL-3 hemmer behandling enn GCIY og MKN7 celler som ble kategorisert som identiske grupper i form av uttrykk og genetiske status, henholdsvis. Nemlig, genetisk ekspresjon eller status var ikke assosiert med sensitivitet på GC-celler mot PRL-3 inhibitor. Tilsvarende effekt ble vist i forankringsuavhengig koloni formasjon, og EF 50 verdier av GCIY, AZ521, SH10, og MKN74 celler var 6,99, 9,52, 13,05, 9,09 mikromol /L, henholdsvis (figur 4B). GCIY celler oppviste mer følsom inhibering i motsetning til den anti-proliferasjon. I tillegg dette hemmer også robust avskaffet invasiv evne til GC-celler (Figur 4C). For ytterligere å karakterisere anticancer-effekt av PRL-3-inhibitor behandling, ble apoptose-målingen ble utført (figur 5A). Selv om en umol /liter av inhibitoren var utilstrekkelig til å indusere apoptose utenfor grunnlinjen (0 umol /L), 10 umol /L av inhibitoren robust forårsaket drastisk apoptose på alle de testede cellelinjer, hvor det var de tre-fold og 11-fold øker utover grunnlinjen i GCIY og MKN74 celler, henholdsvis. Således PRL-3-inhibitor fortrengte disse metastatiske egenskaper på alle de testede cellelinjene på doseavhengig måte, og heller ikke ekspresjonsnivået eller genetisk status viste klar sammenheng med den følsomhet. Figur 4 Anticancer aktivitet av PRL-3 hemmer. (A) proliferasjonsanalyse etter behandling med PRL-3-inhibitor ved konsentrasjoner i området fra 0 til 50 umol /L mot 6 cellelinjer med forskjellig PRL-3 ekspresjon og genetisk status. Med celler behandlet med kjemisk løsning alene (0 mikromol /L PRL-3 hemmer) som 1.0, ble den relative proliferative rente på 5 dager etter behandling vist i venstre panel. Den proliferative aktivitet av AZ521 celler på 1, 2, 3 eller 4 dager etter behandlingen ble vist i panel høyre. L, lav uttrykk; H, høy uttrykk; D, disomy; P, polysomy; A, forsterkning; IC50, den 50% inhiberende konsentrasjon. (B) krings-uavhengig koloni formasjons analyser. Representative bilder av kolonidannelse på AZ521 celler (øverste panel) og den relative frekvensen av kolonien nummer (nedre panel) ble vist. Barer, 200 mikrometer; EC50, den 50% effektive konsentrasjon. (C) Invasion assay. Representative bilder (topp panel) og den relative invasive rate (nedre panel) ble vist. Barer, 200 mikrometer; *, P
< 0,05 av Student t
test, sammenlignet med 0 mikromol /L av PRL-3 hemmer; feilfelt, SD.
Figur 5 PRL-3 hemmer-mediert apoptose. (A) Apoptose-analysen ble utført 72 timer etter behandling med PRL-3-inhibitor (0 til 10 umol /L). Representative figurer av apoptose analysen på AZ521 og C2C12 celler ble vist i venstre panel, og den prosentvise og SD tidlig apoptose (nederst til høyre kvadrant) og sen apoptose (øverst til høyre kvadrant) er vist i hvert panel. Med celler behandlet med kjemisk oppløsning alene (0 umol /L PRL-3-hemmer) som 1,0, ble den relative sen apoptose hastighet etter behandling er vist på høyre panelet. *, P
< 0,05 ved Student t
testen, sammenlignet med 0 umol /L av PRL-3 inhibitor. (B) PRL-3 hemmer behandling mot normal skjelettmuskel C2C12 celler. C2C12 celler utstilt lavere uttrykk nivå av PRL-3 enn GC-celler ved western blotting. Proliferasjonsanalyse etter behandling med PRL-3-inhibitor ble utført. Feil barer, SD.
Slutt vurderte vi om PRL-3 hemmer indusert cytotoksisitet i normal skjelettmuskulatur, der PRL-3 er overveiende uttrykt [28]. Både spredning og apoptose-analyser ble utført ved bruk av vanlige skjelettmuskulaturen C2C12-celler behandlet med inhibitor, og viste at 10 umol /L av inhibitoren ikke klarte å forårsake antiproliferativ og apoptotisk respons på C2C12 i motsetning til virkningsfullhetene om alle de testede GC-cellelinjer ( Figur 5A og 5B).
diskusjon
som LNM er ansett som en viktig prognostisk faktor for GC [29], forskning av årsaks molekyler reflekterer LNM er en lovende avenue for å forbedre resultatene. Den nære koblingen av LNM med PRL-tre uttrykk, derfor har potensial som en ny terapeutisk mål [6, 25]. Imidlertid har kriteriene for PRL-3-rettet terapi ikke klarlagt, og det er viktig å klarlegge egenskapene til PRL-3
genomisk forsterkning i både mekanistiske og terapeutisk synspunkt, på grunn av de store mekanismen for dets påfølgende uttrykk og kreftutvikling [10]. I denne studien, tilbyr vi de viktige ledetråder for utvikling av denne terapeutiske strategi mot GC.
Forholdet mellom PRL-3 Uttrykket og genomiske forsterkning har aldri vært undersøkt så langt. PRL-3
genomisk forsterkning var konkordant med sitt uttrykk status i cellelinjer, og ble funnet i 20% (8/40) blant humane primære svulster med uttrykk, som var alt stadium III eller IV sykdom (40%, 8 /20), men i noen (0/37) blant de uten uttrykk. I tillegg ble PRL-3
genomisk forsterkning i forbindelse med LNM status, som fører til avansert stadium og dermed dårlige resultater i pasienter med LNM (P
= 0,021). Således kan PRL-3
genom-amplifikasjon være mer relevant for endring LNM, og være en av de dominerende mekanismene som induserer dets ekspresjon i mer avansert stadium. Men de fleste tumorer som uttrykker PRL-3 ble ikke forsterket, spesielt i earler trinnet. I mus embryoniske fibroblast-celler med villtype men ikke p53 - /-, PRL-3 induseres i et p53-avhengig måte [30]. Den p53 mutasjon eller tap av funksjon, derimot, har blitt dokumentert i alle GC cellelinjer som brukes i denne studien, bortsett NUGC4 celler (The TP53 nettstedet, http:.. //P53 gratis fr /) , noe som indikerer at det er annen mekanisme uavhengig av p53 svei. PRL-3 ekspresjon ble rapportert å være regulert på transkripsjonsnivået ved mitogene cytokiner, slik som IL-6, IL-21, HGF eller IGF-1 i myelom-cellelinjer [24], eller som TGF-β i kolon kreftcellelinjer [ ,,,0],31]. Nylig har PolyC-RNA-bindende protein 1 (PCBP1) blitt identifisert som en translatorisk regulator av PRL-3 [32]. De alternative mekanismer transkripsjonen eller translasjonsforskning nivå kan være involvert for å regulere PRL-tre uttrykk.
Vi bekreftet også at siRNA-mediert PRL-3 knockdown betydelig undertrykt celleproliferasjon og invasjon i tråd med tidligere rapporter for andre GC cellelinjer [25 , 27], og dessuten for første gang viste bortfall av kolonidannelse i henhold til forankrings-uavhengig tilstander, som støtter at PRL-3 kan være attraktivt terapeutisk mål mot GC.

• MikroRNA-645, oppregulert i menneskelig adencarcinoma av mage esophageal krysset, hemmer apoptose ved å målrette tumor suppressor IFIT2
• Prognostisk effekt av å påvise levedyktige sirkulerende tumorceller i mage kreftpasienter ved hjelp av en telomerase-spesifikk viral agent: en prospektiv study