Terapeuttinen potentiaali PRL-3 kohdentamista ja kliininen merkitys PRL-3 genomivahvistuksen mahasyövän

Terapeuttinen potentiaali PRL-3 kohdentamista ja kliininen merkitys PRL-3
genomivahvistuksen mahasyövän
tiivistelmä
tausta
fosfataasin regeneroimaan maksa-3 (PRL-3) on ansainnut huomiota ratkaisevana molekyyliä moniportaisuudesta etäpesäke. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme sääntelymekanismeissa PRL-3 ilmaisua, ja arvioi kliinistä potentiaalia PRL-3-täsmähoitoihin mahasyövän. Tool Menetelmät
PRL-3 genomivahvistuksen analysoitiin kvantitatiivista-polymeraasiketjureaktio reaktio ja /tai fluoresenssi in situ -hybridisaatiota 77 ensisijaisen mahalaukun kasvaimet. Syövän vastaista aktiivisuutta PRL-3-estäjällä (1-4-bromi-2-bentsylideeni rodaniinin) hoitoon arvioitiin syöpäsoluja vastaan, joilla on erilaiset geneettiset ja ilmaisun tila.
Tulokset
PRL-3 genomivahvistuksen oli tiiviisti yhtäpitävä korkealla taso sen proteiinin ilmentymistä solulinjoissa, ja todettiin 20% (8/40) joukossa ihmisen primaarikasvainten sen ilme, jotka olivat kaikki vaiheen III /IV sairaus (40%, 8/20), mutta ei mitään (0 /37) joukossa ilman ilmaisua. Lisäksi PRL-3 genomivahvistuksen liittyi metastaattinen imusolmuke tila, joka johtaa pitkälle ja siten huono tuloksia potilailla, joilla imusolmuke etäpesäke (P
= 0,021). PRL-3 Sirna voimakkaasti tukahdutettu metastaattinen ominaisuuksia, kuten solujen lisääntymisen, invaasio, ja kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeiden muodostumista. Vaikka kumpikaan PRL-3 genomivahvistuksen eikä ilmentymistaso oli vastuussa herkkyyttä PRL-3-estäjällä hoito, estäjä osoitti annoksesta riippuvaista syöpää torjuvaa tehoa, ja huomattavan indusoi apoptoosin kaikilla testatuilla solulinjoilla kanssa PRL-3 ilme.
johtopäätökset
Olemme ensimmäistä kertaa, osoittivat, että PRL-3 genomivahvistuksen on yksi hallitseva mekanismien asiakkuutta sen ilmaisu, etenkin pitemmälle, ja että PRL-3-täsmähoitoihin voi olla suuri potentiaali vastaan ​​mahasyövän sen ilme.
Avainsanat
PRL-3 mahasyövän genomivahvistuksen täsmähoitoihin imusolmuke Background
mahasyöpää (GC) on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1 ]. Viimeaikaiset parannukset diagnostisia välineitä ja menetelmiä ovat helpottaneet varhaisten GC ja siten erinomainen pysyvyyttä. Kuitenkin potilailla, joilla on edennyt sairaus aikaan diagnoosi edelleen huonot tulokset. Etäpesäke on monivaiheinen prosessi, johon paikallinen invaasio, levittämistä ja uudelleen perustamiseksi kaukaisiin elimiin, ja on merkittävä tekijä kuolleisuus [2]. Siksi ymmärtää paremmin etäpesäke voi avata tien monia innovatiivisia terapeuttisia strategioita GC.
Proteiini tyrosiinifosfataasien (PTP) muodostavat suuren perheen entsyymejä, jotka toimivat keskeiset säätelykomponenttia signaalitransduktioreitteihin [3] . Fosfa- regeneroimaan maksan (PRL-1, -2, ja -3), joka kuuluu pieni luokka PTP superperheen, on ainutlaatuinen COOH-terminaalin prenylaatio aihe, joka vaikuttaa kriittisesti niiden solusijaintipaikan ja toiminto [4]. PRL-3 oli aluksi tunnistettu olevan erityisesti yli-ilmentynyt maksan etäpesäkkeiden peräisin kolorektaalisyövän [5], ja sen jälkeen sen yli-ilmentyminen on dokumentoitu eri kasvaintyypeissä, mukaan lukien GC [6]. PRL-3 voi edistää syövän invaasio, muuttoliike, kasvua ja angiogeneesiä, joko defosforyloinnilla joka katalysoi katalyyttinen domeeni tai lokalisointi plasman kalvo ohjannut COOH-terminaalin prenylaatio motiivi [7-9]. Siten PRL-3 on ansainnut huomiota ratkaisevana molekyylin moniportaisuudesta etäpesäke ja siksi uutena terapeuttisena kohteena. Toisaalta, mekanismit asiakkuutta PRL-3 ilmaisu ei ole täysin selvitetty. Monistaminen genomista sisältävien alueiden onkogeenien on merkittävä mekanismi sen seurauksena yli-ilmentymisen ja syövän kehityksen, ja siksi on tärkeää kohdistettuja hoitomuotoja [10]. PRL-3
geenimonistuman osittain selittää yli-ilmentymisen peräsuolen syövän ja ruokatorven syöpä [5, 11]. Kuitenkin suhde genomivahvistuksen ja GC edelleen heikko, että sekä mekanistinen ja terapeuttinen näkökulmasta. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme ominaisuudet PRL-3
genomin monistamisen GC, ja edelleen arvioida kliinistä potentiaalia PRL-3-täsmähoitoihin. Tool Menetelmät
Solulinjat ja Tissue Näytteitä
GC solulinja MKN7 luovutti ystävällisesti Solumuoto Resource Center for Biomedical Research Institute of Development, ikääntymisen ja syövän yhteys, Tohoku University (Sendai, Japani). Seitsemän muuta GC solulinjat (GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, H111, MKN74, ja NUGC4) ostettiin RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Japani). Nämä solulinjat peittämään kahta päätyyppiä GC [12], suolen tyyppi (MKN7, MKN74, AZ521, ja H111-solut) ja hajanainen tyyppi (GCIY, KatoIII, SH10, ja NUGC solut) [13-15]. MKN7, NUGC4, ja AZ521 solut perustetaan imusolmuke etäpesäke (LNM), ja MKN74 solut olivat maksan etäpesäke. KATOIII ja GCIY solut perustetaan metastaattisen keuhkopussieffuusio ja askites, vastaavasti. H111 ja SH10 solut perustettiin päässä ksenotransplantaatio. Normaali luurankolihasten C2C12 solut hankittiin DS Pharma Biomedical Co, Ltd (Osaka, Japani). AZ521 ja C2C12-soluja kasvatettiin DMEM-alustassa (GIBCO, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Muut soluja kasvatettiin RPMI1640-alustassa (GIBCO), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. 1-4-bromi-2-bentsylideeni rodaniini hankittiin Calbiochem Corp (San Diego, CA), joka tunnistettiin PRL-3-estäjän läpi suuren suoritustehon seulonnan kemiallisilla kirjastoa Korean Chemical Bank, ja esti PRL-3 fosfataasiaktiivisuus [16]. Itse asiassa, fosforylaatio KRT8, PRL-3-vuorovaikutuksessa proteiinin, aiheuttama katalyyttisesti inaktiivinen mutantti PRL-3, mutta ei villityypin, vahvistettiin PRL-3-estäjällä hoito annoksesta riippuvalla tavalla [17]. Lisäksi syövänvastainen tehokkuus PRL-3-estäjällä hoito osoitti myös olla samanlainen kuin siRNA hoidon ruokatorven syöpä tai peräsuolen syöpä [11, 17].
Out 173 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudosnäytteet sarja, jossa me aiemmin arvioitu PRL-3 ilmentymistilanne käyttäen immunohistokemiallista värjäystä (IHC) GC [6], 77 pareittain primaarituumorin kudosten ja vastaava normaali limakalvo kudoksia valittiin satunnaisesti potilailla, joilla ero vaiheiden mukaisesti 13 painos n Japanin luokittelu mahakarsinooman (JCGC) [18]; 40 paria positiivista PRL-3 lauseke (10 potilasta vaiheessa I, 10 II, 10 III, ja 10 IV) ja 37 paria negatiivinen ilme (10 potilasta vaiheessa I, 10 II, 9 III, ja 8 IV). Kaikki potilaat saivat gastrectomy mukaan mahasyövän hoitosuositukset Japanissa [19], ja histopatologisia tutkimuksia tehtiin mukaan JCGC. 6 painos International Union Against Cancer (UICC) /TNM luokittelu käytettiin myös [20]. Taulukko 1 kuvaa yksityiskohtaiset tiedot 77 potilasta. Kaikki kudosnäytteet kerätään Kitasato yliopistollisen sairaalan, ja suostumus saatiin kaikilta potilailta. Tämä tutkimus hyväksyi eettisen komitean Kitasato University.Table 1 Korrelaatio PRL-3-geenin monistaminen ja kliinis muuttujien 77 potilailla, joilla on mahalaukun syövän


PRL-3-geenin monistaminen

muuttujat
kokonaismäärä
negativity
Positivity
p
arvo


Number
(%) B
Number
(%)

PRL-3 ilmaisu
0,006
Negativity
37
37
(100 )
0
(0) B Positivity
40
32
(80) B-8
(20) B-ikä (vuosia) B 0,726
< 60
34
30
(88) B-4
(12) B ≥60
43
39
(91)
4
(9)
Sukupuoli
0,710
Mies
51
45
(88) B-6
(12) B Female
26
24
(92) B-2
(8) B lymfaattiset läpäisyä
0,343
Absence
15
15
(100)
0
(0) B Presence
62
54
(87) B-8
(13) B Vascular läpäisyä
0,263
Absence
25
24
(96) B-1
(4) B Presence
52
45
(87) B-7
(13) B-erottelu
0,134
Well ja maltillinen
31
30
(97) B-1
(3) B Huono
46
39
(85) B-7
(15) B syvyys invaasion
0,006 *
T1 (m ja sM)
15
15
(100) B 0
(0) B T2 (mp ja ss)
35
33
(94) B-2
(6) B T3 (sE)
19
16
(84) B-3
(16) B-T4 (si) B 8
5
(63)
3
(38) B Imusolmuke etäpesäke
0,022
Absence
29
29
(100) B 0
(0) B Presence
48
40
(83) B-8
(17) B JCGC imusolmukkeesta tila †
0,004 *
N0
29
29
(100) B 0
(0) B N1
21
20
(95) B-1
(5) B N2
20
14
(70) B-6
(30) B-N3 ja kaukaisten imusolmukkeisiin
7
6
(86) B-1
(14) B-UICC imusolmukkeesta tila ‡
0,002 *
N0
29
29
(100) B 0
(0) B N1
18
17
(94) B-1
(6) B-N2
16
13
(81) B-3
(19)
N3 ja kaukana imusolmukkeiden
14
10
(71) B-4
(29) B JCGC vaiheessa
0,005 *
I (IA ja IB )
20
20
(100) B 0
(0) B II
20
20
(100) B 0
(0) B III (III A ja B)
19
15
(79) B-4
(21) B-IV
18
14
(78) B-4
(22) B-UICC vaiheessa
0,003 *
I (IA ja IB)
21
21
(100) B 0
(0) B II
20
20
(100) B 0
(0) B III (III A ja B) B 16
13
(81) B-3
(19) B-IV
20
15
(75) B 5
(25) B Fluoresenssi in situ -hybridisaatioanalyysi
Fluoresenssi in situ -hybridisaatio (FISH) analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [11]. PRL-3
sijaitsee kromosomissa 8q24.3 (GenBank NT 000008,9) ja kromosomi 8 sentromeerisen koetinta käytettiin arvioida kopiomäärä. Koska PRL-3
FISH pisteytys algoritmeja ei ole standardoitu, arviointi perustui kriteereihin HER2
[21]. Jokaisesta näytteestä, vähintään 60 syöpäsoluja pisteytettiin. Positiivinen PRL-3
genomivahvistuksen määriteltiin suhteessa PRL-3
kromosomiin 8 sentromeeriantigeenin yli 2,2, ja negatiivinen oli suhde on alle 1,8. Jos suhde PRL-3
kromosomiin 8 sentromeerin oli 1,8-2,2, vielä solut laskettiin, ja suhde yli 2,0 lopulta pitää positiivisina [21]. Polysomy määriteltiin keskimääräinen kromosomin 8 sentromeerisen signaaleja yli 3,0 per ydin [22].
Quantitative-genomista PCR
kudososat kasvain ja vastaavan normaalin limakalvon saatu vähintään 5 cm kasvain reunasta, olivat jyrkästi leikeltiin on hematoksyliinillä ja eosiinilla-värjätään dioja, ja genominen DNA uutettiin tämän jälkeen käyttäen on QIAamp DNA FFPE Kit (QIAGEN Sciences, Hilden). Quantitative-genomista polymeraasiketjureaktio (Q-PCR) suoritettiin määrittää PRL-3
geenikopiomäärä numeroita iQ ™ Supermixiä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) kolmena kappaleena annetun iCycler iQ ™ Real-Time PCR Detection järjestelmä (Bio-Rad). Normalisoida PRL-3
-geenin kopioiden määrä solua kohden, ADAM metallopeptidaasi domeeni 2 (ADAM2
, NT 923907,1), joka sijaitsee kromosomissa 8p11.2, käytettiin endogeenisen viitteenä, koska tämän geenin monistaminen on määritelty kopio määrä kasvoi rajoitettu alueen kromosomi varren [10]. ACt arvot laskettiin Ct (PRL-3
) -Ct (ADAM2
) kullekin näytteelle. Suhteellinen kopioluku määritettiin 2 - ΔΔ Ct, jossa ΔΔC t = ACk t (kasvain) -ΔC t (vastaa normaali) [23]. Lisäykset yli 2-kertainen suhteessa vastaavassa normaalissa pidettiin genomivahvistuksen. Muihin tiedosto 1 esittää yksityiskohtaisesti PCR kunto ja sekvenssit aluketta ja koetinta käytettiin tässä tutkimuksessa.
Western blotting
kokosolulysaateille uutettiin RIPA-puskurissa (Pierce, Rockford, IL), johon oli lisätty 10 ul /ml Pysäytetään ™ proteaasiestäjäseostabletit Kit (Pierce) ja Pysäytetään ™ fosfataasinestäjällä Cocktail Kit (Pierce), ja proteiini erotettiin NuPAGE ® 4-12% bis-Tris Gel (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Sekä havaitsemiseen ja kvantifiointiin erityiset proteiinit tehtiin käyttäen ATTO Light Capture (ATTO Corporation, Tokio, Japani). Kahden paksusuolen syövän solulinjat DLD-1 ja SW480-soluja (RIKEN Bioresource) käytettiin matalan ja korkean ekspression valvontaa, vastaavasti, kuten aiemmin on kuvattu [11].
PRL-3 hiiren monoklonaalinen vasta-aine (R &D Systems, Minneapolis , MN) ja β-aktiini hiiren monoklonaalinen vasta-aine (Sigma, St. Louis, MO) käytettiin kuten aiemmin on kuvattu [11].
PRL-3 pieniä häiritseviä RNA-transfektioon
Solut transfektoitiin 1 umol /l Accell SMARTpool, siRNA-PRL-3 (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) sekoitettuna Accell siRNA Delivery Media (Thermo Fisher Scientific) mukaan Thermo Scientific Dharmacon ® Accell ™ siRNA Delivery Protocol [24]. Accell Non-kohdistaminen allas (siRNA-CTR) ja Accell siRNA Delivery Media yksin käytettiin kontrollina ei-sekvenssi-erityisiä vaikutuksia ja sen mock-hoitoa, vastaavasti.
Anchorage riippumaton pesäkemuodostusta
Anchorage riippumaton solujen kasvua analysoitiin maljaamalla 0,36% pinta-agaroosin (Bacto ™ Agar, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ), joka sisälsi 1 x 10 5 solujen pinnalla 0,72% pohja agaroosia 6-kuoppaisille levyt [11]. Solut syötettiin viikoittain päällä tuoretta soft-agar ratkaisu, ja pesäkkeet valokuvattiin 2 viikon inkuboinnin. 50% tehokas konsentraatio (EY 50) arvo PRL-3-estäjällä hoito laskettiin mittaamiseen pesäkeluvun.
Proliferaatiomääritys ja invaasiomääritys
runsaudenmäärityksessä suoritettiin käyttämällä Premix WST-1 soluproleferaatiomäärityksessä System (Takara Bio, Tokio). -Soluja (2 x 10 3) ympättiin 96-kuoppaisille, ja proliferatiivinen aktiivisuus mitattiin absorbanssi 450 nm: ssä on nimetty näytteenottoa päivää. Herkkyys PRL-3-estäjällä on kasvunestotesteissä määritettiin käyttämällä 50% estävä pitoisuus (IC 50) arvo käsittelyn jälkeen 72 tuntia.
Invaasiomääritys suoritettiin 24 kuopan BD BioCoat ™ Matrigel ™ Invasion Chamber (BD Biosciences Discovery Labware, Bedford, MA). Solut, jotka olivat tunkeutuneet kalvon läpi laskettiin neljällä erotettu aloilla kuoppaa kohti. Molemmat kokeet tehtiin kolminkertaisina.
Apoptosis määritykset
Apoptosis analyysit suoritettiin käyttäen guava PCA System (guava Technologies, Inc., Hayward, CA). Solut (2 x 10 5) käsiteltiin PRL-3-estäjällä osoitetussa pitoisuus väliaineessa, johon oli lisätty 1,0% FBS 72 tuntia, sitten värjättiin anneksiini V ja 7-AAD (Guava neksiini Reagent). Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja analysoitiin käyttäen CytoSoft 2.1.5 ohjelmistoa (guava Technologies).
Tilastollinen analyysi
Fisherin testiä tai Mann-Whitney U
-testi käytettiin tilastollisesti analysoidaan suhdetta PRL-3
geenimonistus ja kliinis muuttujia. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) ja post-hoc testiä käytettiin vertaamaan välillä kolme ryhmää varten siRNA hoitoon (siRNA-PRL-3, siRNA-ctr, ja mock). Studentin t
testiä käytetään arvioimaan terapeuttinen vaikutus yksittäisten pitoisuuksien PRL-3-estäjällä, verrattuna 0 umol /l PRL-3-estäjällä. Kaplan-Meier-menetelmää käytettiin arvioitaessa kumulatiivinen eloonjäämisaste, ja erot selviytymisasteet arvioitiin käyttämällä log-rank-testi. Kaikki kuolemat potilaat olivat syöpään liittyvien, ja tautikohtaisten selviytyminen (DSS) mitattiin alkaen leikkaus kuolinpäivästä tai viimeinen seurannan. P
< 0,05 katsottiin osoittavan tilastollista merkittävyyttä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin JMP 7.0 ohjelmisto (SAS Institute, Cary, NC).
Tulokset
PRL-3 ilmaisun ja genomivahvistuksen mahasyövän solulinjoissa
Aluksi PRL-3 ilmentymistilanne arvioitiin käyttämällä western blotting 8 GC solulinjoissa (kuvio 1A). PRL-3: n ekspressio havaittiin havaittavissa määrin kaikissa solulinjoissa, joista 5 solulinjoja (KatoIII, H111, MKN7, MKN74, ja NUGC4 solut) ja 3-solulinjojen (GCIY, AZ521, ja SH10 solut) oli korkea, ja suhteellisen alhainen ilme, vastaavasti. Sen jälkeen, FISH-analyysi suoritettiin tutkimaan, PRL-3: n ekspressio aiheutti kautta genomivahvistuksen (kuvio 1 B). Genomivahvistuksen oli ilmeisesti positiivinen 2 solulinjoissa (MKN7 ja MKN74 solut) ja negatiivinen 6 solulinjoissa. 3 oli kuusi dysomic (AZ521, GCIY, ja NUGC4 solut), ja kolme oli polysomic (KatoIII, SH10, ja H111-soluissa). PRL-3
genomivahvistuksen ilmeni usein eri alueita kromosomista 8, niin sanottu jaettu insertiot, on metafaasissa [10], ja oli yhtäpitävä sen voimakkaaseen ilmentymiseen. Kuvio 1 Expression ja geneettisen tilan PRL-3 in 8GC solulinjoissa. (A) Expression taso PRL-3 western blottauksella. (B) FISH-analyysi metafaasissa PRL-3
geeni (vihreä). Kromosomissa 8 sentromeerisen koetin (oranssi) käytettiin arvioitaessa kopiomäärän.
Ominaista PRL-3
genomivahvistuksen ihmisen ensisijainen mahasyövistä
Aiemmissa tutkimuksessa, PRL-3 ekspressiota havaittiin 95 (55%) ulos 173 ensisijainen GC IHC [6]. Tutkimaan välisen yhteyden PRL-3 ilmaisun ja sen genomivahvistuksen, Q-PCR suoritettiin sekä 40 kasvaimien positiivinen PRL-3 ilmaisun ja 37 kasvaimia negatiivinen ilmaus, joka valittiin satunnaisesti ero vaiheissa 173 ensisijainen kasvaimia. Kaikki primäärikasvaimissa ilman PRL-3 ilmaisua ei monistettiin, kun taas 8 (20%) ulos 40 ensisijaisen kasvaimien PRL-3 ilmentyminen monistettiin (kuvio 2A). FISH analyysit vahvistivat myös ilmeinen genomivahvistuksen kuten syöpää ellei muutos (kuvio 2B), ja näytteillä lähes homogeeninen malli sekä keskialueella ja invasiivisia alue kasvain. Myöhemmin suhde kliinis tekijöitä arvioitiin PRL-3
genomivahvistuksen (taulukko 1), jossa se oli merkitsevästi yhteydessä paitsi sen ilme (P
= 0,006), mutta myös syvyyttä kasvaimen invaasion ( P
= 0,006), läsnäolo LNM (P
= 0.022), LNM tila (P
= 0,004 vuonna JCGC, P
= 0,002 UICC), ja vaihe (P
= 0,005 in JCGC, P
= 0,003 in UICC). Lisäksi kaikki primäärikasvaimissa genomivahvistumista oli vaiheen III tai IV sairaus (40%, 8/20). Lisäksi genomivahvistuksen vaikutti kielteisesti tuloksista histologisesti imusolmukkeisiin potilaat (P
= 0,021, kuvio 2C), vaikka PRL-3 ilmaisua ei meidän ja muiden aikaisempien raporttien [6, 25]. Kuvio 2 Taajuus ja ennusteen PRL-3 genomin monistamisen 77 ihmisen GC. (A) tiheys PRL-3
genomivahvistuksen käyttäen Q-PCR: 77 ihmisen GC. Q-PCR suoritettiin sekä 40 kasvaimien positiivinen PRL-3 ilmaisun ja 37 kasvainten negatiivinen ilmaus. Normalisoida PRL-3
-geenin kopioiden määrä solua kohden, ADAM2
, sijaitsee kromosomissa 8p11.2, käytettiin endogeenista viitteenä. ACt arvot laskettiin Ct (PRL-3
) -Ct (ADAM2
) kullekin näytteelle. Suhteellinen kopioluku määritettiin 2-ΔΔCt, jossa ΔΔCt = ACt (kasvain) -ΔCt (vastaa normaali). (B) edustaja FISH-analyysi PRL-3
geenin primaarikasvaimen ja vastaavassa normaalissa (tapaus 82). (C) Kaplan Meier käyrät 5-vuoden DSS mukaan positiivisuus tai negatiivisuus PRL-3
genomin monistamisen histologisesti solmussa-positiivisten potilaiden. Virhepalkkien keskihajonta (SD).
PRL-3 kuin yhtenevät terapeuttinen tavoite
GC, toiminnalliset roolit PRL-3, kuten hyökkäys ja leviämisen kykyjä, on dokumentoitu vain SGC7901 soluissa [25] . Vahvista nämä metastaattinen ominaisuudet käyttämällä 3 solulinjoja eri PRL-3 ilmaisun ja perimäluokituksesta, knock-down endogeenisen PRL-3 ilmentyminen suoritettiin käyttämällä siRNA transfektio; AZ521 soluja (heikkoa ilmentymistä ja disomia), H111-solut (korkea ilmaisun ja polysomy), MKN74 solut (korkea ilmaisun ja genomivahvistuksen). Nämä solulinjat transfektoitiin siRNA-PRL-3 tai siRNA-ctr, ja Western blotting osoitti alentunut taso PRL-3-proteiinin siRNA-PRL-3-soluissa, mutta ei siRNA-ctr soluissa, verrattuna mock-hoidon soluja ( Kuva 3A). Yksi tärkeä ominaisuus metastaattisen fenotyypin on tarkoitus kykynä syöpäsoluja kasvamaan kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa [26], mutta osallistuminen PRL-3 on tuntematon GC. Kaikki siRNA-PRL-3-solut osoittivat merkitsevästi vähentynyt koko ja pesäkkeiden lukumäärä verrattuna siRNA-ctr soluja tai mock-hoidon soluissa (kuvio 3B). Lisäksi suunnitteilla on aikaisempien raporttien muihin GC solulinjat [25, 27], myös vahvistanut, että siRNA-PRL-3-solut osoittivat merkitsevästi vähemmän proliferatiivinen aktiivisuus (kuvio 3C) ja invasiivisia kyky (kuvio 3D). Kuvio 3 esto metastaattisen ominaisuuksien transfektion jälkeen siRNA soluissa kanssa ilme. (A) Western-blottauksella 72 tuntia transfektion jälkeen. Länsi-blottaus myös määrällisesti. mock hoito Accell siRNA Delivery Media yksin; ctr hoito siRNA-ctr; si, käsittely siRNA-PRL-3. (B) Anchorage riippumaton pesäkkeiden muodostumisen määritykset. Edustavia kuvia pesäkkeen muodostumisen AZ521 solut esitetty yläpaneelissa. Pilkata-hoitoa kuin 1,0, suhteellinen nopeus pesäkeluvussa osoitettiin alapaneeli. Bars, 200 pm. (C) Proliferaatiomääritys. Proliferatiivinen aktiivisuus AZ521 soluja 1, 2, 3, 4 tai 5 päivää transfektion jälkeen (yläpaneeli) ja suhteellinen lisääntymisnopeus on 5 päivää transfektion jälkeen (alapaneeli) on esitetty. (D) Invasion määrityksessä. Solut ympättiin 4 päivää transfektion jälkeen, ja sitten inkuboitiin 22 tuntia. Edustavia kuvia AZ521 solujen (yläpaneeli) ja suhteellinen invasiivisia korko (alapaneeli) näytettiin. Bars, 200 pm; *, P
< 0,05 ANOVA post-hoc testi; virhepalkkien, SD.
terapeuttinen potentiaali PRL-3-estäjällä, 1-4-bromi-2-bentsylideeni rodaniinin
arvioimiseksi terapeuttista potentiaalia ja tutkia maamerkkinä ohjaavat vaste PRL-3-täsmähoitoihin, me arvioitu syövän vastaisen aktiivisuuden PRL-3-estäjällä, solu-läpäisevä bentsylideeni rodaniini yhdiste [16], vastaan ​​6 solulinjoja eri PRL-3 ilmaisun ja perimäluokituksesta; GCIY ja AZ521 soluja (heikkoa ilmentymistä ja disomia), KatoIII solut (korkea ilmaisun ja polysomy), SH10 soluja (heikkoa ilmentymistä ja polysomy), MKN7 ja MKN74 soluja (korkea ilmaisun ja genomivahvistuksen). Soluja käsiteltiin PRL-3-estäjällä pitoisuuksina 0-50 umol /l. PRL-3-estäjän osoitti annoksesta ja ajasta riippuvia antiproliferatiivisia tehoa kaikilla testatuilla solulinjoilla, riippumatta eri PRL-3 ekspressiotason ja perimäluokituksesta, ja IC 50-arvot GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, MKN7 ja MKN74 solut olivat 26,77, 9,98, 24,26, 23,95, 22,29 ja 9,45 umol /l, vastaavasti (kuvio 4A). AZ521 ja MKN74 solut olivat herkempiä PRL-3-estäjällä kohtelun kuin GCIY ja MKN7 soluja, jotka luokiteltiin sama ryhmien suhteen ilmaisun ja geneettisen tilan, tässä järjestyksessä. Nimittäin, geneettinen tai ilmentymistilanne ei ollut yhteydessä herkkyys GC solujen vastaan ​​PRL-3-estäjällä. Samanlaisia ​​teho esitetään kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeiden muodostumisen, ja EY: n 50-arvot GCIY, AZ521, SH10, ja MKN74 solut olivat 6,99, 9,52, 13,05, 9,09 umol /l, tässä järjestyksessä (kuva 4B). GCIY solut osoittivat herkempiä esto toisin anti-leviämisen. Lisäksi tämä inhibiittori myös voimakkaasti kumosi invasiivisen kyvyn GC soluja (kuvio 4C). Edelleen karakterisoimiseksi syöpälääkkeiden tehon PRL-3-estäjällä hoito, apoptoosin määritys suoritettiin (kuvio 5A). Vaikka 1 umol /l estäjän oli riittämätön indusoimaan apoptoosin yli perustason (0 umol /l), 10 umol /l inhibiittorin voimakkaasti aiheutti voimakkaita apoptoosin kaikkien testattujen solulinjojen, jossa oli 3-kertainen, ja 11-kertainen kasvaa tämän lähtötilanteeseen GCIY ja MKN74 soluja, tässä järjestyksessä. Siten PRL-3-estäjällä tukahdutettu nämä metastaattinen ominaisuuksia kaikkien testattujen solulinjojen in annoksesta riippuvaisella tavalla, eikä ekspressiotaso eikä perimäluokituksesta osoittivat selkeää korrelaatiota herkkyys. Kuvio 4 Syövän aktiivisuus PRL-3-estäjällä. (A) Proliferaatiomääritys käsittelyn jälkeen PRL-3-estäjällä pitoisuuksina 0-50 umol /L vastaan ​​6 solulinjoja eri PRL-3 ilmaisun ja geneettisen tilan. Soluilla käsitelty kemiallisilla ratkaisun yksin (0 mikromol /l PRL-3: n estäjä) kuten 1.0, suhteellinen proliferatiivinen korko 5 päivän kuluessa hoidon osoitettiin vasemmassa paneelissa. Proliferatiivinen aktiivisuus AZ521 soluja 1, 2, 3 tai 4 päivän kuluessa hoidon esitetty oikeassa paneelissa. L, heikkoa ilmentymistä; H, korkea ilmaisu; D, disomia; P, polysomy; A, vahvistusta; IC50, 50%: n estävä pitoisuus. (B) Anchorage riippumaton pesäkkeiden muodostumisen määritykset. Edustavia kuvia pesäkkeen muodostumisen AZ521 soluissa (yläpaneeli) ja suhteellinen nopeus pesäkkeitä numero (alapaneeli) näytettiin. Bars, 200 pm; EC50, 50% tehokas pitoisuus. (C) Invasion määrityksessä. Edustavia kuvia (yläpaneeli) ja suhteellinen invasiivisia korko (alapaneeli) näytettiin. Bars, 200 pm; *, P
< 0,05 Studentin t
testi, verrattuna 0 umol /l PRL-3-estäjän; virhepalkkien, SD.
Kuva 5 PRL-3-estäjällä-välitteisen apoptoosin. (A) Apoptoosi määritys suoritettiin 72 tunnin kuluttua altistuksesta ja PRL-3-estäjällä (0-10 umol /l). Edustavia lukuja apoptoosimäärityksessä on AZ521 ja C2C12 solut näkyvät vasemman paneelin ja prosenttiosuus ja SD varhaisen apoptoosin (alhaalla oikealla neljännesympyrä) ja myöhäinen apoptoosin (ylhäällä oikealla neljännekseen) on esitetty kussakin paneelissa. Soluilla käsitelty kemiallisilla ratkaisun yksin (0 mikromol /l PRL-3: n estäjä) kuten 1.0, suhteellisen myöhään apoptoosin korko hoidon jälkeen osoitettiin oikeassa paneelissa. *, P
< 0,05 Studentin t
testi, verrattuna 0 umol /l PRL-3-estäjällä. (B) PRL-3-estäjällä hoitoa vastaan ​​normaali luustolihasten C2C12 soluissa. C2C12 solut osoittivat alhaisempi ilmentymistaso PRL-3 kuin GC-soluissa Western-blottauksella. Runsaudenmäärityksessä käsittelyn jälkeen PRL-3-estäjällä suoritettiin. Virhepalkkien, SD.
Lopuksi arvioi PRL-3-estäjän aiheuttama sytotoksisuuden normaalissa luustolihasten, missä PRL-3 ilmentyy pääasiassa [28]. Sekä leviämisen ja apoptoosin analyysit suoritettiin käyttämällä normaalia luurankolihasten C2C12-soluja käsiteltiin inhibiittorin, ja osoittivat, että 10 umol /l estäjän ei aiheuta antiproliferatiivisia ja apoptoottista vastetta C2C12 toisin kuin tehokkuudet kaikkien testattujen GC solulinjoja ( Kuvio 5A ja 5B).
keskustelu
kuten LNM pidetään tärkeänä ennustetekijä GC [29], tutkimus aiheuttajasta molekyylien heijastava LNM on lupaava väylä parantaa tuloksia. Läheinen yhteys on LNM kanssa PRL-3 ilmaisu on näin ollen potentiaalia uutena terapeuttisena kohteena [6, 25]. Kuitenkin kriteerit PRL-3-täsmähoitoihin ei ole vahvistettu, ja se on kriittinen selventää ominaisuudet PRL-3
genomin monistamisen molempien mekanistinen ja terapeuttinen näkökulmasta, koska suurten mekanismi sen johtuva ilmentymisen ja syövän kehityksen [10]. Tässä tutkimuksessa, tarjoamme elintärkeää johtolankoja kehittämistä tämän hoitostrategia vastaan ​​GC.
Suhde PRL-3 ilmaisun ja sen genomivahvistuksen ei ole koskaan tutkittu toistaiseksi. PRL-3
genomivahvistuksen oli yhtäpitävä sen ilmentymistilanne solulinjoissa, ja todettiin 20% (8/40) joukossa ihmisen primaarikasvaimia ilme, jotka olivat kaikki vaihe III tai IV sairaus (40%, 8 /20), mutta ei mitään (0/37) joukossa ilman ilmaisua. Lisäksi PRL-3
genomivahvistuksen liittyi LNM tila, joka johtaa pitkälle ja siten huono tuloksia potilailla, joilla LNM (P
= 0,021). Siten PRL-3
genomivahvistuksen saattaa olla enemmän merkitystä muutos varten LNM, ja yksi hallitseva mekanismien asiakkuutta sen ilmentymistä pitemmälle. Kuitenkin useimmat kasvaimet ilmentävät PRL-3 ei monistettiin erityisesti earler vaiheessa. Hiiren alkion fibroblastisoluissa villityypin mutta ei p53 - /-, PRL-3 indusoi p53-riippuvaisella tavalla [30]. P53-mutaatio tai lakkaa toimimasta, mutta on dokumentoitu kaikki GC solulinjoja käyttää esillä olevassa tutkimuksessa, paitsi NUGC4 soluja (Sen TP53 Web Site, http: //p53. Ilmaiseksi. Fr /) , mikä osoittaa, että on olemassa muita mekanismi riippumatta p53-reitin. PRL-3: n ekspressio oli kuitenkin säädellään transkription tasolla mitogeeniset sytokiinien, kuten IL-6, IL-21, HGF tai IGF-1: myeloomasolulinjoja [24], tai TGF-β paksusuolen syöpäsolulinjoissa [ ,,,0],31]. Äskettäin PolyC-RNA-sitova proteiini 1 (PCBP1) on todettu olevan translaation säätelijänä PRL-3 [32]. Vaihtoehtona mekanismit transkription tai translaation tasolla voi olla mukana säädellä PRL-3 ilmaisua.
Myös vahvistaneet, että siRNA-välitteinen PRL-3 Knockdown merkittävästi tukahdutettu soluproliferaatiota ja invaasio linjassa aiempien raporttien muihin GC solulinjat [25 , 27], ja lisäksi ensimmäistä kertaa paljasti vähentynyt vaikutus pesäkkeen muodostumiselle kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa, jotka tukivat PRL-3 voi olla houkutteleva terapeuttinen kohde vastaan ​​GC.

• MicroRNA-645, säädellään ylöspäin ihmisen adencarcinoma mahalaukun ruokatorven risteyksessä, estää apoptoosin kohdentamalla tuumorisuppressoriproteiinia IFIT2
• Prognostiset vaikutus havaitsemiseksi elinkelpoisten kiertävien tuumorisolujen mahasyöpäpotilaista käyttämällä telomeraasia erityinen viruksen aine: tulevaisuutta koskeva tutkimus