Potentiel thérapeutique de PRL-3 ciblage et la signification clinique de PRL-3 amplification génomique en cancer

gastrique potentiel thérapeutique de PRL-3 ciblage et la signification clinique de PRL-3
amplification génomique dans le cancer gastrique
Résumé de l'arrière-plan
phosphatase de régénération du foie-3 (PRL-3) a mérité l'attention comme une molécule cruciale dans les multiples étapes de métastases. Dans la présente étude, nous avons examiné les mécanismes de régulation de PRL-3 expression, et évalué le potentiel clinique de la thérapie PRL-3-ciblée dans le cancer gastrique.
Méthodes
PRL-3 amplification génomique a été analysée en utilisant la chaîne quantitative-polymérase réaction et /ou de la fluorescence par hybridation in situ dans 77 tumeurs gastriques primaires. Les résultats de l'activité anticancéreuse du PRL-3 inhibiteur (1-4-bromo-2-benzylidène rhodanine) le traitement a été évaluée contre les cellules cancéreuses ayant le statut génétique et expression différente.
PRL-3 amplification génomique était étroitement concordant avec une grande le niveau de l'expression des protéines dans des lignées cellulaires, et a été trouvée dans 20% (8/40) parmi les tumeurs humaines primaires avec son expression, qui sont tous au stade III /IV maladie (40%, 8/20), mais dans aucune (0 /37) parmi ceux sans expression. En outre, PRL-3 amplification génomique a été associée à l'état métastatique des ganglions lymphatiques, conduisant à un stade avancé et les résultats ainsi pauvres chez les patients atteints de métastases ganglionnaires (P = 0,021)
. PRL-3 petits ARN interférents vigoureusement réprimés propriétés métastatiques, y compris la prolifération cellulaire, l'invasion et la formation de colonies indépendante de l'ancrage. Bien que ni le niveau d'amplification ni d'expression génomique PRL-3 était responsable de la sensibilité à la PRL-3 traitement avec l'inhibiteur, l'inhibiteur montré dose-dépendante de l'efficacité anticancéreuse, et l'apoptose remarquablement induite sur toutes les lignées cellulaires testées avec PRL-3 expression.
Conclusions
Nous avons pour la première fois, ont démontré que PRL-3 amplification génomique est l'un des mécanismes prédominants induire son expression, en particulier au stade plus avancé, et que la thérapie de PRL-3-ciblée peut avoir un grand potentiel contre le cancer gastrique avec son expression.
Mots-clés
PRL-3 amplification génomique du cancer gastrique thérapie ciblée ganglionnaire Contexte
cancer gastrique (GC) est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde entier [1 ]. De récentes améliorations dans les outils de diagnostic et les méthodes ont facilité la détection de GC précoce et ainsi une excellente survie à long terme. Cependant, les patients ayant une maladie avancée au moment du diagnostic demeurent des résultats médiocres. Métastase est un processus en plusieurs étapes, impliquant une invasion locale, la diffusion, et le rétablissement dans des organes éloignés, et est le principal déterminant de la mortalité [2]. Par conséquent, une meilleure compréhension des métastases peut ouvrir la voie à une multitude de stratégies thérapeutiques innovantes en GC.
Les protéines tyrosine phosphatases (PTP) forment une grande famille d'enzymes qui servent de composants réglementaires clés dans les voies de transduction du signal [3] . Les phosphatases de la régénération du foie (PRL-1, -2 et -3), appartenant à une petite classe de PTP superfamille, ont un motif de prénylation COOH-terminale unique, qui affecte gravement leur localisation et la fonction cellulaire [4]. PRL-3 a d'abord été identifié comme étant spécifiquement surexprimé dans les métastases hépatiques dérivées d'un cancer colorectal [5], et par la suite sa surexpression a été décrite dans divers types de tumeurs, y compris GC [6]. PRL-3 peut promouvoir l'invasion du cancer, la migration, la croissance et l'angiogenèse, soit par déphosphorylation qui est catalysé par le domaine catalytique ou de la localisation de la membrane plasmatique réalisé par prénylation motif COOH-terminale [7-9]. Ainsi, PRL-3 a mérité l'attention comme une molécule cruciale dans les multiples étapes de la métastase et donc comme une nouvelle cible thérapeutique. D'autre part, les mécanismes induisant PRL-3 expression ne sont pas entièrement clarifié. Amplification des régions génomiques contenant oncogènes est le principal mécanisme de sa surexpression et par conséquent le développement du cancer, et a donc une importance pour les thérapies ciblées [10]. PRL-3
l'amplification du gène explique en partie la surexpression dans le cancer colorectal et le cancer de l'œsophage [5, 11]. Cependant, la relation entre l'amplification génomique et GC reste insaisissable dans les points à la fois mécanistiques et thérapeutiques de vue. Dans la présente étude, nous avons examiné les caractéristiques du PRL-3
amplification génomique dans GC, et en outre évalué le potentiel clinique de la thérapie PRL-3-ciblée.
Méthodes
lignées cellulaires et des échantillons de tissus
la lignée cellulaire de GC MKN7 a été aimablement fourni par la cellule Centre de ressources pour l'Institut de recherche biomédicale du développement, le vieillissement et le cancer, l'Université du Tohoku (Sendai, Japon). Sept autres lignées de cellules de GC (GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, H111, MKN74 et NUGC4) ont été achetés chez RIKEN BioResource Center (Ibaraki, Japon). Ces lignées cellulaires couvrent les deux principaux types de GC [12], de type intestinal (MKN7, MKN74, AZ521, et les cellules H111) et de type diffus (GCIY, KatoIII, SH10, et les cellules NUGC) [13-15]. cellules MKN7, NUGC4 et AZ521 ont été établies à partir de métastase ganglionnaire (LNM), et les cellules MKN74 étaient de métastases hépatiques. cellules KATOIII et GCIY ont été établies à partir de l'épanchement pleural métastatique et ascite, respectivement. cellules H111 et SH10 ont été établies à partir de la xénotransplantation. cellules des muscles squelettiques C2C12 normaux ont été achetés chez DS Pharma Biomedical Co., Ltd (Osaka, Japon). AZ521 cellules C2C12 et ont été cultivées dans du milieu DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) complété avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS). Les autres cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI1640 (GIBCO) supplémenté avec 10% de FBS. 1-4-bromo-2-benzylidène rhodanine a été acheté chez Calbiochem Corp (San Diego, CA), qui a été identifié comme étant un PRL-3 inhibiteur par criblage à haut débit utilisant la bibliothèque chimique de Corée Chemical Bank et inhibe PRL-3 activité de phosphatase [16]. En effet, la phosphorylation de KRT8, une protéine, induite par le mutant inactif catalytiquement de la PRL-3 PRL-3-interacting, mais pas de type sauvage, a été confirmée par la PRL-3 traitement avec l'inhibiteur d'une manière dépendante de la dose [17]. En outre, anticancéreuses efficacité de la PRL-3 traitement avec l'inhibiteur a également montré être similaire à celle du traitement ARNsi dans le cancer de l'oesophage ou d'un cancer colorectal [11, 17]. Le plus sur 173 fixés au formol, enrobés de paraffine, des séries d'échantillons de tissus où nous avons précédemment évalué PRL-3 statut d'expression en utilisant la coloration immunohistochimique (IHC) en GC [6], 77 appariés paires de tissus tumoraux primaires et les tissus de la muqueuse normale correspondant été choisis au hasard parmi les patients atteints d'étages différentiels selon le 13 e édition de la classification japonaise de Carcinome gastrique (JCGC) [18]; 40 paires avec positif PRL-3 expression (10 patients dans la phase I, 10 en II, 10 à III, et 10 en IV) et 37 paires avec une expression négative (10 patients dans la phase I, 10 en II, 9 à III, et 8 à IV). Tous les patients ont subi une gastrectomie selon les directives de traitement du cancer gastrique au Japon [19], et les examens histopathologiques ont été effectués selon le JCGC. Le 6 e édition de l'Union Internationale Contre le Cancer (UICC) /classification TNM a également été utilisé [20]. Le tableau 1 présente les informations détaillées sur 77 patients. Tous les échantillons de tissus ont été prélevés à l'hôpital universitaire Kitasato, et le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients. La présente étude a été approuvée par le Comité d'éthique du Kitasato University.Table 1 Corrélation entre l'amplification PRL-3 gènes et des variables clinicopathologiques chez 77 patients atteints de cancer gastrique


PRL-3 amplification du gène

Variables
nombre total
négativité
Positivity
p
valeur


Nombre
(%)

Nombre
(%)

PRL-3 expression
0,006 de la négativité
37
37
(100 )
0
(0)
Positivity
40
32
(80) 8
(20)
âge (années)
0,726
< 60
34
30
(88) 4
(12)
≥60
43
39
(91)
4
(9)
Sexe
51
45 de
0,710
Homme (88)
6
(12)
Femme
26
24
(92) 2
(8)
lymphatique perméation
0,343
Absence
15
15
(100)
0
(0)
62
54 de
Présence (87) 8
(13)
vasculaire perméation
0,263
Absence
25
24
(96) 1
(4)
52
45 de
Présence (87)
7
(13)
Différenciation
0,134
bien et modéré
31
30
(97) 1
(3)
pauvres
46
39
(85)
7
(15)
Profondeur d'invasion
0,006 *
T1 (m et sm)
15
15
(100)
0
(0)
T2 (mp et ss)
35
33
(94) 2
(6)
T3 (se)
19
16
(84) 3
(16)
T4 (si) 8
5
(63)
3
(38)
métastases ganglionnaires
0,022
Absence
29
29
(100)
0
(0)
Présence
48
40
(83) 8
(17)
JCGC statut ganglionnaire †
0,004 *
N0
29
29
(100)
0
(0)
N1
21
20
(95) 1
(5)
N2
20
14
(70)
6
(30)
N3 et les ganglions lymphatiques éloignés
7
6
(86) 1
(14)
ganglionnaire UICC état ‡
0,002 *
29
29
(100)
0
N0 (0)
N1
18
17
(94) 1
(6)
N2
16
13
(81) 3
(19)
N3 et les ganglions lymphatiques éloignés
14
10
(71) 4
(29)
JCGC stade
0,005 *
I (IA et IB )
20
20
(100)
0
(0)
II
20
20
(100)
0
(0)
III (IIIA et IIIB)
19
15
(79) 4
(21)
IV
18
14
(78) 4
(22)
UICC stade
0,003 *
I (IA et IB)
21
21
(100)
0
(0)
II
20
20
(100)
0
(0)
III (IIIA et IIIB)
16
13
(81) 3
(19)
IV
20
15
(75)
5
(25)
fluorescence dans l'analyse d'hybridation in situ
hybridation fluorescente in situ (FISH) L'analyse a été effectuée comme décrit précédemment [11]. PRL-3
est situé sur le chromosome 8q24.3 (numéro d'accession GenBank NT 000.008,9), et la sonde centromérique chromosome 8 a été utilisé pour estimer le nombre de copies. Parce que les algorithmes de notation PRL-3
FISH avaient pas été normalisées, l'évaluation a été basée sur les critères de HER2
[21]. Pour chaque échantillon, au moins 60 cellules cancéreuses ont été notées. PRL-3
amplification génomique positive a été définie comme un rapport de PRL-3
sur le chromosome 8 centromère plus de 2,2 et négatif est le rapport inférieur à 1,8. Si le rapport de la PRL-3
sur le chromosome 8 centromère est de 1,8 à 2,2, des cellules supplémentaires ont été comptées, et le rapport de plus de 2,0 a finalement été considéré comme positif [21]. Polysomie a été définie comme étant les signaux centromériques moyens de chromosome 8 supérieur à 3,0 par noyau [22].
PCR quantitative-génomique
sections de tissu de la tumeur et la muqueuse normale correspondante, obtenue au moins 5 cm à partir du bord de la tumeur, étaient fortement disséqué sur hématoxyline et diapositives éosine teinté, et l'ADN génomique a ensuite été extrait à l'aide d'un kit QIAamp DNA FFPE (Sciences QIAGEN, Hilden). Quantitative-génomique réaction en chaîne par polymérase (Q-PCR) a été réalisée pour quantifier PRL-3
nombre de copies de gènes en utilisant iQ ™ Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) en triple sur la détection par PCR en temps réel iCycler iQ ™ système (Bio-Rad). Pour normaliser PRL-3
le nombre de copies par cellule, ADAM domaine métallopeptidasique 2 (ADAM2
, NT 923.907,1), situé sur le chromosome 8p11.2, a été utilisé comme une référence endogène parce que l'amplification du gène est définie comme une copie augmentation du nombre d'une zone restreinte d'un bras chromosomique [10]. Les valeurs ont été calculées comme ACt Ct (PRL-3
) -Ct (ADAM2
) pour chaque échantillon. nombre de copies relative a été déterminée comme 2 - ΔΔ Ct, où ΔΔC t = ôc t (tumeur) -ΔC t (correspondant normal) [23]. Les augmentations de plus de 2 fois par rapport à la normale correspondante ont été considérés comme l'amplification génomique. Fichier supplémentaire 1 représente la condition PCR détaillée et des séquences d'amorce et sonde utilisée dans la présente étude.
Western blot
lysats de cellules entières ont été extraites dans un tampon RIPA (Pierce, Rockford, IL) additionné de 10 ul /Halt mL, ™ Kit inhibiteur de protéase Cocktail (Pierce) et Halt ™ Kit de Cocktail Phosphatase Inhibitor (Pierce), et la protéine ont été séparés sur NuPAGE ® 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) selon le protocole du fabricant. Les deux détection et la quantification des protéines spécifiques ont été effectuées en utilisant ATTO Lumière de capture (ATTO Corporation, Tokyo, Japon). Deux lignées cellulaires de cancer colorectal DLD-1 et de cellules SW480 (RIKEN BioResource) ont été utilisés comme contrôles d'expression basse et haute, respectivement, comme décrit précédemment [11]
PRL-3 anticorps monoclonal de souris (R &. D Systems, Minneapolis , MN) et un anticorps monoclonal de souris, β-actine (Sigma, St. Louis, MO) ont été utilisés comme décrit précédemment [11].
PRL-3 small interfering transfection d'ARN
Les cellules ont été transfectées avec 1 umole /L Accell SmartPool, siRNA-PRL-3 (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) mélangé avec Accell siRNA Media Delivery (Thermo Fisher Scientific) selon le Thermo Scientific Dharmacon ® Accell ™ Protocole de distribution siRNA [24]. La piscine Accell non-ciblage (siRNA-ctr) et Accell siRNA Media Delivery seuls ont été utilisés en tant que témoin pour les effets non spécifiques de séquence et comme une maquette de traitement, respectivement.
Anchorage indépendant dosage de formation de colonies
Anchorage indépendant croissance cellulaire a été analysé par placage 0,36% supérieure agarose (Bacto ™ Agar, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) contenant 1 x 10 5 cellules sur une surface de 0,72% d'agarose en bas à 6 puits plaques [11]. Les cellules ont été alimentées toutes les semaines par une solution fraîche recouvrant la gélose molle, et les colonies ont été photographiées au bout de 2 semaines d'incubation. La concentration efficace à 50% (CE 50) valeur de PRL-3 traitement inhibiteur a été calculé sur la base de la mesure du nombre de colonies. Test
de prolifération et le dosage d'invasion
Le test de prolifération a été réalisée en utilisant Premix WST-1 prolifération cellulaire système de dosage (Takara Bio, Tokyo). Les cellules (2 x 10 3) ont été ensemencées dans 96 puits, et l'activité proliferative a été mesurée par absorbance à 450 nm sur jours d'échantillonnage désignés. La sensibilité à la PRL-3 inhibiteur sur l'anti-prolifération a été déterminée en utilisant la concentration inhibitrice 50% (CI 50) la valeur après le traitement pendant 72 heures. Le plus le dosage d'invasion a été réalisée dans le puits 24 BD BioCoat ™ Matrigel ™ Invasion Chambre (BD Biosciences Discovery Labware, Bedford, MA). Les cellules qui avaient envahi à travers la membrane ont été comptées dans quatre champs séparés par puits. Les deux expériences ont été réalisées en triple.
Essais de Apoptose Apoptose Les essais ont été effectués en utilisant le système PCA Guava (Guava Technologies, Inc., Hayward, CA). Les cellules (2 x 10 5) ont été traités avec l'inhibiteur PRL-3 à la concentration indiquée dans le milieu supplémentaire avec 1,0% de FBS pendant 72 heures, puis colorées avec l'annexine V et de 7-AAD (Guava Nexin réactifs). L'expérience a été effectuée en triple et analysé à l'aide du logiciel CytoSoft 2.1.5 (Guava Technologies) Analyse statistique
.
Test exact de Fisher, ou de Mann-Whitney U
-test a été utilisé pour analyser statistiquement la relation entre PRL-3 amplification
des gènes et des variables clinicopathologiques. Une analyse de variance (ANOVA) avec le test post-hoc a été utilisé pour comparer entre trois groupes pour le traitement siRNA (siRNA-PRL-3, siRNA-ctr et maquette). Le test de t de Student a été utilisé pour évaluer l'effet thérapeutique pour les concentrations individuelles de PRL-3 inhibiteur, par rapport à 0 umol /L de 3 PRL-inhibiteur. La méthode de Kaplan-Meier a été utilisée pour estimer les taux cumulatifs de survie, et les différences dans les taux de survie ont été évalués à l'aide du test du log-rank. Tous les décès de patients ont été reliés au cancer et la survie spécifique de la maladie (DSS) a été mesurée à partir de la date de l'opération à la date du décès ou le dernier suivi. P
< 0,05 a été considérée pour indiquer la signification statistique. Résultats de Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel JMP 7.0 (SAS Institute, Cary, NC).
PRL-3 expression et l'amplification génomique dans des lignées cellulaires de cancer gastrique
Initialement, PRL-3 le statut d'expression a été évaluée à l'aide transfert de type western dans des lignées cellulaires 8 GC (figure 1A). PRL-3 expression a été observée à un niveau détectable dans toutes les lignées cellulaires, parmi lesquels 5 lignées cellulaires (KatoIII, H111, MKN7, MKN74 et cellules NUGC4) et 3 lignées cellulaires (GCIY, cellules AZ521 et SH10) présentait élevé et faible expression relativement respectivement. Par la suite, l'analyse FISH a été réalisée pour examiner si la PRL-3 expression a été provoquée par son amplification génomique (figure 1B). amplification génomique est évidemment positive dans 2 lignées cellulaires (cellules MKN74 et MKN7) et négative en 6 lignées cellulaires. 3 des six cellules étaient (AZ521, GCIY et NUGC4) dysomic, et trois étaient des cellules (KatoIII, SH10, et H111) polysomiques. PRL-3
amplification génomique souvent eu lieu dans les différentes régions du chromosome 8, que l'on appelle des insertions distribués, sur métaphase [10], et concordait avec sa haute expression. Figure 1: Expression et le statut génétique de la PRL-3 dans des lignées cellulaires 8GC. (A) Niveau d'expression de PRL-3 par western blot. (B) analyse FISH sur métaphase de PRL-3
gène (vert). Le centromérique sonde chromosome 8 (orange) a été utilisé pour estimer le nombre de copies.
Caractéristique de PRL-3
amplification génomique dans les cancers gastriques primaires humains
Dans notre étude précédente, PRL-3 expression a été détectée dans 95 (55%) sur 173 GCS primaires par IHC [6]. Pour explorer le lien entre PRL-3 expression et son amplification génomique, Q-PCR a été réalisée pour les deux 40 tumeurs avec positif PRL-3 expression et 37 tumeurs avec expression négative, qui ont été sélectionnés au hasard à partir des stades différentiels dans les 173 tumeurs primaires. Toutes les tumeurs primaires sans PRL-3 expression ne sont pas amplifiés, alors que 8 (20%) sur les 40 tumeurs primaires avec PRL-3 expression ont été amplifiés (figure 2A). FISH analyses a également confirmé l'amplification génomique évidente que l'altération spécifique du cancer (figure 2B), et exposé au motif presque homogène tant dans la zone centrale et la zone invasive au sein de la tumeur. Par la suite, la relation avec les facteurs clinicopathologiques a été évalué pour PRL-3
amplification génomique (tableau 1), où il a été associé de façon significative non seulement par son expression (P
= 0,006), mais aussi avec la profondeur de l'invasion tumorale ( P
= 0,006), la présence de LNM (P = 0,022
), statut LNM (P = 0,004
dans JCGC, P = 0,002
in UICC), et l'étape (P =
0,005 JCGC, P = 0,003
in UICC). En outre, toutes les tumeurs primaires avec amplification génomique étaient de stade III ou IV de la maladie (40%, 8/20). De plus, l'amplification génomique affecté négativement les résultats des patients histologiquement ganglionnaire (P = 0,021
, figure 2C), bien que PRL-3 expression n'a pas dans nos rapports précédents et d'autres [6, 25]. Figure 2 Fréquence et pronostic de PRL-3 amplification génomique dans 77 GC humaine. (A) Fréquence de PRL-3
amplification génomique en utilisant Q-PCR dans 77 GC humaine. Q-PCR a été réalisée pour les deux 40 tumeurs avec positif PRL-3 expression et 37 tumeurs avec expression négative. Pour normaliser PRL-3
le nombre de copies par cellule, ADAM2
, situé sur le chromosome 8p11.2, a été utilisé comme une référence endogène. Les valeurs ont été calculées comme ACt Ct (PRL-3
) -Ct (ADAM2
) pour chaque échantillon. nombre de copies relatif a été déterminé que le 2-ΔΔCt, où ΔΔCt = ACt (tumeur) -ΔCt (correspondant normal). (B) d'analyse FISH Représentant du PRL-3
gène dans la tumeur primaire et normale correspondante (cas 82). courbes (C) Kaplan Meier 5 ans DSS selon la positivité ou la négativité de PRL-3
amplification génomique dans les histologiquement patients ganglionnaire. Les barres d'erreur, déviation standard (SD).
PRL-3 comme cible thérapeutique
convergente Dans GC, les rôles fonctionnels de PRL-3, y compris l'invasion et la prolifération des capacités, ont été documentés que dans SGC7901 cellules [25] . Pour confirmer ces propriétés métastatiques en utilisant 3 lignées cellulaires avec différents PRL-3 expression et statut génétique, knock-down endogène PRL-3 expression a été réalisée en utilisant siRNA transfection; cellules AZ521 (faible expression et disomie), les cellules H111 (haute expression et polysomie), les cellules MKN74 (haute expression et d'amplification génomique). Ces lignées cellulaires ont été transfectées avec l'ARNsi-PRL-3 ou de l'ARNsi-ctr, et un transfert de Western a montré la diminution du niveau de la PRL-3 protéines dans l'ARNsi-PRL-3 cellules, mais les cellules non ARNsi-ctr, par rapport aux cellules pseudo-traitement ( La figure 3A). L'une des caractéristiques importantes du phénotype métastatique est supposé que la capacité des cellules cancéreuses à se développer dans les conditions d'un ancrage indépendant [26], mais la participation à la PRL-3 reste inconnue en GC. Tous les siRNA-PRL-3 cellules ont montré la diminution significative la taille et le nombre de colonies, par rapport aux cellules de siRNA-ctr ou cellules mock-traitement (figure 3B). En outre, en conformité avec les rapports précédents pour les autres lignées de cellules GC [25, 27], on a également confirmé que l'ARNsi-PRL-3 cellules ont montré l'activité significativement moins proliférative (figure 3C) et la capacité invasive (figure 3D). Figure 3: Inhibition des propriétés métastatiques après transfection avec le siRNA dans les cellules avec expression. (A) Western blot 72 heures après la transfection. Le western blot a également été quantifiée. maquette, le traitement par Accell siRNA Media Delivery seul; ctr, le traitement avec le siRNA-ctr; si, le traitement avec le siRNA-PRL-3. (B) des tests de formation de colonies Anchorage indépendant. images représentatives de la formation de colonies sur les cellules AZ521 ont été présentés dans le panneau supérieur. Avec mock-traitement 1.0, le taux relatif de nombre de colonies a été montré dans le panneau inférieur. Bars, 200 um. (C) Essai de prolifération. L'activité proliférative des cellules AZ521 sur 1, 2, 3, 4, ou 5 jours après la transfection (panneau supérieur) et le taux de prolifération relative sur 5 jours après transfection (panneau inférieur) ont été présentés. dosage (D) Invasion. Les cellules ont été ensemencées sur 4 jours après la transfection, puis incubées pendant 22 heures. images représentatives de cellules AZ521 (en haut du panneau) et le taux invasif relatif (panneau inférieur) ont été présentés. Bars, 200 um; *, P
< 0,05 par ANOVA avec un test post-hoc; barres d'erreur, SD. potentiel thérapeutique de PRL-3 inhibiteur, 1-4-bromo-2-benzylidène rhodanine
Pour évaluer le potentiel thérapeutique et d'examiner un point de repère guider la réponse à la thérapie PRL-3-ciblée, nous a évalué l'activité anti-cancéreuse de la PRL-3 inhibiteur, d'un composé cellulaire perméable à la rhodanine benzylidène [16], à l'encontre de 6 lignées cellulaires avec différents PRL-3 et de l'état d'expression génétique; GCIY et cellules AZ521 (faible expression et disomie), les cellules KatoIII (haute expression et polysomie), les cellules SH10 (faible expression et polysomie), les cellules MKN7 et MKN74 (haute expression et d'amplification génomique). Les cellules ont été traitées avec un inhibiteur PRL-3 à des concentrations variant entre 0 et 50 umol /L. PRL-3 inhibiteur a montré une efficacité anti-proliférative de la dose et dépendante du temps sur toutes les lignées cellulaires testées, quel que soit différent niveau d'expression de la PRL-3 et le statut génétique, et le circuit intégré 50 valeurs de GCIY, AZ521, KatoIII, SH10, MKN7 , et MKN74 cellules étaient 26,77, 9,98, 24,26, 23,95, 22,29 et 9,45 pmol /L, respectivement (figure 4A). cellules AZ521 et MKN74 étaient plus sensibles à PRL-3 traitement inhibiteur de cellules GCIY et MKN7 qui ont été classés comme des groupes identiques en termes d'expression et de statut génétique, respectivement. A savoir, le statut génétique ou l'expression n'a pas été associée à la sensibilité des cellules GC contre l'inhibiteur PRL-3. une efficacité similaire a été montré dans la formation de colonies indépendante de l'ancrage et la CE 50 valeurs de GCIY, AZ521, SH10, et les cellules MKN74 étaient 6,99, 9,52, 13,05, 9,09 pmol /L, respectivement (figure 4B). les cellules GCIY présentaient une inhibition plus sensible en contraste avec l'anticorps anti-prolifération. En outre, cet inhibiteur aussi robuste abrogea la capacité invasive des cellules GC (Figure 4C). Pour caractériser davantage l'efficacité anticancéreuse de la PRL-3 traitement avec l'inhibiteur, le dosage de l'apoptose a été effectuée (figure 5A). Bien que 1 umol /L de l'inhibiteur était insuffisante pour induire l'apoptose au-delà de la valeur de référence (0 pmol /L), 10 pmol /L de l'inhibiteur robuste provoqué l'apoptose drastique sur toutes les lignées cellulaires testées, où il y avait le double 3 et 11 fois plus important au-delà de la ligne de base dans les cellules GCIY et MKN74, respectivement. Ainsi, PRL-3 inhibiteur réprimé ces propriétés métastatiques sur toutes les lignées cellulaires testées de manière dose-dépendante, et ni le niveau d'expression, ni le statut génétique a montré une corrélation claire avec la sensibilité. Figure 4 une activité anticancéreuse de la PRL-3 inhibiteur. (A) Essai de prolifération après un traitement avec un inhibiteur PRL-3 à des concentrations variant entre 0 et 50 umol /L sur 6 lignées cellulaires avec différents PRL-3 et de l'état d'expression génétique. Avec des cellules traitées avec la solution chimique seul (0 pmol /L PRL-3 inhibiteur) 1,0, le taux de prolifération par rapport à 5 jours après le traitement a été montré dans le panneau de gauche. L'activité proliférative des cellules AZ521 sur 1, 2, 3, ou 4 jours après le traitement a été montré dans le panneau droit. L, une faible expression; H, une expression élevée; D, disomie; P, polysomie; Une amplification; IC50, la concentration inhibitrice 50%. (B) des tests de formation de colonies Anchorage indépendant. images représentatives de la formation de colonies sur les cellules AZ521 (en haut du panneau) et le taux relatif de nombre de colonies (panneau inférieur) ont été présentés. Bars, 200 um; CE50, la concentration efficace à 50%. essai (C) Invasion. images représentatives (en haut du panneau) et le taux invasif relatif (panneau inférieur) ont été présentés. Bars, 200 um; *, P
< 0,05 par t de Student
test, comparativement à 0 pmol /L de PRL-3 inhibiteur; barres d'erreur, SD.
Figure 5 PRL-3 inhibiteur de l'apoptose médiée. essai (A) L'apoptose a été effectuée 72 heures après le traitement avec un inhibiteur PRL-3 (0 à 10 pmol /L). chiffres représentatifs de l'apoptose test sur les cellules AZ521 et C2C12 ont été présentés dans le panneau de gauche, et le pourcentage et SD d'apoptose précoce (en bas du quadrant à droite) et la fin de l'apoptose (quadrant supérieur droit) sont présentés dans chaque panneau. Avec les cellules traitées avec une solution chimique seul (0 pmol /L PRL-3 inhibiteur) 1,0, le taux d'apoptose tardive relative après le traitement a été montré dans le panneau droit. *, P
< 0,05 par t
test de Student, comparativement à 0 pmol /L de PRL-3 inhibiteur. (B) PRL-3 traitement inhibiteur contre les cellules C2C12 musculaires squelettiques normales. cellules C2C12 présentaient un niveau d'expression plus faible de PRL-3 que les cellules du GC par western blot. Essai de prolifération après un traitement avec un inhibiteur PRL-3 a été réalisée. Les barres d'erreur, SD.
Enfin, nous avons évalué si PRL-3 inhibiteur de la cytotoxicité induite dans le muscle squelettique normale, où PRL-3 est principalement exprimé [28]. Les deux tests de prolifération et de l'apoptose ont été réalisées en utilisant des cellules C2C12 musculaires squelettiques normales traitées avec l'inhibiteur, et a montré que 10 pmol /L de l'inhibiteur n'a pas réussi à provoquer antiprolifératif et la réponse apoptotique sur des cellules C2C12 en contraste avec les efficacités de toutes les lignées de cellules GC testées ( Discussion de la
figure 5A et 5B). comme LNM est considéré comme un facteur pronostique important pour GC [29], la recherche des molécules responsables reflétant LNM est une voie prometteuse pour améliorer les résultats. Le lien étroit de LNM avec PRL-3 expression, par conséquent, a un potentiel en tant que nouvelle cible thérapeutique [6, 25]. Cependant, les critères pour la thérapie PRL-3-ciblé n'a pas été établie, et il est essentiel de préciser les caractéristiques de PRL-3
amplification génomique dans les points à la fois mécanistiques et thérapeutiques de vue, en raison du mécanisme majeur de sa expression conséquente et le développement du cancer [10]. Dans la présente étude, nous offrons les indices vitaux pour le développement de cette stratégie thérapeutique contre GC.
La relation entre PRL-3 expression et son amplification génomique n'a jamais été examinée jusqu'à présent. PRL-3
amplification génomique était concordant avec son statut d'expression dans des lignées cellulaires, et a été trouvée dans 20% (8/40) parmi les tumeurs humaines primaires avec l'expression, qui sont toutes les maladies du stade III ou IV (40%, 8 /20), mais dans aucun (0/37) chez ceux sans expression. En outre, PRL-3
amplification génomique a été associée à l'état LNM, conduisant à un stade avancé et les résultats ainsi pauvres chez les patients atteints LNM (P = 0,021)
. Ainsi, PRL-3
amplification génomique peut être la modification plus pertinente pour les LNM, et être l'un des mécanismes prédominants induisant son expression dans le stade plus avancé. Cependant, la plupart des tumeurs exprimant PRL-3 sont amplifiés, en particulier dans la phase earler. Dans les cellules de fibroblastes embryonnaires de souris de type sauvage mais non p53 - /-, PRL-3 est induite d'une manière dépendante de p53 [30]. La mutation p53 ou perte de fonction, cependant, a été documentée dans toutes les lignées de cellules GC utilisées dans la présente étude, à l'exception des cellules NUGC4 (Le site Web TP53, http:.. //P53 free fr /) , ce qui indique qu'il y a un autre mécanisme, indépendamment de la voie p53. PRL-3 expression a été rapportée être régulée au niveau transcriptionnel par les cytokines mitogenes, tels que l'IL-6, IL-21, du HGF ou de l'IGF-1 dans des lignées cellulaires de myélome [24], ou comme le TGF-β dans les lignées cellulaires du cancer du côlon [ ,,,0],31]. Récemment, la protéine Polyc-ARN de liaison 1 (PCBP1) a été identifié comme un régulateur de translation du PRL-3 [32]. Les mécanismes alternatifs au niveau de la transcription ou de la traduction peuvent être impliqués pour réguler PRL-3 expression.
Nous avons également confirmé que siRNA médiation knockdown PRL-3 réprimée de manière significative la prolifération cellulaire et l'invasion en ligne avec les rapports précédents pour d'autres lignées de cellules GC [25 27], et en outre pour la première fois mis en évidence la réduction de l'effet de la formation de colonies dans des conditions d'ancrage indépendant, qui soutient PRL-3 peut être cible thérapeutique attrayante contre GC.

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