| Stomach Health > magen Hälsa >  > Stomach Knowledges > undersökningar

P27Kip1, regleras av glykogensyntaskinas-3β, resulterar i HMBA-inducerad differentiering av humana gastriska cancerceller

P27 Kip1, regleras av glykogensyntaskinas-3β, är resultaten i HMBA-inducerad differentiering av humana gastriska cancerceller Bild Sammanfattning
Bakgrund
Gastric cancer den näst vanligaste orsaken till den globala cancerrelaterad dödlighet . Även dedifferentiering förutspår dålig prognos i magcancer, den molekylära mekanismen underliggande dedifferentiering, vilket skulle kunna ge grundläggande insikter i tumörutveckling och progression, har ännu inte klarlagts. Dessutom den molekylära mekanismen bakom effekterna av hexametylenbisacetamid (HMBA), en nyligen upptäckt differentiering inducerare kräver utredning och det finns inga rapporterade studier om effekten av HMBA på magcancer.
Metoder
Baserat på resultaten av FACS-analys, halterna av proteiner involverade i cellcykeln eller apoptos bestämdes med användning av western blotting efter enstaka behandlingar och sekventiella kombinationer av HMBA och LiCl. GSK-3β och protonpumps undersöktes genom western blotting efter uppreglering Akt uttryck av Ad-Akt infektion. För att undersöka effekterna av HMBA på protein lokalisering och verksamhet GSK-3β, CDK2 och CDK4, kinasanalyser, immunfällning och Western blotting utfördes. Därutöver har northern blotting och RNas-skyddsanalyser genomförs för att bestämma den funktionella koncentrationen av HMBA.
Resultat
HMBA ökade p27Kip1 expression och inducerades cellcykelstopp associerad med gastrisk epitelial celldifferentiering. Dessutom behandlar mag-härledda celler med HMBA-inducerad G0 /G1 gripande och uppreglering av protonpumps, en markör för magcancer differentiering. Dessutom behandling med HMBA ökade uttrycket och aktiviteten av GSK-3β i kärnan men inte cytosolen. HMBA minskad CDK2-aktivitet och inducerade p27Kip1 uttryck, som skulle kunna räddas genom hämning av GSK-3β. Vidare ökade HMBA p27Kip1 bindning till CDK2, och detta upphävdes genom GSK-3β hämning.
Slutsatser
De resultat som presenteras häri antyder att GSK-3p funktioner genom att reglera p27Kip1 montering med CDK2, därigenom spela en kritisk roll i G0 /G1 gripande i samband med HMBA-inducerad gastrisk epitelial celldifferentiering.
Nyckelord
HMBA magcancer GSK-3β bakgrund
gastric cancer är en av de vanligaste formerna av cancer i världen och ofta utvecklar resistens mot kemoterapi och strålning behandlingar. Därför har kombinationsbehandling föreslagits för att lösa sjukdomen bättre och för att minska sannolikheten för utveckling av resistens [1]. Hexametylenbisacetamid (HMBA), en hybrid polär förening (HPC) utvecklades ursprungligen som ett differentierings-inducerande medel [2-6], som orsakar gastrisk omval av en cell differentiering [7-9].
I magen, stamceller i proliferativ cellzonen i isthmus regionen av de gastriska körtlar differentierar och ger upphov till olika celltyper [10, 11]. När den första tumörframkallande evenemanget äger rum, ytterligare tumörprogression beror på vilken typ av inledande händelsen och utvecklingsstadiet av cellen som upprätt det och ytterligare mutationer som kan uppstå. Konstant ökning är en viktig egenskap hos stamceller, och i gastrointestinala vävnader mutationer sannolikt att resultera i expansion av förändrade stamceller, vilket ökar sannolikheten för ytterligare mutationer och tumörprogression [12]. Därför är det troligt att vara det mest effektiva sättet att behandla magcancer inriktning gastric cancerstamceller. Ungefär 50% av den västra befolkningen utvecklar metaplasi, ett viktigt steg i utvecklingen av cancer [13], uppmärksamma vägar som styr proliferation och därmed celldifferentiering. Bland dessa, TGF-b, MYB, Wnt och Hedgehog vägar är av särskild betydelse, med framträdande i cell öde specifikation och mönster bildas under fosterutvecklingen och vuxna förnyelse vävnad. Klarlägga komplexa tumörsuppressor och accelerator signalvägar, som åstadkommer differentiering modulering av övergångs /progenitorceller, kommer att vara avgörande för optimering av behandlingar för magcancer.
För omogna gastric celler att differentiera, de behöver för att bo i G1-fasen av cellcykeln under en viss tidsperiod. Däggdjurscellcykeln regleras genom sekventiell aktivering och inaktivering av en mycket konserverad familj av cyklinberoende kinaser (CDK: er); progression genom början till mitten av G1 är beroende av CDK4 och eventuellt CDK6, medan progression genom sent G1 och S-fasen kräver aktivering av CDK2. Verksamheten i CDK kan inhiberas genom bindning av CDK-hämmande proteiner inklusive Cip /Kip familj (p21 Waf1, P27 Kip1 och p57 Kip2) och INK4 familj (p15Ink4b, p16INK4a, p18Ink4c och p19Ink4d ). P27 Kip1 regleras posttranskription genom proteolytisk nedbrytning. CDK2 binder till p27 Kip1 och fosforylerar det på treonin 187 [14], och HMBA-inducerad gastrisk celldifferentiering är associerad med uppreglering av p27 Kip1 [15, 16] och G0 /G1 gripande. Det finns dock några detaljerade studier om molekylära mekanismen för HMBA och det har förekommit några rapporterade studier som undersöker effekten av HMBA på magcancer.
Som nedströms mål av fosfatidylinositol-3-kinas /Akt (PI3-kinas /Akt ) vägen reglerar GSK-3β celltillväxt och differentiering [17-20]. Ackumulerande bevis tyder på att hypoaktivt GSK3P signalering, som fungerar i G1 för att ta emot inmatning från flera signalering och utvecklingsvägar, förekommer i samband med olika humana cancer [21, 22]. GSK-3β har varit inblandad i flera biologiska processer eftersom den fosforylerar ett brett spektrum av substrat inklusive flera differentieringskontrollpunkter inklusive c-Myc, snigel och PI3K [23]. Tidigare var hämning av PI3-kinasvägen visat sig förstärka HMBA-medierad gastric celldifferentiering [8]. I denna studie var den roll GSK-3β under gastric celldifferentiering undersöktes med användning av den humana magcancer cellinje SGC7901, som visar en multi fenotyp och representerar en väldefinierad modell av gastric differentiering. Resultaten tyder på en bidragande roll för GSK-3β i p27 Kip1 pathway under gastric celldifferentiering induceras av HMBA.
Methods
Cellodling
magcancer-cellinjen SGC7901 erhölls från cellbanken i den kinesiska vetenskapsakademin och odlades som tidigare beskrivits [24]. SGC7901 celler infekterades med ett adenovirus som kodar för den aktiverade formen av Akt (Ad-Akt) eller den adenovirala styrvektor som kodar för β-galaktosidas (β-gal) vid en multiplicitet av infektion (MOI) på 10 pfu /cell. Efter infektion med vektorerna för en timme, följt av ersättning av medium och inkubation under ytterligare 24 h, behandlades cellerna i närvaro eller frånvaro av HMBA, och protein och RNA extraherades under västra och Northern blotting, respektive.
Material
HMBA, TSA, SB-415286 och LiCl köptes från Sigma Chemical Company, USA. Adenovirus-vektorer som kodar för β-gal och myristoylerade aktiva formen av Akt (Ad-Akt) köptes från Cell BioLabs, USA. Vektorn som kodar för det katalytiskt aktiva mutant av GSK3P (HA-GSK-3βCA) köptes från Addgene. Icke inriktning kontroll siRNA och SMARTpool för att rikta GSK-3β köptes från Dharmacon, USA. Alla prober märktes med en Biotin Random Prime DNA Labeling Kit (Pierce).
Antikroppar
Kanin-anti-Akt, anti-fosfo-Akt (Ser473) och antiphospho-GSK-3β (Ser9) köptes från Cell Signa , USA. Mus-anti-GSK-3β, mus-anti-p27 Kip1, mus-anti-Top IIb och mus-anti-p21 Waf1 köptes från BD Biosciences, USA. Mus-anti-fosfo-GSK-3 (Tyr278 /Tyr216) erhölls från Upstate, USA. Kanin anti-kluvna PARP-antikropp köptes från Abcam, USA. Anti-protonpumps köptes från MBL International (USA). Polyklonal anti-CDK2, anti-CDK4, anti-α-tubulin och anti-kaspas-3 erhölls från Santa Cruz Biotechnology (USA).
Sub-cellulärt protein extraktion och western blotting
Kärn- och cytosoliska fraktionerna extraherades med hjälp av en NE-PER nukleära och cytoplasmiska extraktionsreagens kit (Pierce, USA). Cytosoliskt protein (80 mg) eller nukleärt protein (20 mg) upplöstes på en 10% polyakrylamidgel och överfördes till PVDF-membran såsom beskrivits tidigare [25]. Filtren inkuberades under en timme vid rumstemperatur i blottnings lösning. Membranen inkuberades över natten vid 4 ° C med primära antikroppar följt av blotting med en pepparrotsperoxidas-konjugerad sekundär antikropp under en timme, och visualiserades med användning av ett ECL-detekteringssystem.
Northern blotting och RNas-skyddsanalyser (RPA) Review Totalt RNA framställdes med användning av TRIzol-reagens (Invitrogen). Prover kördes på 1,2% agaros /formaldehyd geler och överfördes till stöd nitrocellulosa. Membran hybridiserades med en biotinmärkt protonpumps cDNA-sond. Efter hybridisering med GAPDH-prob, en laddningskontroll tvättades membranen och signaler detekterades med användning av ett ECL-detekteringssystem. RNas-skyddsexperiment utfördes med användning av RPA-III kit från Ambion och RiboQuant MultiProbe RNas Protection Assay System utnyttjades för att detektera multipla specifika mRNA. 32P-märkt antisens-RNA-sonder framställdes med användning av Human Apoptosis HCC-2 och hCYC-1 Mall set och hybridiseringar utfördes enligt tillverkarens protokoll.
Cellcykelanalys
Gastric cancerceller skördades med hjälp av trypsin . Celler uppsamlades, tvättades två gånger med iskall PBS och fixerades i iskall 70% etanol. Efter tvättning två gånger med iskall PBS, resuspenderades i PBS innehållande 100 U /ml RNas A och inkuberades vid 37 ° C under 30 min, färgades cellerna med PI (20 mg /ml) och analyserades med användning av FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), såsom beskrivits tidigare [25].
In vitro
kinasanalyser
Aktiviteterna av CDK2, CDK4 och GSK-3β mättes såsom tidigare beskrivits [26, 27]. I korthet CDK2, CDK4 eller GSK-3β immunoutfälldes från cytosoliskt (100 mg protein) eller nukleära (25 mg protein) extrakt. Kinasaktiviteten mättes genom att inkubera immunoprecipiterade CDK2, CDK4 eller GSK-3β i 40 ml kinasbuffert med 4 mg rekombinant Snail protein (för att mäta GSK-3β-associerad kinasaktivitet), 5 mg histon H1 (för att mäta CDK2-associerad kinas aktivitet) eller retinoblastom-proteinet (för att mäta CDK4-associerad kinasaktivitet) vid 30 ° C under 30 min. Proverna bearbetades enligt beskrivning i tidigare rapporter [28].
Resultat
Hämning av GSK-3β dämpar HMBA-inducerad cellcykelstopp och SGC7901 celldifferentiering
SGC7901 celler ackumulerade vid G0 /G1-cellcykelkontrollpunkten och differentieras till en enterocyten liknande fenotyp efter behandling med HMBA [29]. GSK-3β bidrar till inhibition av cellcykelprogression i differentierande celler [20, 30]. Följaktligen om GSK-3β spelar en roll i HMBA-inducerad SGC7901 cellcykelhämning undersöktes. Såsom visas i figur 1a, att behandling med HMBA-inducerad celler ansamlas vid G0 /G1-cellcykelkontrollpunkten. Behandling med litiumklorid (LiCl), som hämmar GSK-3β i en Mg 2+ konkurrenskraftigt sätt [31], ökade andelen av celler i S-fasen. Behandling med en kombination av LiCl och HMBA omvänd HMBA-medierad G1 cell stillestånd. Liknande resultat erhölls efter behandling med SB-415286, en potent hämmare av GSK-3β [32] (Ytterligare fil 1). Dessa resultat tyder på att GSK-3β skulle kunna spela en roll i HMBA-inducerad G1 gripande. För att bestämma huruvida HMBA resulterade i celldöd under 24 timmar långa behandlingsperioden, var protein extraherat att bedöma om det ökade PARP klyvning och /eller aktivt kaspas-3. Som visas i Figur 1b, fanns ingen ökning av PARP klyvning och aktiv kaspas-3 tills 48 timmar efter HMBA behandling. En viktig tidig händelse i terminalen differentiering av celler är deras tillbakadragande från cellcykeln [6]. Eftersom GSK-3β dokumenteras för att spela en roll i cellcykelstopp [33], var det postulerade att hämning av GSK-3β kunde hämma differentiering. Därför effekterna av GSK-3p-hämmare på induktion av HMBA-medierad protonpumps uttryck, en markör för gastric differentiering, undersöktes. SGC7901 Cellerna förbehandlades med LiCl (figur 1c och 1d) eller SB-415286 (Figur 1e och 1f) vid olika koncentrationer för en timme, och behandlades sedan med HMBA i 24 timmar. LiCl inhiberade HMBA-inducerad protonpumps uttryck i en dosberoende sätt. I överensstämmelse med dessa resultat, SB-415.286 blockerade protonpumps protein och mRNA-expression, som framkallades av HMBA. Sammantaget indikerar dessa resultat att GSK-3β spelar en viktig roll i HMBA-förmedlad gastric celldifferentiering. Figur 1 Hämning av GSK-3β dämpar HMBA-inducerad cellcykelstopp och SGC7901 celldifferentiering. A, SGC7901 Cellerna förbehandlades med eller utan 10 mM LiCl under 30 min följt av kombinationsbehandling med 10 mM HMBA under 24 h, följt med bestämning av DNA-innehåll genom flödescytometri. B, SGC7901 celler behandlades med HMBA (10 mM) under 24 h eller 48 h och var förberedda för western blotting-analys. C & E, SGC7901 Cellerna förbehandlas med eller utan 10 mM LiCl eller 10 μMSB-415286 under en timme följt av kombinationsbehandling med 10 mMHMBA under 24 timmar. protonpumpsuttrycksstatus bestämdes via western blotting-analys. D & F, extraherades totalt RNA från celler och Q-RT-PCR-analys för protonpumps mRNA-uttryck utfördes. (Data representerar medelvärde ± SD; * = p < 0,05 mot kontroll; * = p < 0,05 vs. HMBA ensam.) Katalog Akt reglerar gastric differentiering induceras av HMBA
GSK-3β inaktiveras när det. fosforyleras nedströms av Akt [34]. Därför skulle det förutsägas att aktivering av Akt genom PI3-kinas skulle vara förknippad med hämning av GSK-3β och därefter inhibering av gastrisk celldifferentiering. För att testa denna hypotes, var SGC7901 celler infekterade med Ad-Akt eller en kontrollvektor. Infektion med Ad-Akt ökat uttryck av fosforylerad Akt, Akt och fosforylerades GSK-3β protein (figur 2a), i överensstämmelse med tidigare resultat som visar att GSK-3p fungerar som ett substrat av Akt. Som visas i figur 2b, infektion av SGC7901 celler med Ad-Akt adenovirusvektor enbart hade ingen effekt på protonpumps och mRNA-expression. Men infektion med Ad-Akt vektor resulterade i hämning av protonpumps mRNA-expression induceras av HMBA jämfört med HMBA och infektion av kontroll (β-gal) adenovirus, vilket tyder på att signalera genom PI3-kinas /Akt signalvägen reglerar gastric cell differentiering inducerad av HMBA behandling. Figur 2 Akt reglerar gastric differentiering induceras av HMBA. A, Cytosol och nukleära proteiner extraherades från celler som behandlats såsom anges och upplöstes på SDS-PAGE och blottades med anti-fosfo-Akt, -Akt, fosfo-GSK-3β, och GSK-3β, med användning av anti-α-tubulin och Topo IIβ som kontroll av cytosoliska och nukleära fraktioner respektive. B, protonpumps uttryck mättes med användning av western blotting följde med överflöd kvantifiering. (Data representerar medelvärde ± SD; * = p < 0,05 mot kontroll; † = p < 0,05 jämfört med enbart HMBA.). C, Totalt RNA (40 ^ g) fraktionerades, överfördes till nitrocellulosamembran och sonderades med en märkt protonpumps cDNA; Blottarna strippades och reprobed med GAPDH.
Behandling med HMBA ökade uttrycket och aktiviteten av GSK-3β i kärnan
För att testa huruvida GSK-3β var påverkad av HMBA behandling togs GSK-3β aktivitet bestämdes genom mätning av fosforylering av rekombinant Snail, en väl karakteriserad substrat av GSK-3β [35, 36]. GSK-3β är belägen i den cytosoliska och nukleära avdelningar i celler, men till övervägande del i cytoplasman under G1-fasen. Därför nukleära och cytoplasmiska proteiner fraktionerades från kontroll och HMBA-behandlade celler och undersöktes för GSK-3β aktivitet. HMBA behandling resulterade i en ökning i aktiviteten av kärn GSK-3β (figur 3a), och GSK-3β hämning dämpas HMBA-medierad G1 stillestånd, vilket tyder på en roll för GSK-3β i HMBA-inducerad cellcykelstopp. Ser9 fosforylering av GSK-3β minskar GSK-3β-aktivitet, medan Tyr216 fosforylering ökar GSK-3β-aktivitet [37]. Att analysera de mekanismer som ligger till grund ökat GSK-3β-aktivitet orsakad av HMBA behandling, Ser9-fosforylerade och Tyr216-fosforylerad GSK-3β proteinexpression bestämdes med användning av western blotting. HMBA behandling ökade nukleära expressionsnivåer av totalt GSK-3β och Tyr216-fosforylerad GSK-3β utan att påverka deras expression i cytosolen (Figur 3b). Intressant nog ökade HMBA behandling Ser9-fosforylerad GSK-3β proteinuttryck i både cytosoliska och nukleära fraktioner. Liknande resultat erhölls efter behandling med andra HPC, SAHA och EMBA (Ytterligare fil 2). Dessutom ökade HPC aktiviteten hos GSK-3β i kärnan, vilket framgår av in vitro
kinasanalyser (ytterligare en fil 3). Dessa resultat tyder på att HPC ökar kärn GSK-3β aktivitet oberoende av fosforylering vid Ser9. Figur 3 Behandling med HMBA ökade uttrycket och aktiviteten av GSK-3β i kärnan. A, SGC7901 celler behandlades med (+) eller utan (-) 10 mMHMBA under 24 h och skördades vid slutet av behandlingen. Cytosolen och nukleära fraktioner framställdes och GSK-3β analyserades genom in vitro-kinasanalys med hjälp av Snail protein som substrat. Fosforylerad Snail protein signaler densitometriskt kvantifieras och uttrycks som flerfaldiga förändringen i förhållande till obehandlade kontrollgrupper. B, SGC7901 celler behandlades med 10 mM HMBA under olika tider. Cytosoliska och kärnproteinfraktioner extraherades och western blotting utfördes med användning av antikroppar mot GSK-3β, fosfo-GSK-3β (Ser9), fosfo-GSK-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-tubulin eller Topo IIβ.
hämning av GSK-3β åsido HMBA-inducerad CDK2 hämning
Progression genom G1 är beroende av CDK2 och CDK4 [38, 39]. För att bestämma huruvida GSK-3β reglering av HMBA-medierad G1-cellcykeluppehåll sker via CDK2 eller CDK4 inhibering, SGC7901 Cellerna förbehandlades med LiCl (figur 4a) eller SB-415286 (figur 4b) och utsattes sedan för kombinationsbehandling med HMBA under 24 h före immunfällningsanalyser utfördes på cellysaten med hjälp av anti-CDK2 eller anti-CDK4-antikroppar, respektive. Dessutom har CDK2 eller CDK4-aktivitet bestämdes med användning av en in vitro
kinasanalys. Behandling med HMBA enbart inhiberade CDK2-aktivitet (övre, vänstra panelen) men ökade CDK4 aktivitet (övre högra panelen); inhibition av GSK-3β med användning LiCl eller SB-415286 signifikant försvagade HMBA hämning av CDK2-aktivitet (botten). Behandling med HMBA ökade uttrycket och aktiviteten av GSK-3β i kärnan. Sammantaget antyder dessa resultat att GSK-3β bidrar till HMBA-medierad G1-cellcykeluppehåll genom hämning av CDK2. Figur 4 Hämning av GSK-3β åsido HMBA-inducerad CDK2 inhibition. SGC7901 Cellerna förbehandlades med (+) eller utan (-) 10 mM LiCl (A) eller 10
  • magen artiklar
    •   
  • gastrisk struktur
    •   
  • Skötsel av magen
    •   
  • undersökningar

    • undersökningar

    undersökningar

    Other Languages

    FöräldraskapSkönhetSjukdomKultur NöjeHälsaLiv

    magen Hälsa © https://www.stomachillness.com/sv