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P27Kip1, regolato da glicogeno sintasi chinasi-3β, si traduce in differenziazione HMBA-indotta delle cellule di cancro gastrico umano

P27 Kip1, regolata da glicogeno sintasi chinasi-3β, si traduce in differenziazione HMBA-indotta delle cellule di cancro gastrico umano
Abstract
sfondo
cancro gastrico è la seconda causa più comune di morte per cancro globale . Anche se dedifferentiation prevede cattiva prognosi nel cancro gastrico, il meccanismo molecolare alla base de-differenziazione, che potrebbe fornire intuizioni fondamentali in sviluppo del tumore e la progressione, è ancora da chiarire. Inoltre, il meccanismo molecolare alla base degli effetti della esametilen bisacetamide (HMBA), un induttore differenziazione scoperto di recente, richiede indagini e non ci sono studi riportati sugli effetti di HMBA sul cancro gastrico.
Metodi commercio basato sui risultati di analisi FACS, i livelli di proteine ​​coinvolte nel ciclo cellulare o apoptosi sono stati determinati utilizzando western blotting dopo trattamenti singoli e combinazioni sequenziali di HMBA e LiCl. GSK-3β e pompa protonica sono stati studiati mediante western blotting dopo up-regolazione dell'espressione Akt da infezione da Ad-Akt. Per studiare gli effetti di HMBA sulla localizzazione delle proteine ​​e le attività di GSK-3β, CDK2 e CDK4, saggi di chinasi, immunoprecipitazione e western blotting sono state eseguite. Inoltre, Northern blotting e saggi di protezione RNasi sono state eseguite per determinare la concentrazione funzionale di HMBA.
Risultati
HMBA aumentata espressione p27Kip1 e indotta arresto del ciclo cellulare associata con gastrica differenziazione delle cellule epiteliali. Inoltre, il trattamento di cellule gastriche di derivazione con G0 /G1 arresto HMBA indotto e up-regolazione della pompa protonica, un marker di differenziazione cancro gastrico. Inoltre, il trattamento con HMBA aumentato l'espressione e l'attività di GSK-3β nel nucleo, ma non il citoplasma. HMBA diminuita attività CDK2 e di espressione p27Kip1 indotta, che potrebbe essere salvato da inibizione della GSK-3β. Inoltre, HMBA aumentato p27Kip1 legame CDK2, e questo è stato soppresso con l'inibizione della GSK-3β.
Conclusioni
I risultati presentati nel presente documento indicano le funzioni che la GSK-3beta regolando assemblaggio p27Kip1 con CDK2, giocando così un ruolo critico nella G0 /G1 arresto associato gastrica differenziazione delle cellule epiteliali HMBA-indotta.
Parole
HMBA cancro gastrico GSK-3β Sfondo
cancro gastrico è uno dei tumori più comuni nel mondo e spesso si sviluppa la resistenza alla chemioterapia e radiazioni trattamenti. Pertanto, la terapia di combinazione è stato proposto di affrontare meglio la malattia e ridurre la probabilità di sviluppare resistenza [1]. Esametilen bisacetamide (HMBA), un composto polare ibrido (HPC), originariamente sviluppato come un agente che induce differenziazione [2-6], provoca gastrico delle cellule ri-differenziazione [7-9].
Nello stomaco, le cellule staminali del zona di cellule proliferative della regione istmo di ghiandole gastriche differenziare e dare luogo a diversi tipi di cellule [10, 11]. Una volta che il primo evento tumorigenica avviene, ulteriore progressione tumorale dipende dalla natura dell'evento avviare e lo stadio di sviluppo della cella che sostenuto e ulteriori mutazioni che potrebbero verificarsi. proliferazione costante è una caratteristica fondamentale delle cellule staminali, e nei tessuti gastrointestinali mutazioni sono suscettibili di provocare l'espansione delle cellule staminali alterate, aumentando la probabilità di ulteriori mutazioni e la progressione del tumore [12]. Pertanto, il targeting cellule staminali del cancro gastrico è probabile che sia il modo più efficace per il trattamento del cancro gastrico. Circa il 50% della popolazione occidentale sviluppa metaplasia, un passo fondamentale nello sviluppo del cancro [13], attirando l'attenzione di percorsi che controllano la proliferazione e, quindi, la differenziazione cellulare. Tra questi, il TGF-b, percorsi Myb, Wnt e riccio sono di particolare rilevanza, con ben visibile nella specifica cellula-destino e formazione di pattern durante l'embriogenesi e adulti rinnovamento dei tessuti. La spiegazione di soppressore tumorale complessa e vie di segnalazione di acceleratore, che effetto differenziazione modulazione delle cellule di transizione /progenitrici, sarà fondamentale per l'ottimizzazione di terapie per il trattamento di cancro gastrico.
Affinché cellule gastriche immature per differenziare, cui hanno bisogno per rimanere in la fase G1 del ciclo cellulare per un certo periodo di tempo. Il ciclo cellulare dei mammiferi è regolato dall'attivazione sequenziale e l'inattivazione di una famiglia altamente conservata delle chinasi ciclina dipendente (CDK); progressione attraverso prima metà di G1 dipende CDK4 e possibilmente CDK6, mentre la progressione attraverso tarda G1 e la fase S richiede l'attivazione di CDK2. Le attività di CDK possono essere inibiti dal legame di CDK proteine ​​inibitorie compresa la famiglia Cip /Kip (p21 Waf1, p27 Kip1 e p57 KIP2) e la famiglia INK4 (p15Ink4b, p16Ink4a, p18Ink4c e p19Ink4d ). P27 Kip1 è regolata post-trascrizionale dalla degradazione proteolitica. CDK2 lega a p27 Kip1 e fosforila su treonina 187 [14], e HMBA indotta differenziazione cellulare gastrica è associata con l'up-regolazione di p27 Kip1 [15, 16] e G0 /G1 arresto. Tuttavia, ci sono pochi studi dettagliati concernenti il ​​meccanismo molecolare di HMBA e non ci sono stati studi riportati che studiano l'effetto di HMBA sul cancro gastrico.
Come un obiettivo a valle del fosfatidilinositolo-3-chinasi /Akt (PI3-chinasi /Akt ) percorso, GSK-3β regola la proliferazione e la differenziazione cellulare [17-20]. Accumulando prove indicano che ipoattivo segnalazione GSK3β, che funziona in G1 per ricevere input da diversi segnali e percorsi di sviluppo, si verifica in associazione con diversi tumori umani [21, 22]. GSK-3β è stato implicato in diversi processi biologici perché fosforila una vasta gamma di supporti tra cui diversi posti di blocco di differenziazione tra cui c-Myc, lumaca e PI3K [23]. In precedenza, l'inibizione del pathway PI3-chinasi ha mostrato di migliorare HMBA mediata differenziazione cellulare gastrica [8]. In questo studio, il ruolo di GSK-3β durante la differenziazione cellulare gastrica è stata studiata utilizzando la gastrica linea di cellule umane di cancro SGC7901, che mostra un fenotipo multipotenti e rappresenta un modello ben caratterizzato di differenziazione gastrica. I risultati suggeriscono un ruolo contributivo per GSK-3β nel p27 percorso Kip1 durante la differenziazione delle cellule gastriche indotte da HMBA.
Metodi
cultura cellulare
La linea di cellule di cancro gastrico SGC7901 è stato ottenuto dalla banca di cellule presso l'Accademia Cinese delle Scienze e coltivate come descritto in precedenza [24]. SGC7901 cellule sono state infettate con un adenovirus codificante la forma attivata di Akt (Ad-Akt) o il controllo adenovirale codifica vettore β-galattosidasi (β-gal) ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10 pfu /cell. Dopo l'infezione con vettori per un'ora, seguita da sostituzione del mezzo e l'incubazione per altre 24 ore, le cellule sono state trattate in presenza o assenza di HMBA e proteine ​​e RNA sono stati estratti per occidentale e Northern blotting, rispettivamente.
Materiali
HMBA, TSA, SB-415286 e LiCl sono stati acquistati da Sigma Chemical Company, stati Uniti d'America. vettori adenovirus codificanti β-gal e la forma attiva myristoylated di Akt (Ad-Akt) sono stati acquistati dalla cellula BioLabs, Stati Uniti d'America. Il vettore che codifica il mutante cataliticamente attiva di GSK3β (HA-GSK-3βCA) è stato acquistato da Addgene. il controllo siRNA e la SmartPool non-targeting per il targeting GSK-3β sono stati acquistati da Dharmacon, Stati Uniti d'America. Tutte le sonde sono state marcate con un Labeling Kit biotina a caso il primo DNA (Pierce).
Anticorpi
Rabbit anti-Akt, anti-fosfo-Akt (ser473) e antiphospho-GSK-3β (ser9) sono stati acquistati da Cell Signaling , STATI UNITI D'AMERICA. Mouse anti-GSK-3β, mouse anti-p27 Kip1, mouse anti-Top IIb e topo anti-p21 Waf1 sono stati acquistati da BD Biosciences, Stati Uniti d'America. Mouse anti-fosfo-GSK-3 (Tyr278 /Tyr216) è stato ottenuto da Upstate, Stati Uniti d'America. Coniglio di anticorpi anti-PARP spaccati è stato acquistato da Abcam, Stati Uniti d'America. pompa anti-protone è stato comprato da MBL International (USA). Policlonale anti-CDK2, anti-CDK4, anti-α-tubulina e anti-caspasi-3 sono stati ottenuti da Santa Cruz Biotechnology (USA)
. Estrazione di proteine ​​sub-cellulare e Western Blotting
nucleare e frazioni citosoliche sono stati estratti utilizzando un kit NE-PER nucleare e citoplasmatica estrazione reagenti (Pierce, Stati Uniti d'America). proteina citoplasmatica (80 mg) o proteine ​​nucleari (20 mg) è stato risolto su un gel di poliacrilammide al 10% e trasferite su membrane di PVDF come precedentemente descritto [25]. I filtri sono stati incubati per un'ora a temperatura ambiente in soluzione assorbente. Le membrane sono state incubate overnight a 4 ° C con anticorpi primari seguito da blotting con un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano per un'ora, e visualizzati utilizzando un sistema di rivelazione ECL.
Northern blotting e saggi di protezione da RNasi (RPA)
Totale RNA è stato preparato utilizzando il reagente TRIzol (Invitrogen). I campioni sono stati analizzati su gel di agarosio 1,2% /formaldeide e trasferite su nitrocellulosa supportato. Le membrane sono state ibridate con una sonda di pompa protonica gastrica cDNA biotina. Dopo l'ibridazione con la sonda GAPDH, controllo di caricamento, le membrane sono state lavate e segnali sono stati rilevati utilizzando un sistema di rivelazione ECL. esperimenti di protezione RNase sono stati eseguiti utilizzando il kit RPA-III da Ambion e il sistema di analisi RiboQuant Multiprobe RNase protezione è stata utilizzata per rilevare più specifici mRNA. 32P-etichettati sonde RNA antisenso sono state utilizzate le HCC-2 e hCYC-1 Imposta modello Apoptosis umana e sono state eseguite ibridazioni secondo il protocollo del produttore. Analisi del ciclo cellulare

cellule di cancro gastrico sono state raccolte utilizzando tripsina . Le cellule sono state raccolte, lavate due volte con PBS freddo e fissati in ghiacciata etanolo al 70%. Dopo essere stati lavati due volte con PBS freddo, risospese in PBS contenente 100 U /ml RNasi A e incubate a 37 ° C per 30 minuti, le cellule sono state colorate con PI (20 mg /ml) e analizzati utilizzando FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), come descritto in precedenza [25].
in vitro
chinasi saggi
Le attività di CDK2, CDK4 e GSK-3β sono stati misurati come descritto in precedenza [26, 27]. In breve, CDK2, CDK4 o GSK-3β sono stati immunoprecipitati da citosolico (100 mg di proteina) o nucleare (25 mg di proteina) estratti. chinasi attività è stata misurata incubando immunoprecipitato CDK2, CDK4 o GSK-3β in 40 ml di tampone chinasi con 4 mg di proteina ricombinante Lumaca (per misurare l'attività chinasi GSK-3β-associato), 5 mg di istone H1 (per misurare la chinasi CDK2-associato attività) o proteina del retinoblastoma (per misurare l'attività chinasi CDK4-associato) a 30 ° C per 30 min. I campioni sono stati trattati come descritto nelle precedenti relazioni [28]
. Risultati
inibizione di GSK-3β attenua HMBA indotta arresto del ciclo cellulare e la differenziazione cellulare SGC7901
SGC7901 cellule accumulati al G0 /G1 del ciclo cellulare checkpoint e differenziato in un fenotipo enterociti simile dopo il trattamento con HMBA [29]. GSK-3β contribuisce alla inibizione della progressione del ciclo cellulare in cellule differenzianti [20, 30]. Pertanto, se la GSK-3β gioca un ruolo nell'inibizione del ciclo cellulare SGC7901 HMBA-indotta è stata studiata. Come dimostrato nella Figura 1a, il trattamento con cellule HMBA indotto ad accumularsi sul G0 /G1 del ciclo cellulare checkpoint. Il trattamento con cloruro di litio (LiCl), che inibisce la GSK-3β in un Mg 2 + modo competitivo [31], ha aumentato la percentuale di cellule in fase S. Il trattamento con una combinazione di LiCl e HMBA invertito HMBA mediata arresto delle cellule G1. Risultati simili sono stati ottenuti dopo il trattamento con SB-415286, un potente inibitore della GSK-3β [32] (sui file 1). Questi risultati suggeriscono che la GSK-3β potrebbe svolgere un ruolo in G1 arresto HMBA-indotta. Per determinare se HMBA ha provocato la morte delle cellule durante il periodo di trattamento di 24 ore, la proteina è stato estratto per determinare se vi è stata aumentata PARP scissione e /o attivo caspasi-3. Come dimostrato nella figura 1b, non vi era alcun aumento di PARP scissione e attiva caspasi-3 fino a 48 ore dopo il trattamento HMBA. Un importante evento precoce nella differenziazione terminale delle cellule è la loro ritiro dal ciclo cellulare [6]. Dal momento che GSK-3β è documentata a svolgere un ruolo di arresto del ciclo cellulare [33], è stato postulato che l'inibizione di GSK-3β potrebbe inibire la differenziazione. Pertanto, gli effetti degli inibitori GSK-3beta sulla induzione dell'espressione della pompa protonica gastrica HMBA-mediata, un marker di differenziazione gastrica, sono stati esaminati. SGC7901 cellule sono state pre-trattate con LiCl (Figura 1c e 1d) o SB-415286 (Figura 1e e 1f) a varie concentrazioni per un'ora, e poi trattati con HMBA per 24 h. LiCl inibisce l'espressione della pompa protonica gastrica HMBA indotta in maniera dose-dipendente. Coerentemente con questi risultati, SB-415286 bloccato gastrico proteine ​​della pompa protonica e di espressione di mRNA, che è stata indotta da HMBA. Presi insieme, questi risultati indicano che la GSK-3β svolge un ruolo importante in HMBA mediata differenziazione delle cellule gastriche. Figura 1 L'inibizione di GSK-3β attenua HMBA indotta arresto del ciclo cellulare e la differenziazione delle cellule SGC7901. A, SGC7901 cellule sono stati pre-trattati con o senza 10 mM LiCl per 30 minuti seguita da trattamento combinazione con 10 mM HMBA per 24 h, seguito con quantificazione del contenuto di DNA mediante citometria di flusso. B, SGC7901 cellule sono state trattate con HMBA (10 mm) per 24 ore o 48 ore e sono stati preparati per l'analisi western blotting. C & E, SGC7901 le cellule sono state pre-trattati con o senza 10 mM LiCl o 10 μMSB-415286 per un'ora seguita da trattamento di combinazione con 10 mMHMBA per 24 h. protonica stato espressione della pompa è stato determinato attraverso l'analisi western blotting. D & F, l'RNA totale è stato estratto dalle cellule ed è stata effettuata l'analisi Q-RT-PCR per l'espressione di mRNA pompa protonica. (I dati rappresentano media ± DS; * = p < 0,05 vs. controllo; * = p < 0,05 vs HMBA da sola.)
Akt regola la differenziazione gastrico indotto da HMBA
GSK-3β è inattivato quando. è fosforilata valle di Akt [34]. Pertanto, sarebbe possibile prevedere che l'attivazione di Akt da PI3-chinasi sarebbe associato con l'inibizione di GSK-3β e, successivamente, l'inibizione del differenziamento cellulare gastrica. Per verificare questa ipotesi, SGC7901 cellule sono state infettate con Ad-Akt o un vettore di controllo. L'infezione con Ad-Akt aumentata espressione di fosforilata Akt, Akt e fosforilata GSK-3β proteine ​​(Figura 2a), in linea con i risultati precedenti che dimostrano atti che la GSK-3beta come un substrato di Akt. Come mostrato nella Figura 2b, infezione di SGC7901 cellule con il vettore adenovirale Ad-Akt da solo non ha avuto effetto sulla pompa protonica gastrica e l'espressione di mRNA. Tuttavia, l'infezione con il vettore Ad-Akt provocato inibizione della pompa protonica espressione mRNA gastrica indotta da HMBA rispetto HMBA ed infezione del controllo (β-gal) adenovirus, suggerendo che la segnalazione attraverso la PI3-chinasi /Akt regola cellula gastrica differenziazione indotta dal trattamento HMBA. Figura 2 Akt regola la differenziazione gastrica indotta da HMBA. A, Cytosol e proteine ​​nucleari sono stati estratti da cellule trattate come indicato e deliberato su SDS-PAGE e cancellato con l'anti-fosfo-Akt, -Akt, fosfo-GSK-3β, e GSK-3β, utilizzando anti-α-tubulina e Topo IIβ come il controllo del citosolica e frazioni nucleari rispettivamente. B, l'espressione della pompa protonica è stata misurata utilizzando western blotting seguito con abbondanza quantificazione. (I dati rappresentano media ± DS; * = p < 0,05 vs. controllo; † = p < 0,05 vs solo HMBA.). C, RNA totale (40 mg) è stato frazionato, trasferito su membrane di nitrocellulosa e sondato con un cDNA pompa protonica etichettato; macchie sono stati spogliati e reprobed con GAPDH.
trattamento con HMBA aumentato l'espressione e l'attività di GSK-3β nel nucleo
Per verificare se la GSK-3β è stata influenzata dal trattamento HMBA, attività di GSK-3β è stata determinata misurando la fosforilazione di ricombinante lumaca, un substrato ben caratterizzato di GSK-3β [35, 36]. GSK-3β si trova nel compartimento citosolico e nucleari di cellule, ma principalmente nel citoplasma durante la fase G1. Pertanto, le proteine ​​nucleari e citoplasmatici erano frazionato dal controllo e le cellule HMBA-trattati ed esaminati per l'attività della GSK-3β. trattamento HMBA ha comportato un aumento nell'attività di nucleare GSK-3β (Figura 3a), e l'inibizione della GSK-3β attenuata G1 arresto HMBA-mediata, che indica un ruolo per GSK-3β in arresto del ciclo cellulare HMBA-indotta. Ser9 fosforilazione di GSK-3β diminuisce l'attività della GSK-3β, mentre Tyr216 fosforilazione aumenta l'attività della GSK-3β [37]. Per analizzare i meccanismi alla base un aumento dell'attività della GSK-3β causato da un trattamento HMBA, ser9-fosforilata e l'espressione della proteina GSK-3β Tyr216-fosforilata è stato determinato utilizzando western blotting. trattamento HMBA ha aumentato i livelli di espressione nucleari del totale GSK-3β e Tyr216-fosforilata GSK-3β senza compromettere la loro espressione nel citoplasma (Figura 3b). È interessante notare che il trattamento HMBA aumentata espressione della proteina GSK-3β ser9-fosforilata sia nel citosolica e frazioni nucleari. Risultati simili sono stati ottenuti in seguito al trattamento con altri HPC, Saha e EMBA (file supplementare 2). Inoltre, HPC aumentato l'attività di GSK-3β nel nucleo come dimostrato da vitro
saggi di chinasi in (file aggiuntivo 3). Questi risultati suggeriscono che HPC aumenta l'attività nucleare GSK-3β indipendentemente dalla fosforilazione a ser9. Figura 3 Il trattamento con HMBA aumentato l'espressione e l'attività di GSK-3β nel nucleo. A, SGC7901 cellule sono state trattate con (+) o senza (-) 10 mMHMBA per 24 h, e raccolti al termine del trattamento. Citosol e frazioni nucleari sono stati preparati e l'attività della GSK-3β sono stati analizzati mediante test chinasi in vitro utilizzando proteine ​​lumaca come substrato. segnali proteici fosforilata lumaca sono stati densitometricamente quantificate ed espressi come pieghevole variazione rispetto ai gruppi di controllo non trattati. B, SGC7901 cellule sono state trattate con 10 mM HMBA per varie volte. Citosolici e proteina nucleare frazioni sono stati estratti e western blotting è stata effettuata utilizzando anticorpi per GSK-3β, fosfo-GSK-3β (ser9), fosfo-GSK-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-tubulina o Topo IIβ.
L'inibizione di GSK-3β sovrascrive l'inibizione CDK2 HMBA indotta
progressione attraverso G1 dipende CDK2 e CDK4 [38, 39]. Per determinare se il regolamento GSK-3β di arresto del ciclo cellulare G1 HMBA-mediata avviene tramite CDK2 o CDK4 inibizione, SGC7901 le cellule sono state pre-trattate con LiCl (figura 4a) o SB-415286 (figura 4b) e poi sottoposti a trattamento di combinazione con HMBA per 24 h prima immunoprecipitazione sono stati effettuati su lisati cellulari usando anti-CDK2 o anti-CDK4 anticorpi rispettivamente. Inoltre, CDK2 o attività CDK4 è stato determinato utilizzando un vitro
saggio di chinasi. Il trattamento con HMBA solo inibito l'attività CDK2 (in alto, pannello di sinistra), ma una maggiore attività CDK4 (in alto, pannello di destra); inibizione della GSK-3β con LiCl o SB-415286 significativamente attenuato HMBA inibizione dell'attività CDK2 (in basso). Il trattamento con HMBA aumentato l'espressione e l'attività di GSK-3β nel nucleo. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che la GSK-3β contribuisce ad arresto del ciclo cellulare G1 HMBA mediata attraverso l'inibizione del CDK2. Figura 4 L'inibizione di GSK-3β sovrascrive l'inibizione CDK2 HMBA-indotta. SGC7901 cellule sono state pre-trattate con (+) o senza (-) 10 mM LiCl (A) o 10 pM SB-415286 (B) per 30 minuti seguita da trattamento combinazione con 10 mM HMBA per 24 h. Gli estratti proteici sono stati immunoprecipitati con anticorpi anti-CDK2 o anti-CDK4. Risultanti complessi immuni sono stati analizzati per l'attività CDK2 utilizzando istone H1 come substrato (pannello superiore) o per l'attività CDK4 utilizzando Rb come substrato (pannello inferiore). segnali fosforilata dell'istone H1 o proteina Rb sono state quantificate densitometricamente ed espressi come pieghevole variazione rispetto ai gruppi di controllo non trattati.
GSK-3β regola p27Kip1protein nucleare espressione
Per esaminare ulteriormente i meccanismi alla base HMBA mediata arresto G1 e l'inibizione CDK2, espressione dell'mRNA ciclo-normativo cellulare è stato analizzato utilizzando saggi RPA. Il trattamento con HMBA aumentato P27 espressione di mRNA Kip1 ma è diminuita p53, p57, P15 (Figura 5A a destra), ciclina A e ciclina D1 espressione di mRNA (Figura 5A a sinistra). Tuttavia, il trattamento con LiCl aumentato p21 espressione Waf1 mRNA, ma non ha influenzato i livelli di espressione di altri geni. Risultati simili sono stati ottenuti quando le cellule sono state trattate con SB-415286 (file complementare 4). Questi risultati suggeriscono che la regolamentazione GSK-3β di arresto del ciclo cellulare HMBA-mediata non comporta la regolazione trascrizionale di geni ciclo del cellulari. Figura 5 mRNA espressione di geni in materia di ciclo cellulare. A, saggi di protezione da RNasi sono state eseguite utilizzando RNA da cellule SGC7901 trattati con 10 mM HMBA, 20 mM LiCl, o una combinazione di HMBA e LiCl per 24 h, ibridato con sonde multiple per gli inibitori del ciclo cellulare dipendente chinasi (A; hCC- 2) o cicline (B; hCYC-1). B, cellule SGC7901 stati pre-trattati con (+) o senza (-) 10 mM LiCl (destra) o 10 pM SB-415286 (sinistro) per 30 minuti seguita da trattamento combinazione con 10 mM HMBA per 24 h. Interi estratti proteici delle cellule sono state risolte su SDS-PAGE, trasferite su membrane PVDF, e immunoblotted con anticorpi anti p27Kip1, p21WAF1, CDK2, o β-actina.
Per analizzare i meccanismi alla base ulteriormente GSK-3β-associata arresto del ciclo cellulare, l'espressione di p21 Waf1 e p27 proteine ​​Kip1 in SGC7901 cellule trattate con HMBA in presenza o assenza di LiCl o SB-415286 è stato esaminato. L'aggiunta di LiCl (Figura 5B destra) o SB-415286 (Figura 5B sinistra) attenuato l'induzione di p27 Kip1 ma non p21 espressione della proteina Waf1, suggerendo che p27 Kip1 partecipa alle transizioni del ciclo cellulare regolata da GSK-3β. Quando p27 Kip1 si accumula nel nucleo si lega al CDK2, inibendone l'attività, e alla fine induce arresto del ciclo cellulare. Inoltre, HMBA (10 mm) è aumentato espressione della proteina p27 Kip1 nel citoplasma e nel nucleo da 0 a 24 ore dopo il trattamento (Figura 6a). HMBA (0-5 mM) è aumentato p27 espressione Kip1 dopo 24 ore in frazioni citosoliche e dopo 48 ore HMBA (5-10 mm) è aumentato p27 espressione Kip1 in frazioni nucleari (figura 6b). L'aggiunta di LiCl (Figura 6c) o SB-415286 (Figura 6d) bloccato HMBA-aumento di p27 Kip1 espressione nucleare senza influenzare p27 espressione Kip1 nel citosol, suggerendo regolamentazione specifica di p27 nucleare espressione Kip1 by GSK-3β. Per dimostrare il ruolo di GSK-3β nella regolazione di p27 nucleare Kip1 espressione ulteriormente, le cellule sono state trasfettate con siRNA diretto contro GSK-3β (Figura 6e). soppressione RNAi-mediata di GSK-3β è stata confermata da immunoblotting e attenuato p27 nucleare Kip1 induzione HMBA senza influire citosolico p27 induzione Kip1. Per confermare il ruolo di GSK-3β nella regolazione di p27 nucleare espressione Kip1, SGC7901 cellule sono state trasfettate con un vettore codificante la forma attivata di GSK-3β (GSK-3β-CA) o un vettore di controllo vuota. Citosol e proteine ​​nucleari sono stati estratti e western blotting è stato eseguito per determinare p27 espressione Kip1. Trasfezione di cellule SGC7901 con il plasmide GSK-3βCA portato ad un aumento di p27 Kip1 nella frazione nucleare (Figura 6F) senza influenzare p27 livelli Kip1 nel citoplasma. Over-espressione della forma attiva di GSK-3β è stata confermata mediante western blotting e saggi in vitro
chinasi che utilizzano proteine ​​lumaca come substrato (Figura 6G). Presi insieme, questi risultati indicano che la GSK-3β partecipa alla regolazione del ciclo cellulare attraverso la regolamentazione specifica di p27 nucleare espressione della proteina Kip1. Figura espressione Kip1 6 p27 nucleare modulata da GSK-3β. A & B, SGC7901 cellule sono state trattate con HMBA (10 mM) per un corso di tempo (A) o con varie concentrazioni per 24 h. Citosolici e proteina nucleare frazioni sono stati estratti e western blotting è stato eseguito con anticorpi anti p27Kip1, α-tubulina o Topo IIβ. Campo; D, SGC7901 cellule sono state pre-trattate con (+) o senza (-) 20 mM LiCl (C) o 10 pM SB-415286 (D) per 30 minuti seguita da trattamento combinazione con 10 mM HMBA per 24 h. Citosol e proteine ​​nucleari sono stati estratti per l'analisi di espressione della proteina p27Kip1. E, SGC7901 cellule sono state trasfettate con siRNA diretto a GSK-3β o controllare siRNA. Ventiquattro ore dopo la trasfezione, le cellule sono state trattate con HMBA per altre 24 h. Citosol e proteine ​​nucleari sono stati estratti per l'analisi di espressione della proteina p27Kip1. Knockdown di espressione GSK-3β è stata confermata da Western blotting utilizzando un anticorpo anti-GSK-3β. F, SGC7901 cellule sono state infettate con Ad-HA-GSK-3βS9A o Ad-β-gal ad una MOI di 10 pfu /cell. Dopo 48 ore di incubazione, citoplasma e proteine ​​nucleari sono stati estratti e Western Blotting eseguite utilizzando anti-p27Kip1, anti-HA, e-GSK-3 anticorpi anti rispettivamente con anti-α-tubulina o Topo IIβ come controllo di caricamento. attività di GSK-3beta sono stati analizzati mediante test chinasi in vitro utilizzando proteine ​​lumaca come substrato (pannello inferiore). segnali p27Kip1 state quantificate densitometricamente ed espressi come pieghevole variazione rispetto al alfa-tubulina o TopIIβ.
GSK-3β regola p27Kip1binding a CDK2
HMBA aumento di p27 espressione della proteina Kip1, l'attività CDK2 inibito e maggiore attività CDK4 (Figura 4). Estratti di controllo o cellule HMBA-trattati sono stati immunoprecipitati per indagare p27 Kip1 vincolante per CDK2 e CDK4. Come mostrato nella Figura 7a, trattamento HMBA aumentato il livello di p27 Kip1 nei complessi immunoprecipitati con l'anti-CDK2 ma non in complessi immunoprecipitati con anti-CDK4. Re-sondare i filtri con anti-CDK2 e anticorpi anti-CDK4 confermato che i immunoprecipitati di controllo e le cellule HMBA-trattati contenevano gli stessi livelli di CDK2 e CDK4. Pertanto, HMBA sembra causare un aumento selettivo di p27 Kip1 vincolante per CDK2. Per analizzare se l'inibizione di GSK-3β colpisce l'associazione di p27 Kip1 con CDK2, SGC7901 le cellule sono state pre-trattate con LiCl o SB-415286 e sottoposti a trattamento di combinazione con HMBA per 24 ore; estratti di cellule intere sono stati immunoprecipitati. Il trattamento con inibitori GSK-3beta, LiCl (Figura 7b) o SB-415286 (Figura 7c) bloccato p27 Kip1 vincolante per CDK2. Questi risultati suggeriscono che la GSK-3β è essenziale per una maggiore p27 HMBA indotta Kip1 vincolante per CDK2. Per confermare il ruolo di GSK-3β nella regolazione di p27 associazione Kip1 con CDK2, SGC7901 cellule sono state trasfettate con un vettore codificante la forma attivata di GSK-3β o Ad-β-gal. proteine ​​cellula intera è stato estratto e immunoprecipitato. Come illustrato nella figura 7d, trasfezione di SGC7901 cellule con la GSK-3β-CA vettore ha comportato un aumento del livello di p27 Kip1 nei complessi immunoprecipitati con anti-CDK2 rispetto a trasfezione del plasmide di controllo. Questo suggerisce che la GSK-3β, non è necessario solo per P27 HMBA mediata Kip1 vincolante per CDK2, ma anche sufficiente per aumentare l'associazione di p27 Kip1 con CDK2 in SGC7901 cellule. Figura 7 regolazione GSK-3β di p27 Kip 1 associazione con CDK2. A, SGC7901 cellule sono state trattate con (+) o senza (-) 10 mM HMBA per 24 h. Gli estratti proteici sono stati immunoprecipitati con anticorpi anti-CDK2 o anti-CDK4. Normal IgG di coniglio è stato utilizzato come controllo. Il p27Kip1 CDK2-o-CDK4 associati nei complessi immuni risultanti è stata analizzata mediante western blotting utilizzando anticorpi anti-p27Kip1 con anti-CDK2 o anticorpi -CDK4 come controlli di carico. B & C, SGC7901 cellule sono state pre-trattate con (+) o senza (-) 10 mM LiCl (B) o 10 pM SB-415286 (C) per 30 minuti seguita da trattamento di combinazione con 10 mM HMBA per 24 h. Gli estratti proteici sono stati immunoprecipitati con un anticorpo anti-CDK2. Il CDK2 associato p27Kip1 nei complessi immuni risultante è stato analizzato simile ad A. D, SGC7901 cellule sono state infettate con Ad-HA-GSK-3βCA o controllo vettoriale (Ad-β-gal) ad una MOI di 10 pfu /cell. Dopo 48 h di incubazione, proteine ​​cellule intere è stato estratto e immunoprecipitati con anticorpi anti-CDK2 (pannello superiore). p27Kip1 è stato analizzato mediante Western blotting simile ad A. sovraespressione di HA-tagged GSK-3CA è stata confermata mediante Western blotting utilizzando un anticorpo anti-GSK-3β (pannello inferiore). attività di GSK-3β è stata determinata da una vitro
test in chinasi utilizzando proteine ​​lumaca come substrato (pannello inferiore).
Discussione
Il PI3-chinasi /Akt /GSK-3β via di segnalazione è stata implicata nella regolazione della crescita cellulare, apoptosi e differenziazione di vari tipi cellulari [46]. Nel presente studio, l'inibizione della GSK-3β utilizzando approcci complementari (ad esempio l'inibizione chimica e costitutivamente attivo Akt sovra-espressione) espressione della pompa attenuato protonica, una misura di differenziazione gastrica come, nella linea di cellule SGC7901 tumore derivato gastrico.
proliferazione e differenziazione cellulare sono tradizionalmente percepiti come processi reciproci, con il ritiro del ciclo cellulare in fase necessaria per la differenziazione terminale [40], e P27 Kip1 giocare un ruolo importante [41, 42]. delezione genetica di p27, ma non p21 ha dimostrato di influenzare la differenziazione delle cellule gastriche, mentre p27 costretto espressione Kip1 porta alla differenziazione, suggerendo che p27 Kip1 è più importante di p21 Waf1 nella regolazione della cellula gastrica differenziazione. In accordo con questi risultati, l'inibizione della GSK-3β attenuato HMBA mediata differenziazione delle cellule gastriche e l'inibizione della GSK-3β bloccato HMBA-mediata p27 nucleare espressione Kip1, mentre sovra-espressione della forma attiva di GSK-3β aumentato nucleare p27 espressione Kip1, suggerendo un ruolo importante nella regolazione della differenziazione cellulare gastrica attraverso la regolazione di p27 nucleare espressione Kip1.
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