| Stomach Health > Mo. Gesondheet >  > Stomach Knowledges > Fuerschunge

P27Kip1, vun Glucogène synthase kinase-3β reegelen, Resultater am HMBA-entschlof dat vu mënschlechen gastric Kriibs cells

P27 Kip1, vun Glucogène synthase kinase-3β reegelen, Resultater am HMBA-entschlof dat vu mënschlechen gastric Kriibs Zellen VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Gastric Kriibs ass déi zweet Équipe gemeinsam Ursaach vun global Kriibs-Zesummenhang veruerteelt. Obwuel dedifferentiation aarmséileg hätt an gastric Kriibs renomméierter däitscher Zeitung, de molekulare Mechanismus Basisdaten dedifferentiation, déi fundamental Abléck an entholl Entwécklung an Werdegang suerge kéint, huet nach gin opgekläert. Ausserdeem, um molekulare Mechanismus d'Auswierkunge vun hexamethylene bisacetamide (HMBA), engem kuerzem entdeckt dat inducer, verlaangt Enquête Basisdaten an et gi keng Untersuchungshaft Studien iwwer d'Wierkung vun HMBA op gastric Kriibs. VerfÜgung Method VerfÜgung op d'Resultater Opgrond vun FACS Analyse, d'Niveaue vu Proteinen an der Zell Zyklus oder apoptosis Équipe sech mat westlecher blotting der eenzel Traitementer a mi Kombinatioune vun HMBA an LiCl alles. GSK-3β an Proton Pompel sech duerch westlech blotting propagéieren no uewen-Regulatioun Akt Ausdrock vum Ad-Akt Wonn. Fir d'Auswierkunge vun HMBA op FAQ Lokalisatioun an d'Aktivitéite vun GSK-3β, CDK2 an CDK4, kinase assays, immunoprecipitation a westlech blotting ermëttelen waren gesuergt. Ausserdeem goufen nërdlechen blotting an RNase Schutz assays duerchgefouert der funktionell Konzentratioun vun HMBA ze bestëmmen. VerfÜgung Resultater VerfÜgung HMBA fräi p27Kip1 Ausdrock an entschlof Zell Zyklus verhaft mat gastric epithelial Zell dat assoziéiert. Zousätzlech, bestéet gastric-ofgeleet Zellen mat HMBA entschlof G0 /G1 verhaft an an-Regulatioun vun der Proton Pompel, engem Bewaacher vun gastric Kriibs dat. Desweideren, Behandlung mat HMBA fräi Meenungsäusserung an Aktivitéit vun GSK-3β am helle awer net dem Zytosol importéiert. HMBA ofgeholl CDK2 Aktivitéit an entschlof p27Kip1 Ausdrock, déi vun inhibition vun GSK-3β gerett ginn hätt. Ausserdeem, HMBA fräi ze CDK2 p27Kip1 bindend, an dëst duerch GSK-3β inhibition ofgeschaaft gouf. VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung D'Resultater ëmzestoussen virgestallt hindeit datt GSK-3β Funktiounen vun Regulatioun p27Kip1 Versammlung mat CDK2, domat eng kritesch Roll an G0 spillen /G1 verhaft mat HMBA-entschlof gastric epithelial Zell dat assoziéiert. VerfÜgung Schlësselwieder VerfÜgung HMBA gastric Kriibs GSK-3β Background VerfÜgung gastric Kriibs ass eent vun de meescht genannten Cancers vun der Welt a wiisst oft Resistenz zu Chimiotherapie an Stralung Behandlungen. Dofir, geschéckt Therapie gouf proposéiert besser d'Krankheet ze bekämpfen an d'Probabilitéit vun Entwécklungslänner Resistenz [1] ze reduzéieren. Hexamethylene bisacetamide (HMBA), engem Hybrid polare Massa (HPC) ursprénglech als dat-Pinguin Agent entwéckelt [2-6], bewierkt gastric Zell du-dat [7-9]. VerfÜgung Am Mo Stammzellen an der proliferative Zell Zon vun de Moien Regioun vun der gastric Glands differenzéiert a ginn Lut ze verschiddenen Zell Zorte [10, 11]. Eemol d'éischt tumorigenic event Plaz hëlt, Werdegang weider entholl hänkt op der Natur vun der domat Manifestatioun an der Entwécklungsphase Etapp vun der Zell dass et an zousätzlech kennen nohalteg dat geschéie kéint. Constant Prolifératioun ass eng wichteg Neierung vun Stammzellen, an zu gastrointestinal Stoffer Projet'en si wahrscheinlech am Ausbau vun verännert Stammzellen ze Resultat, d'Wahrscheinlechkeet vun zousätzleche kennen an entholl Werdegang waarden [12]. Dofir, Stammzellen gastric Kriibs gezielt ass wahrscheinlech déi effektiv Wee vun bestéet gastric Kriibs ze ginn. Ongeféier 50% vun der westlecher Bevëlkerung entwéckelt metaplasia, e wichtege Schrëtt an Kriibs Entwécklung [13], Zeechnen auswiesselen ze Édouard datt Prolifératioun Kontroll an domat Zell dat. Dorënner, déi TGF-b, Myb, Wnt an Hues Weeër si vun allem Relevanz, reservéiert zu Zell-Schicksal ze bestëmmen an Muster Opstellung während embryogenesis an erwuessener Otemschwieregkeeten Erneierung. D'Opkläerungsaarbecht vun komplex entholl suppressor an héijen sécher Weeër, deen Effekt dat modulation vun provisoresch /Grënner Zellen, wäert fir Akeef vun therapeutics dréien ginn gastric Kriibs unzegesin. Fir den Teenie gastric Zellen VerfÜgung ze differenzéieren, verlaangen se ze bleiwen an der G1 Phase vun der Zell Zyklus fir eng gewëssen Zäit. D'mammalian Zell Zyklus ass déi mi Aktivéierung an inactivation vun engem héich conserved Famill vun cyclin ofhängeg kinases (CDKs) gereegelt; Werdegang duerch fréi bis Mëtt-G1 ass ofhängeg op CDK4 an eventuell CDK6, iwwerdeems Werdegang duerch spéide G1 an der S Phase Aktivatioun vun CDK2 verlaangt. D'Aktivitéiten vun CDKs kann déi décisiv vun CDK inhibitory Proteinen inhibited ginn dorënner de CIP /Kip Famill (p21 Waf1, p27 Kip1 an p57 Kip2) an INK4 Famill (p15Ink4b, p16Ink4a, p18Ink4c an p19Ink4d ). P27 Kip1 reglementéiert Post-transcriptionally vun proteolytic ofgeschnidden. CDK2 Photo'en ze p27 Kip1 an phosphorylates et op threonine 187 [14], an HMBA-entschlof gastric Zell dat ass mat der weider-Regulatioun vun p27 Kip1 [15, 16] an G0 /G1 verhaft assoziéiert. Allerdéngs sinn et puer detailléiert Studien de molekulare Mechanismus vun HMBA betreffend an et goufen op gastric Kriibs kee gemellt Studien den Effet vun HMBA enquêtéiert. VerfÜgung Als afgerappt Zil vun der phosphatidylinositol-3 kinase /Akt (PI3-kinase /Akt ) Passerelle, GSK-3β reguléieren Zell Prolifératioun an dat [17-20]. Aktueller beweist Beweiser datt hypoactive GSK3β sécher, wat an G1 Funktiounen Input vu verschiddene sécher an Entwécklungsphase Weeër ze kréien, am Veräin mat ënnerschiddlechen Mënsch Cancers existeiert [21, 22]. GSK-3β gouf zu Multiple biologesche Prozesser agebonne well et eng breet Palette vun heescht de Législateur, dorënner e puer dat checkpoints dorënner c-Myc, Schleek an PI3K [23] phosphorylates. Virdrun, inhibition vun der PI3-kinase Passerelle gouf dës HMBA-mediated gastric Zell dat [8] ze verbesseren. An dëser Etude, war d'Roll vun GSK-3β während gastric Zell dat mat der mënschlecher gastric Kriibs Zell Linn SGC7901, ze propagéieren déi eng multipotent phenotype Plakater a stellt eng gutt-Zeeche Modell vun gastric dat. D'Resultater proposéiere engem contributory Roll fir GSK-3β am p27 Kip1 Passerelle während gastric dat Zell entschlof vun HMBA. VerfÜgung Method VerfÜgung Zell Kultur VerfÜgung der gastric Kriibs Zell Linn SGC7901 aus der Zell Bank kritt huet an der chinesescher Akademie vun de Wëssenschaften an cultured wéi virdru beschriwwen [24]. SGC7901 Zellen sech mat enger adenovirus Zeechesaatz d'Noutbrems Form vun Akt (Ad-Akt) oder déi adenoviral Kontroll Vecteure Zeechesaatz β-galactosidase (β-Meedchen) op eng Zuel vun Wonn (MOI) Personal vun 10 pfu /Zell. No Wonn mat vectors fir eng Stonn, gefollegt vun Ersatz vun mëttel- a incubation fir eng weider 24 h, goufen Zellen sech an der Presenz oder Feele vun HMBA behandelt, an FAQ a RNS fir westlech an Northern blotting ofgebaut, bzw.. VerfÜgung spontan VerfÜgung HMBA, TSA, SB-415286 an LiCl sech aus Fläch chemesche Company, USA kaf. Adenovirus vectors Zeechesaatz β-Meedchen an der myristoylated aktiv Form vu Akt (Ad-Akt) sech aus Zell BioLabs, USA kaf. D'Vecteure Zeechesaatz vum catalytically aktiv Mann- vun GSK3β (ophaalen-GSK-3βCA) war vun Addgene kaaft. Non-gezielt Kontroll siRNA an der SMARTpool fir gezielt GSK-3β sech aus Dharmacon, USA kaf. All Ämter goufen mat enger Biotin Zoufall Premier DNA Etikette Kit (Pierce) gekennzeechent. VerfÜgung Antibodies VerfÜgung Kanengchen anti-Akt, anti-phospho-Akt (Ser473) an antiphospho-GSK-3β (Ser9) sech aus Zell sécher kaaft , USA. Mouse anti-GSK-3β, Maus anti-p27 Kip1, Maus anti-Top IIb a Maus anti-p21 Waf1 aus BD Biosciences, USA kaf goufen. Mouse anti-phospho-GSK-3 (Tyr278 /Tyr216) war vun Upstate, USA kritt. Kanéngchen anti-eenalecn PARP antibody war vun Abcam, USA kaf. Anti-Proton Pompel aus MBL International (USA) kaaft. Polyclonal anti-CDK2, anti-CDK4, anti-α-tubulin an Anti-caspase-3 goufen aus Santa Cruz Déi (USA) kritt. VerfÜgung Sub-bewosst FAQ erauszéien a westlech blotting VerfÜgung Nuclear an cytosolic ufale goufen ofgebaut mat engem héich-PRO Nuclear an Cytoplasmic Extraktioun Reagents Kit (Pierce, USA). Cytosolic FAQ (80 mg) oder nuklear FAQ (20 mg) ass op eng 10% polyacrylamide gelies geléist an zu PVDF Schläimhait transferéiert wéi virdru beschriwwen [25]. Filters sech zu blotting Léisung fir eng Stonn bei Raumtemperatur incubated. Schläimhait sech Nuecht op 4 ° C mat Primärschoul antibodies gefollegt vun blotting mat engem horseradish peroxidase-conjugated Secondaire antibody fir eng Stonn incubated, an visualized eng ECL erkennen System benotzt. VerfÜgung Northern blotting an RNase Schutz assays (RPA) VerfÜgung Total RNS war mat TRIzol reagent (Invitrogen) virbereet. Echantillon sech op 1,2% agarose /formaldehyde gels an transferéiert ze ënnerstëtzt nitrocellulose lafen. Schläimhait sech mat engem biotin Fortgeschratten gastric Proton Pompel cDNA Studiebäihëllefe hybridized. No hybridization mat der GAPDH Studiebäihëllefe, engem Luede Kontroll, goufen Schläimhait gewäsch a Signaler sech mat enger ECL erkennen System fonnt. RNase Schutz Experiment mat der RPA-III Kit vun Ambion standing an der RiboQuant MultiProbe RNase Protection Assay System war méi spezifesch mRNAs z'entdecken geheescht. 32P-Label antisense RNS Ämter bereet waren d'Mënscherechter Apoptosis hCC-2 an hCYC-1 Schabloun baut mat an hybridizations sech laut standing fir de Protokoll d'Hiersteller. VerfÜgung Zell Zyklus Analyse VerfÜgung Gastric Kriibs Zellen sech mat recoltéiert trypsin . Zellen waren, gesammelt zweemol mat Äis-kal PBS gewäsch an am Äis-kal 70% Ethanol fest. resuspended zweemol mat Äis-kal PBS gewäsch, fir 30 min an PBS mat 100 U /ml RNase A an incubated bei 37 ° C an der Wiesen, Zellen sech mat PI (20 mg /ml) Kierchefënster an analyséiert benotzt FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), wéi virdru beschriwwen [25]. VerfÜgung an kënschtlech VerfÜgung kinase assays VerfÜgung D'Aktivitéiten vun CDK2, CDK4 an GSK-3β gemooss goufen wéi virdru beschriwwen [26, 27]. Kuerz, war CDK2, CDK4 oder GSK-3β aus cytosolic (100 mg vun FAQ) oder nuklear (25 mg vun FAQ) dovu immunoprecipitated. Kinase Aktivitéit vun incubating immunoprecipitated CDK2 gemooss gouf, CDK4 oder GSK-3β an 40 ml vun kinase gefiermt mat 4 mg recombinant Wéngertsschleek FAQ (ze moossen GSK-3β-verbonne kinase Aktivitéit), 5 mg vun histone H1 (CDK2-verbonne kinase ze moossen Aktivitéiten) oder retinoblastoma FAQ (CDK4-verbonne kinase Aktivitéit) bei 30 ° C fir 30 min ze moossen. D'Echantillon waren wéi an de leschte Rapporte beschriwwen Filteren [28]. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Inhibition vun GSK-3β attenuates HMBA-entschlof Zell Zyklus verhaft an SGC7901 Zell dat VerfÜgung SGC7901 Zellen am G0 /G1 Zell Zyklus Bomm cumuléiert an ënnerscheet an eng enterocyte-wëll phenotype der Behandlung mat HMBA [29]. GSK-3β dréit zu der inhibition vun Zell Zyklus Werdegang vun aneren Zellen [20, 30]. Dofir, ob GSK-3β eng Roll an HMBA-entschlof spillt SGC7901 Zell Zyklus inhibition propagéieren war. Als zu Dorënner 1a bewisen, Behandlung mat HMBA entschlof Zellen am G0 /G1 Zell Zyklus Bomm ze leeën. Behandlung mat Lithium Chlor (LiCl), wat GSK-3β an enger MG 2+ kompetitiv Manéier bremst [31], huet den Undeel vun Zellen am S Phase. Behandlung mat enger Kombinatioun vun LiCl an HMBA réckgängeg HMBA-mediated G1 Zell verhaft. Ähnlech Resultater goufen der Behandlung mat SB-415286, engem mächtegst inhibitor vun GSK-3β [32] (Zousätzleche Fichier 1) kritt. Dës Resultater hindeit, datt GSK-3β eng Roll an HMBA-entschlof G1 verhaft spille konnt. Fir erauszefannen, ob HMBA während der 24 h Behandlung Period vun Zell Doud virgedroen, war FAQ ofgebaut ze evaluéieren, ob do fräi war PARP Rëss an /oder aktiv caspase-3. Als zu Dorënner 1b bewisen, gouf et keng Erhéijung vun PARP Rëss an aktiv caspase-3 bis 48 h der HMBA Behandlung. Eng wichteg fréi Event am Uschloss dat vun Zellen ass hir Austrëtt aus der Zell Zyklus [6]. Zanter GSK-3β dokumentéiert ass eng Roll am Zell Zyklus verhaft ze spillen [33], et war postulated datt inhibition vun GSK-3β dat inhibit konnt. Dofir d'Auswierkunge vun GSK-3β inhibitors op der Aféierungs- vun HMBA-mediated gastric Proton Pompel Ausdrock, e Bewaacher vun gastric dat, iwwerpréift goufen. SGC7901 Zellen sech mat LiCl (Dorënner 1c an 1d) oder SB-415286 (Dorënner 1e an 1f) op verschiddene Konzentratioune fir eng Stonn Betreiung-behandelt, an dann mat HMBA fir 24 h behandelt. LiCl inhibited HMBA-entschlof gastric Proton Pompel Ausdrock vun enger Portioun-ofhängeg täteg. Konsequent mat deene Resultater, SB-415286 blockéiert gastric Proton Pompel FAQ a mRNA Ausdrock, déi vun HMBA entschlof war. Geholl zesummen, weg dës Resultater datt GSK-3β spillt eng wichteg Roll an HMBA-mediated gastric Zell dat. Figur 1 Inhibition vun GSK-3β attenuates HMBA-entschlof Zell Zyklus verhaft an SGC7901 Zell dat. A, SGC7901 Zellen sech am viraus-behandelt mat oder ouni 10 mm LiCl fir 30 min duerno geschéckt Behandlung mat 10 mm HMBA fir 24 h, duerno mat Quantifizéierung vun DNA Inhalt vun Flux cytometry. B, SGC7901 Zellen sech mat HMBA (10 mm) fir 24 h behandelt oder 48 h an huet fir westlech blotting Analyse virbereet. C & E, goufen SGC7901 Zellen Précoce-behandelt mat oder ouni 10 mm LiCl oder 10 μMSB-415286 fir eng Stonn duerno geschéckt Behandlung mat 10 mMHMBA fir 24 h. Proton Pompel Ausdrock Zoustand war via westlech blotting Analyse alles. D & F, war total RNS vun Zellen an Q-RT-Hinnen alleguer Analyse fir Proton Pompel mRNA Ausdrock ofgebaut war gesuergt. (Donnéen bedeiten ± Fils heeschen; * = p &Si besteet; 0,05 vs. Kontroll; * = p &Si besteet; 0,05 vs. HMBA gehalen.) VerfÜgung Akt gastric dat reguléieren entschlof vun HMBA VerfÜgung GSK-3β inactivated ass et wann. afgerappt vun Akt ass phosphorylated [34]. Dofir, géif et virausgesot datt Aktivatioun vun Akt vun PI3-kinase géif mat inhibition vun GSK-3β an, dono verbonne ginn, inhibition vun gastric Zell dat. Fir dëst Hypothes Test, goufen SGC7901 Zellen mat Ad-Akt oder eng Kontroll Vecteure infizéiert. Krankheet mat Ad-Akt fräi Meenungsäusserung vun phosphorylated Akt, Akt an phosphorylated GSK-3β FAQ (Dorënner 2a), konsequent mat virdrun Resultater Musiktherapie- datt GSK-3β Akten als Realitéiten vun Akt. Als zu Dorënner 2b bewisen, Wonn vun SGC7901 Zellen mat der Ad-Akt adenoviral Vecteure haten eleng keen Effekt op gastric Proton Pompel an mRNA Ausdrock. Allerdéngs Wonn mat der Ad-Akt Vecteure schéinen inhibition vun Ausdrock gastric Proton Pompel mRNA entschlof vun HMBA Verglach mat HMBA an Wonn vun der Kontroll (β-Meedchen) adenovirus, suggeréiert, dass duerch d'PI3-kinase sécher /Akt Passerelle gastric Zell reguléieren dat entschlof vun HMBA Behandlung. Figur 2 Akt reguléieren gastric dat entschlof vun HMBA. A, Zytosol an nuklear Proteinen sech aus Zellen ofgebaut behandelt wéi uginn an eréischt op SDS-PAGE an blotted mat anti-phospho-Akt, -Akt, phospho-GSK-3β, an GSK-3β, mat anti-α-tubulin an enger anerer Sprooch IIβ als Kontrollorgan vun der cytosolic a bzw. nuklear ufale. B, Proton Pompel Ausdrock gemooss gouf westlech blotting mat uschléissend Iwwerfloss quantification. (Donnéen bedeiten mengen ± Fils; * = p &Si besteet; 0,05 vs. Kontroll; † = p &Si besteet; 0,05 vs. HMBA gehalen.). C, Total RNS (40 μg) war fractionated, transferéiert ze nitrocellulose Schläimhait an Komedie mat engem Proton Pompel cDNA Fortgeschratten; blots sech mat GAPDH ewechgeholl an reprobed. VerfÜgung Prefabrizéierten mat HMBA den Ausdrock an Aktivitéit vun GSK-3β am helle fräi VerfÜgung ob GSK-3β vun HMBA Behandlung, GSK-3β Aktivitéit gouf duerch Miessunge der alles beaflosst Fir Test war phosphorylation vun recombinant Wéngertsschleek, e gutt Zeeche Realitéiten vun GSK-3β [35, 36]. GSK-3β ass an der cytosolic an nuklear compartments vun Zellen läit, mä virun allem an der Zytoplasma während der G1 Phase. Dofir, goufen fractionated nuklear an cytoplasmic Proteinen aus Kontroll an HMBA-behandelt Zellen a fir GSK-3β Aktivitéit iwwerpréift. HMBA Behandlung duerchgesat an eng Erhéijung vun der Aktivitéit vun der Nuklearenergie GSK-3β (Dorënner 3A), an GSK-3β inhibition HMBA-mediated G1 verhaft, beweist eng Roll fir GSK-3β zu HMBA-entschlof Zell Zyklus verhaft attenuated. Ser9 phosphorylation vun GSK-3β Verloschter GSK-3β Aktivitéit hierkommen Tyr216 phosphorylation GSK-3β Aktivitéit Erhéijunge [37]. Ze analyséieren, déi Mechanismen Basisdaten fräi GSK-3β Aktivitéit ëmmer duerch HMBA Behandlung, Ser9-phosphorylated an Tyr216-phosphorylated GSK-3β FAQ Ausdrock war mat westlecher blotting alles. HMBA Behandlung nuklear Ausdrock Niveau vun insgesamt GSK-3β an Tyr216-phosphorylated GSK-3β fräi ouni hir Ausdrock am Zytosol (Dorënner 3B) betrëfft. Spannen, fräi HMBA Behandlung Ser9-phosphorylated GSK-3β FAQ Ausdrock vun zwou der cytosolic an nuklear ufale. Ähnlech Resultater goufen folgend Behandlung mat anere HPCs, Saha an EMBA kritt (Zousätzleche Fichier 2). Zousätzlech, fräi HPC der Aktivitéit vun GSK-3β am helle wéi déi kënschtlech VerfÜgung kinase assays (Zousätzleche Fichier 3) bewisen. Dës Resultater hindeit, datt HPC nuklear GSK-3β Aktivitéit onofhängeg vun phosphorylation um Ser9 zouhëlt. Figur 3 Prefabrizéierten mat HMBA fräi Meenungsäusserung an Aktivitéit vun GSK-3β an der ervirgaangen. A, goufen SGC7901 Zellen behandelt mat (+) oder ouni (-) 10 mMHMBA fir 24 h, an um Enn vun der Behandlung recoltéiert. Zytosol an nuklear ufale sech bereet an GSK-3β Aktivitéit gouf duerch eng kënschtlech kinase assay benotzt Wéngertsschleek FAQ wéi Realitéiten assayed. Phosphorylated Wéngertsschleek FAQ Signaler sech densitometrically mat Respekt wéi fantastesch-Ännerung ze onbehandelt Kontroll Gruppen quantitated a ausgedréckt. B, huet SGC7901 Zellen mat 10 mm HMBA fir verschidde Mol behandelt. Cytosolic an nuklear FAQ ufale goufen ofgebaut a westlech blotting war standing antibodies zu GSK-3β, phospho-GSK-3β (Ser9), phospho-GSK-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-tubulin oder anerer Sprooch IIβ benotzt.
inhibition vun GSK-3β overrides HMBA-entschlof CDK2 inhibition VerfÜgung zerstéiert duerch G1 op CDK2 an CDK4 ofhängeg ass [38, 39]. Fir erauszefannen, ob GSK-3β Regulatioun vun HMBA-mediated G1 Zell Zyklus verhaft existeiert via CDK2 oder CDK4 inhibition, goufen SGC7901 Zellen mat LiCl-viraus behandelt (Dorënner 4A) oder SB-415286 (Dorënner 4B) an dann mat HMBA zu geschéckt Traitement ënnerworf fir 24 h virun immunoprecipitation assays waren op der Zell lysates anti-CDK2 oder anti-CDK4 antibodies, respektiv mat duerchgefouert. Ausserdeem war CDK2 oder CDK4 Aktivitéit sech eng kënschtlech VerfÜgung kinase assay benotzt. Behandlung mat HMBA eleng CDK2 Aktivitéit inhibited (erop, lénks Rot) mee fräi CDK4 Aktivitéit (erop, riets Rot); inhibition vun GSK-3β LiCl oder SB-415286 vill HMBA inhibition vun CDK2 Aktivitéit (ënnen) benotzt attenuated. Behandlung mat HMBA fräi Meenungsäusserung an Aktivitéit vun GSK-3β an der ervirgaangen. Geholl zesummen, proposéiere dës Resultater datt GSK-3β zu dréit HMBA-mediated G1 Zell Zyklus verhaft duerch inhibition vun CDK2. Figur 4 Inhibition vun GSK-3β overrides HMBA-entschlof CDK2 inhibition. SGC7901 Zellen sech am viraus-behandelt mat (+) oder ouni (-) 10 mm LiCl (A) oder 10 μM SB-415286 (B) fir 30 min duerch geschéckt Behandlung duerno mat 10 mm HMBA fir 24 h. Protein dovu ware mat anti-CDK2 oder anti-CDK4 antibodies immunoprecipitated. Entstoent immun investéiert goufen fir CDK2 Aktivitéit mat histone H1 wéi Realitéiten (ieweschte Rot) oder fir CDK4 Aktivitéit mat RB wéi Realitéiten (ënneschten Rot) analyséieren. Phosphorylated histone H1 oder RB FAQ Signaler sech quantitated densitometrically an ausdrécke wéi fantastesch-ännere mat Respekt ze onbehandelt Kontroll Gruppen. VerfÜgung GSK-3β reguléieren nuklear p27Kip1protein Ausdrock VerfÜgung Fir d'Mechanismen Basisdaten HMBA mediated G1 verhaft an CDK2 inhibition weider ënnersicht, Zell Zyklus-reglementaresche war mRNA Ausdrock benotzt RPA assays analyséiert. Behandlung mat HMBA fräi P27 Kip1 mRNA Ausdrock mee ofgeholl p53, p57, P15 (Dorënner 5A riets), cyclin A an cyclin D1 mRNA Ausdrock (Dorënner 5A lénks). Allerdéngs, Behandlung mat LiCl fräi p21 Waf1 mRNA Ausdrock awer net de Ausdrock Niveau vun anere Gene betreffen. Ähnlech Resultater kritt, wann Zellen mat SB-415286 (Zousätzleche Fichier 4) behandelt goufen. Dës Resultater hindeit, datt GSK-3β Regulatioun vun HMBA-mediated Zell Zyklus verhaft net de transcriptional Regulatioun vun Zell Zyklus-Zesummenhang Genen abannen. Figur 5 mRNA Ausdrock vun Genen zuer Zell Zyklus. A, Schutz RNase assays benotzt RNS aus SGC7901 Zellen mat entweder 10 mm HMBA, 20 mm LiCl, oder eng Kombinatioun vun HMBA an LiCl fir 24 h, hybridized mat Multi-Ämter fir Zell Zyklus ofhängeg kinase inhibitors (A behandelt gesuergt; hCC- 2) oder cyclins (B; hCYC-1). B, SGC7901 Zellen sech am viraus-behandelt mat (+) oder ouni (-) 10 mm LiCl (riets) oder 10 μM SB-415286 (lénks) fir 30 min duerno geschéckt Behandlung mat 10 mm HMBA fir 24 h. Ganz Zell FAQ dovu waren op SDS-PAGE geléist, fir PVDF Schläimhait transferéiert, an immunoblotted mat antibodies zu p27Kip1, p21Waf1, CDK2, oder β-actin. VerfÜgung Fir d'Mechanismen Basisdaten GSK-3β-verbonne Zell Zyklus verhaft weider analyséieren, den Ausdrock vun p21 Waf1 an p27 Kip1 Proteinen am SGC7901 mat HMBA an der Presenz oder Feele vun LiCl oder SB-415286 behandelt Zellen war iwwerpréift. Zousätzlech vun LiCl (Dorënner 5B riets) oder SB-415286 (Dorënner 5B lénks) attenuated der Aféierungs- vun p27 Kip1 awer net p21 Waf1 FAQ Ausdrock, suggeréiert datt p27 Kip1 bedeelegt an der Zell Zyklus ëmgebaut reglementéiert vun GSK-3β. Wann p27 Kip1 am helle Äschen Photo'en et zu CDK2, hir Aktivitéit inhibiting, an dér induces verhaft Zell Zyklus. Doriwwer eraus, fräi HMBA (10 mm) p27 Kip1 FAQ Ausdrock am Zytosol an Keimzell vun 0 bis 24 h der Behandlung (Dorënner 6a). HMBA (0-5 mm) fräi p27 Kip1 Ausdrock no 24 h am cytosolic ufale an der 48 h HMBA (5-10 mm) fräi p27 Kip1 Ausdrock vun nuklearem ufale (Dorënner 6B). Zousätzlech vun LiCl (Dorënner 6C) oder SB-415286 (Dorënner 6d) gespaart HMBA-fräi p27 Kip1 nuklear Ausdrock ouni p27 nächste Kip1 Ausdrock am Zytosol, proposéiert spezifesch Regelung vun nuklearem p27 Kip1 Ausdrock vun GSK-3β. Fir d'Roll vun GSK-3β zu der Regelung vun der Nuklearenergie p27 Kip1 Ausdrock weider vermëttelt, sech Zellen mat siRNA ausernee géint GSK-3β (Dorënner 6e) transfected. RNAi-mediated Ennerdréckung vun GSK-3β war vun immunoblotting bestätegt an nuklear p27 Kip1 Aféierungs- vun HMBA attenuated ouni cytosolic p27 nächste Kip1 kopéiert. Fir d'Roll vun GSK-3β zu der Regelung vun der Nuklearenergie p27 confirméieren Kip1 Ausdrock, goufen SGC7901 Zellen mat engem Vecteure transfected Zeechesaatz d'Noutbrems Form vun GSK-3β (GSK-3β-CA) oder eidelen Kontroll Vecteure. Zytosol an huet nuklear Proteinen ofgebaut a westlech blotting war standing zu p27 Kip1 Ausdrock bestëmmen. Transfection vun SGC7901 Zellen mat der GSK-3βCA plasmid schéinen fräi p27 Kip1 an der Nuklearenergie Ëmwandlung (Dorënner 6F) ouni p27 nächste Kip1 Niveauen am Zytosol importéiert. Iwwer-Ausdrock vun der aktiver Form vun GSK-3β war mat westlecher blotting bestätegt an kënschtlech VerfÜgung kinase assays benotzt Wéngertsschleek FAQ wéi d'Realitéiten (Dorënner 6G). Geholl zesummen, weg dës Resultater datt GSK-3β zu der Regelung vun der Zell Zyklus duerch déi spezifesch Regelung vun nuklearem p27 bedeelegt Kip1 FAQ Ausdrock. Figur 6 Nuclear p27 Kip1 Ausdrock vun GSK-3β modulated. A & B, SGC7901 Zellen sech fir 24 h mat HMBA (10 mm) iwwer eng Kéier natierlech (A) oder mat verschiddenen Konzentratioune behandelt. Cytosolic an nuklear FAQ ufale goufen ofgebaut a westlech blotting war mat antibodies zu p27Kip1, α-tubulin oder anerer Sprooch IIβ gesuergt. C & D, goufen SGC7901 Zellen-viraus behandelt mat (+) oder ouni (-) 20 mm LiCl (C) oder 10 μM SB-415286 (D) fir 30 min duerch geschéckt Behandlung duerno mat 10 mm HMBA fir 24 h. Zytosol an nuklear Proteinen sech fir Analyse vun p27Kip1 FAQ Ausdrock ofgebaut. E, goufen SGC7901 Zellen mat siRNA ausernee transfected zu GSK-3β oder siRNA Kontroll. Twenty-véier Stonnen no transfection, goufen Zellen mat HMBA fir eng zousätzlech 24 h behandelt. Zytosol an nuklear Proteinen sech fir Analyse vun p27Kip1 FAQ Ausdrock ofgebaut. Knockdown vun GSK-3β Ausdrock war déi westlech blotting mat anti-GSK-3β antibody confirméiert. F, goufen SGC7901 Zellen Krankheet mat Ad-ha-GSK-3βS9A oder Ad-β-Meedchen op eng MOI vun 10 pfu /Zell. No 48 h incubation, Zytosol an nuklear FAQ goufen ofgebaut a westlech blotting standing mat anti-p27Kip1, anti-Ha, an anti-GSK-3 antibodies, bzw. anti-α-tubulin oder anerer Sprooch IIβ als Luede Kontroll benotzt. GSK-3β Aktivitéite sech duerch eng kënschtlech kinase assay benotzt Wéngertsschleek FAQ wéi Realitéiten (ënnen Rot) assayed. p27Kip1 Signaler sech densitometrically an ausdrécke wéi fantastesch-ännere mat Respekt ze α-tubulin oder TopIIβ. VerfÜgung GSK-3β reguléieren p27Kip1binding zu CDK2 VerfÜgung HMBA fräi p27 Kip1 FAQ Ausdrock, inhibited CDK2 Aktivitéit a fräi CDK4 Aktivitéit quantitated (Dorënner 4). Extraiten aus Kontroll oder HMBA-behandelt Zellen sech immunoprecipitated p27 Kip1 verbindlech bis CDK2 an CDK4 ze ermëttelen. Als zu Dorënner 7A bewisen, fräi HMBA Behandlung de Niveau vun p27 Kip1 an der immunoprecipitated investéiert mat anti-CDK2 awer net zu investéiert immunoprecipitated mat anti-CDK4. Re-Betong de Filtere mat anti-CDK2 an Anti-CDK4 bestätegt antibodies datt d'immunoprecipitates aus Kontroll an HMBA-behandelt Zellen de selwechten Niveau vun CDK2 an CDK4 Texter. Dofir, schéngt HMBA eng selektiv Steigerung an p27 Kip1 verbindlech bis CDK2 ze féieren. Ze analyséieren, ob inhibition vun GSK-3β der Associatioun vun p27 schellt Kip1 mat CDK2, SGC7901 Zellen sech mat LiCl oder SB-415286 Pre-behandelt an deen zu geschéckt Behandlung mat HMBA fir 24 h; ganzt-Zell dovu waren immunoprecipitated. Behandlung mat GSK-3β inhibitors, LiCl (Dorënner 7b) oder SB-415286 (Dorënner 7c) gespaart p27 Kip1 verbindlech bis CDK2. Dës Resultater hindeit, datt GSK-3β ass wiesentlech fir HMBA-entschlof fräi p27 Kip1 verbindlech bis CDK2. Fir d'Roll vun GSK-3β zu der Regelung vun p27 Kip1 Associatioun mat CDK2 confirméieren, goufen SGC7901 Zellen mat engem Vecteure transfected Zeechesaatz d'Noutbrems Form vun GSK-3β oder Ad-β-Meedchen. Ganzt-Zell FAQ war ofgebaut an immunoprecipitated. Als zu Dorënner 7d virgestallt, transfection vun SGC7901 Zellen mat der GSK-3β-CA Vecteure duerchgesat an eng fräi Niveau vun p27 Kip1 an der immunoprecipitated investéiert mat anti-CDK2 Verglach mat transfection vun der Kontroll plasmid. Dëst deit drophin, datt GSK-3β net nëmmen néideg fir HMBA-mediated p27 Kip1 verbindlech bis CDK2 ass, mä och genuch zu SGC7901 Zellen der Associatioun vun p27 Kip1 mat CDK2 ze erhéijen. Figur 7 GSK-3β Regulatioun vun p27 Kip 1 Veräin mat CDK2. A, goufen SGC7901 Zellen mat (+) behandelt oder ouni (-) 10 mm HMBA fir 24 h. Protein dovu ware mat anti-CDK2 oder anti-CDK4 antibodies immunoprecipitated. Normal Kanéngchen IgG war wéi d'Kontroll benotzt. mat anti-p27Kip1 antibody mat anti-CDK2 oder -CDK4 antibody als Luede Kontrollen der CDK2-oder CDK4-verbonne p27Kip1 am entstoent immun investéiert gouf duerch westlech blotting analyséiert. B & C, goufen SGC7901 Zellen Précoce-behandelt mat (+) oder ouni (-) 10 mm LiCl (B) oder 10 μM SB-415286 (C) fir 30 min duerch geschéckt Behandlung duerno mat 10 mm HMBA fir 24 h. Protein dovu ware mat enger Anti-CDK2 antibody immunoprecipitated. D'CDK2 verbonne p27Kip1 am entstoent immun investéiert war ähnlech ze A. D analyséiert, SGC7901 Zellen mat Ad-ha-GSK-3βCA oder Vecteure Kontroll (Ad-β-Meedchen) op enger MOI vun 10 pfu /Zell infizéiert goufen. No 48 h incubation, war ganz Zell FAQ ofgebaut an immunoprecipitated mat anti-CDK2 antibody (ieweschte Rot). p27Kip1 war déi westlech blotting gläicht A. Overexpression vun ophaalen-afp GSK-3CA analyséiert duerch westlech blotting bestätegt gouf mat anti-GSK-3β antibody (ënneschten Rot). GSK-3β Aktivitéit assayed war duerch eng kënschtlech VerfÜgung kinase assay benotzt Wéngertsschleek FAQ wéi Realitéiten (ënnen Rot). VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung D'PI3-kinase /Akt /GSK-3β sécher Passerelle huet zu der Regelung agebonne ginn vun Zell Wuesstem, apoptosis an dat vu verschiddene Zell Zorte [46]. Am Moment studéieren, inhibition vun GSK-3β benotzt ergänzen Approche (dh chemesch inhibition an constitutively aktiv Akt iwwer-Ausdrock) attenuated Proton Pompel Ausdrock, enger Mooss vu gastric-wëll dat, an der gastric entholl-ofgeleet SGC7901 Zell Linn.
Zell Prolifératioun an dat sinn esou enk Prozesser traditionell Frankräich, mat Zell-Zyklus Austrëtt fir Uschloss dat néideg ass [40], an P27 Kip1 eng wichteg Roll gespillt [41, 42]. Genetesch Läsche vun p27 awer net p21 gouf gastric Zell dat dës ze beaflossen hierkommen gezwongen p27 Kip1 Ausdrock fir dat féiert, datt p27 suggeréiert Kip1 ass méi wichteg wéi p21 Waf1 zu der Regelung vun gastric Zell dat. gastric Zell dat an inhibition vun GSK-3β blockéiert HMBA-mediated nuklear p27 Kip1 Ausdrock am Accord mat dëse Conclusiounen, inhibition vun GSK-3β attenuated HMBA-mediated, iwwerdeems iwwer-Ausdrock vun der aktiver Form vun GSK-3β fräi nuklear p27 Kip1 Ausdrock, eng wichteg Roll an der Regulatioun vun gastric Zell dat duerch d'Regulatioun vun der Nuklearenergie p27 suggeréiert Kip1 Ausdrock.
  • Mo. Artikel
    •   
  • Gastric Struktur
    •   
  • Betreiung vun de Mo.
    •   
  • Fuerschunge

    • Fuerschunge

    Fuerschunge

    Other Languages

    Mo. Gesondheet © https://www.stomachillness.com/lb