| Stomach Health > gyomor egészség >  > Stomach Knowledges > kutatások

P27Kip1, szabályozza a glikogén szintáz kináz-3β, az eredmények HMBA által kiváltott differenciálódását emberi gyomor rákos sejtek

P27 Kip1 szabályozza glikogén szintáz kináz-3β eredményez HMBA által indukált differenciálódása humán gyomorrák sejtek katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa gyomorrák a második leggyakoribb oka a globális rákhoz kapcsolódó mortalitás . Bár dedifferenciációt jósolja rossz prognózissal gyomorrák, a molekuláris mechanizmusa dedifferenciációt, ami biztosítja az alapvető betekintést tumor kialakulásában és progressziójában, még nem tisztázott. Továbbá a molekuláris mechanizmus alapjául hatásainak hexametilén-biszacetamid (HMBA), egy nemrég felfedezett differenciálódást indukáló, kell vizsgálni, és nem számoltak vonatkozó vizsgálatok hatását HMBA a gyomorrák.
Módszerek
eredményei alapján a FACS analízis, a szintek a fehérjék részt vesznek a sejtciklus vagy apoptózis alkalmazásával határoztuk meg Western blot után egyszeri kezelések és szekvenciális kombinációi HMBA és LiCI. GSK-3β és protonpumpa vizsgáltuk Western blot után fel-szabályozó Akt expressziója Ad-Akt fertőzés. Hatásának vizsgálata a HMBA fehérje lokalizációja és tevékenységét a GSK-3β, CDK2 és CDK4 kináz assay, immunprecipitációval és Western blot végeztünk. Ezen túlmenően, Northern-blot és az RNáz védelem vizsgálatokat végeztünk annak meghatározására, a funkcionális koncentrációját HMBA.
Eredménye
HMBA fokozott p27Kip1 expresszió és indukált sejtciklus társított gyomornyálkahártya sejt differenciálódását. Ezen túlmenően, kezelésére gyomor-eredetű sejtek HMBA indukált G0 /G1 leállást és up-szabályozás a proton pumpa, a marker a gyomorrák differenciálás. Sőt, kezelés HMBA fokozott expresszióját és aktivitását a GSK-3β a sejtmagban, de nem a citoszolba. HMBA csökkent CDK2 aktivitás és indukált p27Kip1 kifejezés, ami megmenthető gátlásával GSK-3β. Továbbá HMBA fokozott p27Kip1 kötődés CDK2, és ez eltörölte a GSK-3β-gátlás.
Következtetések
Az itt bemutatott eredmények azt sugallják, hogy a GSK-3β funkciók szabályozása által p27Kip1 szerelés CDK2, ezáltal játszik kritikus szerepet G0 /G1 leállást társított HMBA-indukált gyomornyálkahártya sejtek differenciálódását.
kulcsszavak
HMBA gyomorrák GSK-3β alapon
gyomorrák egyik leggyakoribb rák a világon, és gyakran alakul ki rezisztencia a kemoterápia és sugárzás kezelések. Ezért kombinációs terápia javasolták, hogy kezeljék a betegség jobb, és csökkentsék a valószínűsége a fejlődő ellenállás [1]. Hexametilén-biszacetamid (HMBA), egy hibrid poláris vegyület (HPC) eredetileg kifejlesztett egy differenciálódást indukáló ágens [2-6], okoz gyomor sejt re-differenciálódás [7-9].
A gyomor, az őssejtek a szaporodó sejt zóna a földszoros régiójának gyomor mirigyek különbséget ad és különféle sejttípusok [10, 11]. Miután az első tumorigenikus esemény zajlik, továbbá a tumor progresszióját jellegétől függ az indító esemény és a fejlődési szakaszban a sejt, hogy a tartósan, és további mutációkat, amelyek előfordulnak. Constant proliferáció létfontosságú funkció az őssejtek, és a gasztrointesztinális szövetekben mutációk valószínűleg azt eredményezi, bővítése megváltozott őssejtek, egyre nagyobb a valószínűsége, hogy további mutációkat és a tumor progresszióját [12]. Ezért célzási gyomorrák őssejtek valószínűleg a leghatékonyabb módja kezelésére gyomorrák. Mintegy 50% -a, a nyugati népesség alakul metaplasia, kulcsfontosságú lépés a rák kialakulásában [13], amely felhívja a figyelmet, hogy a pályákat, amik ellenőrzik elterjedése és ezáltal sejtek differenciálódását. Ezek közül a TGF-b, Myb, Wnt és Hedgehog utak különösen fontosak, nagy súllyal a sejt-sors specifikáció és mintázatképződés embriogenezis során és a felnőtt szöveti megújulás. A magyarázat az összetett tumorszuppresszornak gyorsító jelátviteli utak, amelyek hatása differenciálódása moduláció átmeneti /progenitor sejtek fontosságú lesz optimalizálása terápiás kezelésére gyomorrák.
Annak érdekében, éretlen gyomor sejtek differenciálódását, szükség maradni G1 fázisban a sejtciklus egy bizonyos időtartam alatt. Az emlős sejtciklus által szabályozott szekvenciális aktiválása és inaktiválása egy erősen konzervált családjába ciklinfüggő kinázok (CDK-k); progresszió korai közepéig G1 függ CDK4 és esetleg CDK6, míg progressziót késői G1 és S fázis aktiválást igényel CDK2. A tevékenységek a CDK-gátolható kötelező CDK gátló fehérjék, beleértve a CIP /Kip család (p21 Waf1, p27 Kip1 és p57 Kip2) és INK4 család (p15Ink4b, p16INK4A, p18Ink4c és p19Ink4d ). P27 Kip1 szabályozza post-transzkripciós szinten proteolitikus lebontása. CDK2 kötődik p27 Kip1 és foszforilezi azt treonin 187 [14], és a HMBA-indukált gyomor sejtek differenciálódása együtt jár a up-regulációját p27 Kip1 [15, 16] és G0 /G1 leállítását. Vannak azonban néhány részletes vonatkozó vizsgálatok a molekuláris mechanizmusa HMBA és ott már nem számoltak vizsgáló hatását HMBA a gyomorrák.
Mint egy downstream célpontja a foszfatidil-inozitol-3-kináz /Akt (PI3-kináz /Akt ) útvonal, a GSK-3β szabályozza a sejtek proliferációját és differenciálódását [17-20]. Egyre több bizonyíték utal, hogy í a GSK3p jelzést, amely működik a G1 kapni bemenet több jelző- és fejlődési utakat, előfordul társulva különböző emberi rákos [21, 22]. A GSK-3β szerepet játszik több biológiai folyamatokban, mert foszforilezi széles körét szubsztrátumok többek között több differenciálódási ellenőrző pontok, beleértve a c-myc, a csiga és a PI3K [23]. Korábban, gátolja a PI3-kináz-útvonal kimutatták, hogy fokozza a HMBA-mediált gyomor sejtek differenciálódását [8]. Ebben a vizsgálatban, a szerepe a GSK-3β alatt gyomor sejtdifferenciálódás alkalmazásával vizsgáltuk a humán gyomorrák sejtvonal SGC7901, amely megjelenít egy multipotens fenotípus, és a jelentése jól jellemzett modell a gyomor differenciálás. Az eredmények arra utalnak, közreműködői szerepe a GSK-3β a p27 Kip1 reakcióút során gyomor sejtek differenciálódását indukálja HMBA.
Methods
Sejttenyésztés
A gyomorrák sejtvonalat SGC7901 kapunk a sejtbank a kínai Tudományos Akadémia és a tenyésztett leírtak szerint [24]. SGC7901 sejteket fertőztünk egy adenovírus kódoló aktivált formáját Akt (Ad-Akt), vagy az adenovirális kontroll vektort kódoló β-galaktozidáz (β-gal) a fertőzési multiplicitással (MOI) 10 PFU /sejt. Fertőzés után vektorok egy órán át, majd a csere a közepes, és az inkubálást további 24 órán át, sejteket kezeltünk jelenlétében vagy távollétében HMBA, és a fehérje és RNS-t extraháltuk a nyugati és a Northern blot, ill.
Anyagok
HMBA, TSA, SB-415286 és LiCI a Sigma Chemical Company, USA. Az adenovírus-vektorok kódoló β-gal és a mirisztilezett aktív formája Akt (Ad-Akt) vásároltunk a Cell BioLabs, USA. A vektor kódoló katalitikusan aktív mutáns a GSK3p (HA-GSK-3βCA) vásároltunk a Addgene. Nem célzás kontroll siRNS és a SMARTpool célzáshoz GSK-3β vásároltunk Dharmacon, USA. Minden próbákat biotin Random Prime DNA Labeling Kit (Pierce).
Antitestek
nyúl anti-Akt, anti-foszfo-Akt (Ser473) és antiphospho-GSK-3β (Ser9) vásároltunk a Cell Signaling , amerikai Egyesült Államok. Egér anti-GSK-3β, egér anti-p27 Kip1 egér anti-Top IIb és egér anti-p21 Waf1 vásároltunk BD Biosciences, USA. Egér anti-foszfo-GSK-3 (Tyr278 /Tyr216) kapunk Upstate, USA. Nyúl anti-hasított PARP ellenanyagot vásárolt ABCAM, USA. Anti-protonpumpa-ben vásárolt MBL International (USA). Poliklonális anti-CDK2, anti-CDK4, anti-α-tubulin és anti-kaszpáz-3 kaptuk a Santa Cruz Biotechnology (USA).
Szubcelluláris Fehérjeextrakció és Western-blot-
nukleáris és citoszol frakciókat extraháljuk egy NE-PER nukleáris és citoplazmatikus kivonószerekben készlet (Pierce, USA). Citoszolban található fehérjéhez, (80 mg) vagy nukleáris fehérje (20 mg) volt megoldani egy 10% -os poliakrilamid gélen, és átvittük PVDF-membránokra a korábban leírt [25]. A szűrőket egy óra hosszat inkubáljuk szobahőmérsékleten blotting oldatban. A membránokat egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C hőmérsékleten a primer antitestekkel, majd blot egy torma peroxidázzal konjugált szekunder antitesttel egy órán át, és láthatóvá segítségével ECL kimutatási rendszert alkalmazva.
Northern blot és az RNáz védelem assay (RPA) katalógusa Összesen RNS-t preparáltunk TRIzol reagenssel (Invitrogen). Mintákat futtattuk 1,2% -os agaróz /formaldehid gélen és átvisszük támogatott nitrocellulóz. A membránokat hibridizáltuk egy biotinnal jelölt gyomor protonpumpa cDNS próbával. A hibridizáció után a GAPDH szonda, terhelési kontrollként a membránokat mostuk és jelek alkalmazásával detektáltuk egy ECL kimutatási rendszert alkalmazva. RN-áz védelem kísérleteket hajtottunk végre az RPA III készlet származó Ambion és a RiboQuant Multiprobe RNase Protection Assay System használtunk kimutatására többszörös specifikus mRNS-ek. 32P-jelzett antiszensz RNS-próbákat állítottunk elő az emberi apoptózist HCC-2 és hCYC-1 sablon készletek és hibridizáció szerint végeztük a gyártó utasításai szerint.
Cell cycle analysis
Gyomorrák sejteket tripszin alkalmazásával betakarítottuk . A sejteket összegyűjtöttük, kétszer mostuk jéghideg PBS-sel és a fix jéghideg 70% -os etanollal. Miután kétszer mostuk jéghideg PBS-sel, PBS-ben reszuszpendáltuk, amely 100 egység /ml RN-áz A és inkubáljuk 37 ° C-on 30 percig, a sejteket megfestettük PI (20 mg /ml), és analizáltuk FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), az előzőekben leírtak szerint [25].
In vitro
kináz vizsgálatok
A tevékenységek a CDK2, CDK4 és a GSK-3β mértük a korábban leírtak [26, 27]. Röviden, CDK2, CDK4-gyel vagy a GSK-3β volt immunprecipitálható citoszol (100 mg fehérje) vagy a nukleáris (25 mg fehérje) kivonatok. A kináz aktivitást úgy mértük, inkubáljuk immunprecipitált CDK2, CDK4-gyel vagy a GSK-3β 40 ml kináz pufferben 4 mg rekombináns Csiga protein (mérésére GSK-3β-asszociált kináz aktivitás), 5 mg hiszton H1 (mérésére CDK2-asszociált kináz aktivitás) vagy retinoblasztóma fehérje (mérésére CDK4-asszociált kináz aktivitás) 30 ° C hőmérsékleten 30 percig keverjük. A mintákat ismertetett eljárással a korábbi jelentések [28]. Katalógusa eredményei katalógusa gátlása GSK-3β csillapítja HMBA indukálta sejtciklus leállást és SGC7901 sejtek differenciálódását katalógusa SGC7901 sejtek felhalmozódik a G0 /G1 sejtciklus ellenőrző és differenciált egy enterocita-szerű fenotípus kezelés után HMBA [29]. A GSK-3β hozzájárul a gátlása a sejtciklus előrehaladását differenciálódó sejtekben [20, 30]. Ezért, hogy a GSK-3β szerepet játszik a HMBA-indukált SGC7901 sejtciklus gátlás vizsgáltuk. Amint azt az 1A ábra kezelés HMBA indukált sejtek felhalmozódnak a G0 /G1 sejtciklus ellenőrző pont. Kezelés lítium-klorid (LiCI), amely gátolja a GSK-3β egy Mg 2+ versenyképes módon [31], a megnövekedett aránya sejtek az S fázisban. A kezelés kombinációjával LiCI és HMBA fordított HMBA közvetített G1 cella letartóztatását. Hasonló eredményeket kaptunk a kezelés után az SB-415286, egy potens inhibitora a GSK-3β [32] (Plusz fájlba 1). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a GSK-3β játszhat szerepet HMBA-indukált G1 leállást. Annak meghatározására, hogy HMBA eredményezett sejthalált a 24 h kezelési időszak, fehérje extraháltuk annak értékelésére, hogy ott nőtt a PARP hasítás és /vagy aktív kaszpáz-3. Amint a 1b ábra, nem volt növekedés a PARP hasítás és az aktív kaszpáz-3, amíg 48 óra után HMBA kezelést. Fontos a korai esemény a terminál differenciálódását sejtek kivonását a sejtciklus [6]. Mivel a GSK-3β dokumentálják, hogy szerepet játszik a sejtciklus leállításában [33], azt feltételezték, hogy gátlása GSK-3β gátolhatja differenciálódását. Ezért a hatásait a GSK-3β inhibitorok indukciója HMBA által közvetített gyomor protonpumpa kifejezés, a marker a gyomor differenciálódás, vizsgáltunk. SGC7901 sejteket előre kezeltük LiCI (ábra 1c és 1d), vagy az SB-415286 (ábra 1e és 1f) különböző koncentrációkban egy órán át, majd kezeltük HMBA 24 órán át. LiCl gátolta HMBA által kiváltott gyomor protonpumpa expressziót dózis-függő módon. Összhangban Ezek az eredmények, az SB-415286 blokkolt gyomor protonpumpa fehérje és mRNS expressziója, melyet által indukált HMBA. Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatják, hogy a GSK-3β játszik fontos szerepet HMBA-mediált gyomor sejtek differenciálódását. 1. ábra gátlása GSK-3β csökkenti HMBA által indukált sejtciklus leállásához és SGC7901 sejtdifferenciálódás. A, SGC7901 sejteket előkezeltük, vagy anélkül, 10 mM LiCI-on 30 percig, majd a kombinációs kezelést a 10 mM HMBA 24 órán, majd kvantifikálásával DNS tartalom áramlási citometriával. B, SGC7901 sejteket kezeltünk HMBA (10 mM), 24 óra, vagy 48 óra, és állítjuk elő a Western-blot-analízis. C &E, SGC7901 sejteket előre kezeltük, vagy anélkül, 10 mM LiCI vagy 10 μMSB-415.286 egy órán, majd a kombinációs kezelést a 10 mMHMBA 24 órán át. protonpumpa expressziós státus határozták meg, western blot analízis. D &F, a teljes RNS-t extraháltunk a sejtekről, és a Q-RT-PCR analízis protonpumpa mRNS expressziós végeztünk. (Az adatok átlagait ± SD; * = p < 0,05 vs. kontroll; * = p < 0,05 vs. HMBA egyedül.). Katalógusa Akt szabályozza a gyomor differenciálódás által kiváltott HMBA katalógusa GSK-3β inaktiválódik, ha foszforilezzük downstream Akt [34]. Ezért lenne megjósolható, hogy aktiválása az Akt aktiválását a PI3-kináz lenne társított gátlása GSK-3β, majd ezt követően gátolja a gyomorsav-sejt differenciálódás. Ezen hipotézis ellenőrzésére, SGC7901 sejteket fertőztünk Ad-Akt vagy egy kontroll vektor. Fertőzés Ad-Akt fokozott expressziója foszforilált Akt, Akt és foszforilált GSK-3β fehérje (2a ábra), amely összhangban áll a korábbi eredmények igazolják, hogy a GSK-3β működik, mint egy szubsztrát az Akt. Amint a 2b ábra, fertőzése SGC7901 sejteket az Ad-Akt adenovirális vektor egyedül nem volt hatása a gyomor protonpumpa és mRNS expressziót. Azonban a fertőzés az Ad-Akt vektor eredményezte gátlása gyomor protonpumpa mRNS-expresszió által indukált HMBA képest HMBA és a fertőzés a kontroll (β-gal) adenovírus, ami arra utal, hogy a jelző a PI3-kináz /Akt útvonal szabályozza a gyomor-sejt differenciálódás által kiváltott HMBA kezelést. 2. ábra Akt szabályozza a gyomor differenciálódás által kiváltott HMBA. Egy citoszoija és nukleáris fehérjéket extraháltunk kezelt sejtek jelzett és megoldják SDS-PAGE és blotoltuk anti-foszfo-Akt, -Akt, foszfo-GSK-3β, és a GSK-3β, anti-α-tubulin és Topo IIβ kontrollként a citoszol és nukleáris frakciókban volt. B, protonpumpa-expresszió alkalmazásával mértük Western-blot követte bőség számszerűsítését. (Az adatok átlagait ± SD; * = p < 0,05 vs. kontroll; † = p < 0,05 vs. HMBA egyedül.). C, teljes RNS-t (40 ug) frakcionáljuk, nitrocellulóz membránokra visszük át, és próbaként egy jelzett protonpumpa cDNS; blotokat sztrippeljük és újrapróbáztuk GAPDH.
kezelés HMBA fokozott expresszióját és aktivitását a GSK-3β a sejtmagban
Annak tesztelésére, hogy a GSK-3β befolyásolta HMBA kezelés GSK-3β aktivitás mérésével határoztuk meg a foszforilációját rekombináns csiga, egy jól jellemzett szubsztrátja a GSK-3β [35, 36]. A GSK-3β található, a citoszol és a nukleáris kompartmentekben a sejtek, de túlnyomórészt a citoplazmában során a G1 fázisban. Ezért a nukleáris és citoplazmatikus fehérjék frakcionáltuk, a kontroll és a HMBA-kezelt sejtekben, valamint vizsgálni a GSK-3β aktivitás. HMBA kezelés növekedését eredményezte az aktivitás a nukleáris GSK-3β (3a ábra), és a GSK-3β gátlása gyengített HMBA által közvetített G1 leállást, jelezve a szerepet a GSK-3β in HMBA-indukálta sejtciklus. Ser9 foszforilációja GSK-3β csökkenti GSK-3β aktivitás, míg a Tyr216 foszforiláció növeli a GSK-3β aktivitás [37]. Ahhoz, hogy elemezze a mechanizmusok mögöttes megnövekedett GSK-3β aktivitás által okozott HMBA kezelés Ser9-foszforilezett és Tyr216-foszforilezett GSK-3β fehérje expresszióját alkalmazásával határoztuk meg Western-blottal. HMBA kezelés növelte nukleáris expressziós szintjének teljes GSK-3β és Tyr216-foszforilezett GSK-3β befolyásolása nélkül expressziójukat a citoszolban (3b ábra). Érdekes, HMBA kezelés növelte Ser9-foszforilezett GSK-3β fehérje expresszióját, mind a citoszol és nukleáris frakciókra. Hasonló eredményeket kaptunk kezelést követően egyéb HPC, SAHA és EMBA (Plusz fájl 2). Ezen túlmenően, a HPC fokozott aktivitását a GSK-3β a sejtmagban, amint azt in vitro
kináz assay (Plusz fájl 3). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a HPC növeli nukleáris GSK-3β aktivitás függetlenül a foszforiláció Ser9. 3. ábra kezelés HMBA fokozott expresszióját és aktivitását a GSK-3β a sejtmagban. A, SGC7901 sejteket kezeltünk (+) vagy anélkül (-) 10 mMHMBA 24 órán, és betakarított végén a kezelést. Citoszolban és nukleáris frakciókat készítettünk és a GSK-3β-aktivitást in vitro kináz assay-csiga protein szubsztrátként. Foszforilált Csiga fehérje szignálokat denzitométeresen mennyiségileg kifejezett kinyitható képest változást kezeletlen kontroll csoportban. B, SGC7901 sejteket kezeltünk 10 mM HMBA különböző alkalommal. Citoszol és nukleáris protein frakciókat extraháltuk, és Western-blot alkalmazásával végeztük antitestek GSK-3β, foszfo-GSK-3β (Ser9), foszfo-GSK-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-tubulin vagy Topó IIβ.
gátlása GSK-3β felülbírálja HMBA-indukálta CDK2 gátlás
Progression keresztül G1 függ CDK2 és CDK4 [38, 39]. Annak meghatározására, hogy a GSK-3β szabályozása HMBA által közvetített G1 sejtciklus keresztül történik CDK2 vagy CDK4 gátlása, SGC7901 sejteket előre kezeltük LiCI (4a ábra), vagy az SB-415286 (4b ábra), majd alávetjük a kombinációs kezelést a HMBA 24 órán előtt immunprecipitációs vizsgálatokat végeztünk a sejt lizátumokat anti-CDK2 vagy anti-CDK4 ellenanyagok, ill. Ezen túlmenően, CDK2 vagy CDK4 aktivitását alkalmazásával határoztuk meg in vitro
kináz assay. Kezelés HMBA önmagában gátolta CDK2 aktivitás (felső, bal panel), de nőtt CDK4 aktivitása (felső, jobb panel); gátlása GSK-3β segítségével LiCI vagy az SB-415286 szignifikánsan csökkentette HMBA gátlása CDK2 aktivitás (alsó). Kezelés HMBA fokozott expresszióját és aktivitását a GSK-3β a sejtmagban. Összefoglalva, ezek az eredmények azt sugallják, hogy a GSK-3β hozzájárul a HMBA által közvetített G1 sejtciklus gátlása útján CDK2. 4. ábra gátlása GSK-3β felülbírálja HMBA-indukált CDK2 gátlás. SGC7901 sejteket előre kezeltük (+) vagy anélkül (-) 10 mM LiCI (A) vagy 10 uM SB-415286 (B) 30 percig, majd a kombinációs kezelést a 10 mM HMBA 24 órán át. Protein extraktot immunoprecipitáltuk anti-CDK2 vagy anti-CDK4 antitesteket. Eredő immunkomplexek analizáltuk CDK2 aktivitás felhasználásával hiszton H1 a szubsztrát (felső panel) vagy CDK4 aktivitását használva Rb szubsztrát (alsó panel). Foszforilált hiszton H1 vagy Rb fehérje jeleket mennyiségileg denzitométeresen kifejezett kinyitható képest változást kezeletlen kontroll csoportban.
GSK-3β szabályozza a nukleáris p27Kip1protein kifejezés katalógusa vizsgálata hátterében álló mechanizmusok HMBA közvetített G1 és az CDK2 gátlás további, sejtciklus-szabályozó mRNS expresszióját elemeztük RPA vizsgálatokban. Kezelés HMBA megnövekedett P27 Kip1 mRNS expresszió, de csökkent a p53, p57, P15 (5A ábra jobbra), a ciklin A és ciklin D1 mRNS expresszióját (5A ábra bal). Azonban a kezelés LiCl fokozott p21 Waf1 mRNS expressziója, de nem befolyásolta az expressziós szintek más gének. Hasonló eredményeket kaptunk, amikor a sejteket kezeltük SB-415286 (Plusz fájl 4). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a GSK-3β szabályozása HMBA közvetített sejtciklusmegállás nem jár a transzkripciós sejtciklus szabályozásában kapcsolatos gének. 5. ábra mRNS expressziós gének tekintetében sejtciklust. A, RN-áz védelem vizsgálatokat végeztünk származó RNS SGC7901 kezelt sejtek vagy 10 mM HMBA, 20 mM LiCl, vagy ezek kombinációja a HMBA és LiCI 24 órán, hibridizált multi-szondák a sejtciklus-függő kináz inhibitorok (A; hCC- 2) vagy ciklinek (B; hCYC-1). B, SGC7901 sejteket előre kezeltük (+) vagy anélkül (-) 10 mM LiCI (jobbra) vagy 10 uM SB-415286 (balra) 30 percig, majd a kombinációs kezelést a 10 mM HMBA 24 órán át. A teljes sejt fehérje extraktumokat megoldódott SDS-PAGE, átvittük PVDF-membránokra, és immunblottoltuk ellenanyagokkal p27Kip1, p21WAF1, CDK2, vagy β-aktin.
Elemzéséhez a mechanizmusok mögöttes GSK-3β-asszociált sejtciklus további, a kifejezés a p21 Waf1 és p27 Kip1 fehérjék SGC7901 kezelt sejtekben HMBA jelenlétében vagy távollétében LiCI vagy az SB-415286 vizsgáltuk. Hozzáadása LiCI (5B ábra jobb) vagy az SB-415286 (5B ábra balra) attenuált indukcióját p27 Kip1 de nem P21 Waf1 fehérje expresszió, ami arra utal, hogy a p27 Kip1 részt vesz a sejtciklus átmeneteket szabályozott GSK-3β. Amikor a p27 Kip1 felhalmozódik a sejtmagban kötődik a CDK2, gátolva annak aktivitását, és végül sejtciklusleállást. Továbbá HMBA (10 mM) a fokozott p27 Kip1 fehérje expressziója a citoszolban és a sejtmagban 0-24 órával a kezelés után (6a ábra). HMBA (0-5 mmol) fokozott p27 Kip1 kifejezés 24 óra után a citoszol frakció és 48 óra után HMBA (5-10 mM) fokozott p27 Kip1 kifejezés a nukleáris frakciókat (6b ábra). Hozzáadása LiCI (ábra 6c) vagy az SB-415286 (ábra 6d) blokkolt HMBA-fokozott p27 Kip1 nukleáris expressziós befolyásolása nélkül a p27 Kip1 kifejezés a citoszolban, ami arra utal specifikus szabályozás a nukleáris p27 Kip1 expresszió GSK-3β. Annak igazolására, a szerepe a GSK-3β szabályozásában nukleáris p27 Kip1 expresszió további, sejteket transzfektáltunk a siRNS ellen irányul a GSK-3β (ábra 6E). RNSi által közvetített elnyomását GSK-3β megerősítette immun és legyengített nukleáris p27 Kip1 indukció HMBA befolyásolása nélkül citoszolbeli p27 Kip1 indukció. Annak igazolására, a szerepe a GSK-3β szabályozásában nukleáris p27 Kip1 expresszió SGC7901 sejteket transzfektáltunk kódoló vektorral aktivált formáját GSK-3β (GSK-3β-CA), vagy egy üres kontroll vektorral. Citoszolban és nukleáris fehérjéket extraháltuk, és Western-blot vizsgálatot végeztünk annak meghatározására, p27 Kip1 kifejezést. Transzfektálása SGC7901 sejteket a GSK-3βCA plazmidot eredményezte fokozott p27 Kip1 a nukleáris frakciót (ábra 6F) anélkül, hogy befolyásolná a p27 Kip1 szintek a citoszolban. Over-kifejezése az aktív formája a GSK-3β alkalmazásával bizonyítottuk Western blot és in vitro
kináz assay Csiga fehérje, mint a szubsztrátum (ábra 6g). Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatják, hogy a GSK-3β részt vesz a szabályozás a sejtciklus révén specifikus szabályozás a nukleáris p27 Kip1 fehérje expresszióját. 6. ábra A nukleáris p27 Kip1 kifejezés modulált GSK-3β. A & B, SGC7901 sejteket kezeltünk HMBA (10 mM), mint egy idő folyamán (A) vagy különböző koncentrációjú 24 órán át. Citoszol és nukleáris protein frakciókat extraháltuk, és Western-blottal hajtottuk végre antitestek p27Kip1, α-tubulin vagy Topó IIβ. Tábor; D, SGC7901 sejteket előre kezeltük (+) vagy anélkül (-) 20 mM LiCI (C) vagy 10 uM SB-415286 (D) 30 percig, majd a kombinációs kezelést a 10 mM HMBA 24 órán át. Citoszolban és nukleáris fehérjéket extraháljuk elemzésére p27Kip1 fehérje expresszióját. E, SGC7901 sejteket transzfektáltunk siRNS irányított GSK-3β vagy kontroll siRNS. Huszonnégy órával a transzfektálás után a sejteket kezeltük HMBA további 24 órán át. Citoszolban és nukleáris fehérjéket extraháljuk elemzésére p27Kip1 fehérje expresszióját. Kiütése GSK-3β expresszióját igazoltuk Western-blottal, anti-GSK-3β antitest. N, SGC7901 sejteket fertőztünk Ad-HA-GSK-3βS9A vagy Ad-β-gal-egy 10 PFU /sejt. 48 órás inkubálás után, citoszolba és a nukleáris proteint extraháltuk, és Western-blot alkalmazásával végeztük az anti-p27Kip1, anti-HA, és az anti-GSK-3 antitest, illetve anti-α-tubulin vagy Topó IIβ terhelési kontrollként. A GSK-3β tevékenységet vizsgáljuk in vitro kináz assay segítségével Csiga protein szubsztrátként (alsó panel). p27Kip1 jelek mennyiségileg denzitométeresen kifejezett kinyitható képest változást a-tubulin vagy TopIIβ.
GSK-3β szabályozza p27Kip1binding hogy CDK2 katalógusa HMBA fokozott p27 Kip1 fehérje expresszió, gátolt CDK2 aktivitás és fokozott CDK4 aktivitása (4. ábra). Kivonat a kontroll vagy HMBA kezelt sejteket immunoprecipitáltunk vizsgálja p27 Kip1 kötődés CDK2 és CDK4. Amint a 7a ábra, HMBA kezelés emelte a p27 Kip1 a komplexek immunoprecipitáltuk anti-CDK2 de nem komplexek immunoprecipitáltuk anti-CDK4. Re-tapintás a szűrőket anti-CDK2 és anti-CDK4 antitestek megerősítette, hogy a immunoprecipitátumokban kontroll és HMBA-kezelt sejtek tartalmazott azonos szintű a CDK2 és CDK4. Ezért HMBA úgy tűnik, hogy okoz szelektív növekedését a p27 Kip1 kötődését a CDK2. Annak vizsgálatára, hogy gátolja a GSK-3β befolyásolja az egyesület p27 Kip1 a CDK2, SGC7901 sejteket előkezelt LiCl vagy SB-415286 és alá kell kombinációs kezelés HMBA 24 órán; teljes-sejt kivonatokat immunprecipitáltuk. Kezelés GSK-3β inhibitorok, LiCI (7b ábra), vagy SB-415286 (ábra 7c) blokkolt p27 Kip1 kötődés CDK2. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a GSK-3β elengedhetetlen HMBA által indukált fokozott p27 Kip1 kötődését a CDK2. Annak igazolására, a szerepe a GSK-3β szabályozásában p27 Kip1 társítva CDK2, SGC7901 sejteket transzfektáltunk kódoló vektorral aktivált formáját GSK-3β vagy Ad-β-gal. Teljes-sejt protein extraháljuk, és immunprecipitáltuk. Ábrán bemutatott 7d, transzfektálása SGC7901 sejteket a GSK-3β-CA vektor eredményezett fokozott p27 Kip1 a komplexek immunoprecipitáltuk anti-CDK2 összehasonlítva transzfekciója a kontroll plazmid. Ez azt sugallja, hogy a GSK-3β nemcsak szükséges HMBA közvetített p27 Kip1 kötődés CDK2, hanem elegendő, hogy növelje az egyesület a p27 Kip1 a CDK2 a SGC7901 sejtekben. 7. ábra A GSK-3β szabályozása p27 Kip 1 társulás CDK2. A, SGC7901 sejteket kezeltünk (+) vagy anélkül (-) 10 mM HMBA 24 órán át. Protein extraktot immunoprecipitáltuk anti-CDK2 vagy anti-CDK4 antitesteket. Normál nyúl IgG-t alkalmaztunk, mint a kontroll. A CDK2-vagy CDK4-asszociált p27Kip1 a kapott immunkomplexek analizáltuk Western-blottal, anti-p27Kip1 antitest anti-CDK2 vagy -CDK4 antitest Loading kontrollként. B &C, SGC7901 sejteket előre kezeltük (+) vagy anélkül (-) 10 mM LiCI (B) vagy 10 uM SB-415286 (C) 30 percig, majd a kombinációs kezelést a 10 mM HMBA 24 órán át. Protein extraktot immunoprecipitáltuk anti-CDK2 antitest. A CDK2 kapcsolódó p27Kip1 a kapott immunkomplexek elemeztük hasonló A. D SGC7901 sejteket fertőztünk Ad-HA-GSK-3βCA vagy vektor (Ad-β-gal) egy 10 PFU /sejt. 48 órás inkubálás után, teljes sejt proteint extraháltuk, és immunoprecipitáltuk anti-CDK2 antitest (felső panel). p27Kip1 analizáltuk Western-blottal hasonló A. túlexpressziója HA-címkézett GSK-3ca igazoltuk Western-blottal, anti-GSK-3β antitest (alsó panel). A GSK-3β-aktivitást egy in vitro
kináz assay Csiga protein szubsztrátként (alsó panel).
Megbeszélés
A PI3-kináz /Akt /GSK-3β jelátviteli szerepet játszik a rendeletben sejtnövekedés, az apoptózis és a differenciálódás különböző sejttípusok [46]. A jelen vizsgálatban, gátlás a GSK-3β felhasználásával kiegészítő módszerek (vagyis a kémiai gátlás és konstitutívan aktív Akt over-expression) attenuált protonpumpa kifejezés, az intézkedés a gyomor-szerű differenciálódás, a gyomor tumor eredetű SGC7901 sejtvonalban.
sejtproliferáció és differenciálódás hagyományosan tartják kölcsönös folyamatokhoz, sejtciklus-kivonási hogy szükséges terminális differenciálódást [40], és a P27 Kip1 fontos szerepet játszik [41, 42]. Genetikus törlése p27 de nem P21 kimutatták, hogy befolyásolja a gyomor-sejt differenciálódás, míg kénytelen p27 Kip1 kifejezés differenciálódásához vezet, ami arra utal, hogy a p27 Kip1 sokkal fontosabb, mint a p21 Waf1 szabályozásában gyomor sejt különbségtétel. Egyetértésben ezeket a megállapításokat, gátlás a GSK-3β, gyengített HMBA által közvetített gyomor sejtek differenciálódását és gátlása GSK-3β blokkolt HMBA által közvetített nukleáris p27 Kip1 kifejezés, míg túlzott expressziója aktív formája a GSK-3β fokozott nukleáris p27 Kip1 kifejezés, ami arra utal, fontos szerepe van a szabályozás a gyomor-sejt differenciálódás szabályozása révén nukleáris p27 Kip1 kifejezést.
  • gyomor cikk
    •   
  • A gyomor szerkezet
    •   
  • Gondoskodás a gyomor
    •   
  • kutatások

    • kutatások

    kutatások

    Other Languages

    gyomor egészség © https://www.stomachillness.com/hu