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P27kip1, régulée par la glycogène synthase kinase 3β, aboutit à une différenciation induite par le HMBA des cellules cancéreuses gastriques humaines

P27 Kip1, régulée par la glycogène synthase kinase-3β, les résultats dans la différenciation HMBA induite par des cellules cancéreuses gastriques humaines
Résumé de l'arrière-plan
Le cancer gastrique est la deuxième cause la plus fréquente de la mortalité mondiale liée au cancer . Bien que la dédifférenciation prédit un mauvais pronostic dans le cancer gastrique, le mécanisme moléculaire sous-jacent dédifférenciation, ce qui pourrait fournir des indications fondamentales dans le développement et la progression tumorale, n'a pas encore été élucidé. En outre, le mécanisme moléculaire qui sous-tend les effets de hexaméthylène bisacétamide (HMBA), un inducteur de différenciation récemment découvert, exige une enquête et il n'y a pas d'études rapportées concernant l'effet de HMBA sur le cancer gastrique.
Méthodes
Basé sur les résultats de l'analyse FACS, les niveaux de protéines impliquées dans le cycle cellulaire ou l'apoptose a été déterminée en utilisant un transfert de western après les traitements simples et des combinaisons séquentielles de HMBA et LiCl. GSK-3β et de la pompe à protons ont été étudiées par western blot après up-régulation de l'expression Akt par l'infection Ad-Akt. Pour étudier les effets de HMBA sur la localisation des protéines et les activités de GSK-3β, CDK2 et CDK4, des essais de kinase, immunoprécipitation et western blot ont été réalisées. Résultats de En outre, Northern blot et RNase essais de protection ont été réalisées pour déterminer la concentration fonctionnelle de HMBA.
HMBA une expression accrue de p27Kip1 et induit un arrêt du cycle cellulaire associé à la différenciation des cellules épithéliales gastriques. En outre, le traitement des cellules gastriques dérivées avec HMBA induite G0 /G1 arrestation et up-régulation de la pompe à protons, un marqueur de différenciation du cancer gastrique. En outre, le traitement avec le HMBA a augmenté l'expression et l'activité de la GSK-3β dans le noyau, mais pas le cytosol. HMBA diminution de l'activité de CDK2 et d'expression de p27Kip1 induite, ce qui pourrait être sauvé par l'inhibition de GSK-3β. Conclusions de plus, HMBA augmentation de la liaison p27Kip1 à CDK2, et cela a été aboli par l'inhibition de GSK-3β de.
Les résultats présentés ici suggèrent que les fonctions GSK-3ß en régulant l'assemblage p27Kip1 avec CDK2, jouant ainsi un rôle essentiel dans G0 /G1 arrestation associée à la différenciation des cellules épithéliales gastriques induites par le HMBA.
Mots-clés
HMBA cancer gastrique Contexte GSK-3β
le cancer gastrique est l'un des cancers les plus fréquents dans le monde et se développe souvent une résistance à la chimiothérapie et la radiothérapie traitements. Par conséquent, la thérapie de combinaison a été proposée pour lutter contre la maladie mieux et de réduire la probabilité de développer une résistance [1]. Hexamethylene bisacétamide (HMBA), un composé polaire hybride (HPC) développé à l'origine comme un agent induisant une différenciation [2-6], provoque cellules gastriques re-différenciation [7-9].
Dans l'estomac, les cellules souches dans le zone de prolifération cellulaire de la région d'isthme de glandes gastriques de différence et donnent naissance à divers types de cellules [10, 11]. Une fois que le premier événement a lieu tumorigène, la progression de la tumeur dépend de la nature de l'événement déclencheur et le stade de développement de la cellule qui a subi et des mutations supplémentaires qui pourraient se produire. prolifération constante est une caractéristique essentielle des cellules souches et dans les tissus gastro-intestinaux des mutations sont susceptibles d'entraîner l'expansion de cellules souches altérées, ce qui augmente la probabilité de mutations supplémentaires et la progression des tumeurs [12]. Par conséquent, le ciblage des cellules souches du cancer gastrique est susceptible d'être le moyen le plus efficace de traitement du cancer gastrique. Environ 50% de la population occidentale se développe métaplasie, une étape clé dans le développement du cancer [13], attirant l'attention sur les voies qui contrôlent la prolifération et la différenciation cellulaire ainsi. Parmi ceux-ci, le TGF-b, Myb, Wnt et Hedgehog voies sont particulièrement pertinentes, figure en bonne place dans la spécification cellulaire destin et la formation de structures pendant l'embryogenèse et le renouvellement des tissus adultes. L'élucidation de suppresseur complexe de la tumeur et de signalisation accélérateur voies, qui différenciation des effets de modulation des cellules de transition /progénitrices, sera essentielle pour l'optimisation de la thérapeutique pour traiter le cancer gastrique.
Pour les cellules gastriques immatures à se différencier, ils ont besoin pour rester en la phase G1 du cycle cellulaire pendant une certaine période de temps. Le cycle cellulaire de mammifère est régulée par activation séquentielle et l'inactivation d'une famille hautement conservée de kinases dépendantes des cyclines (CDK); la progression à travers début à la mi-G1 dépend de CDK4 et éventuellement CDK6, tandis que la progression à travers la fin de G1 et la phase S nécessite l'activation de CDK2. Les activités de CDK peuvent être inhibées par la liaison des protéines inhibitrices de CDK, y compris la famille Cip /Kip (p21 Waf1, p27 Kip1 et p57 Kip2) et de la famille INK4 (p15INK4b, p16Ink4a, p18Ink4c et p19Ink4d ). P27 Kip1 est réglementé post-transcriptionnelle par la dégradation protéolytique. CDK2 se lie à p27 Kip1 et phosphoryle sur la thréonine 187 [14] et la différenciation des cellules gastriques HMBA induite est associée à la régulation positive de p27 Kip1 [15, 16] et G0 /G1 arrêt. Cependant, il existe peu d'études détaillées concernant le mécanisme moléculaire de HMBA et il n'y a pas eu d'études rapportées enquêtant sur l'effet de HMBA sur le cancer gastrique.
Comme une cible en aval de la phosphatidylinositol-3 kinase /Akt (PI3-kinase /Akt ) la voie, la GSK-3β régule la prolifération et la différenciation cellulaire [17-20]. L'accumulation des données indique que hypoactif signalisation GSK3, qui fonctionne dans G1 pour recevoir une entrée de plusieurs signalisation et les voies de développement, se produit en association avec divers cancers humains [21, 22]. GSK-3β a été impliquée dans plusieurs processus biologiques parce qu'il phosphoryle une large gamme de substrats, y compris plusieurs points de contrôle de la différenciation, y compris c-Myc, escargot et PI3K [23]. Auparavant, l'inhibition de la voie PI3-kinase a été montré pour améliorer la différenciation des cellules gastriques HMBA à médiation par [8]. Dans cette étude, le rôle de la GSK-3β lors de la différenciation cellulaire gastrique a été étudiée en utilisant la lignée cellulaire gastrique cancéreuse humaine SGC7901, qui affiche un phénotype pluripotent, et représente un modèle bien caractérisé de la différenciation gastrique. Les résultats suggèrent un rôle contributif pour GSK-3β dans le p27 Kip1 voie lors de la différenciation cellulaire gastrique induite par HMBA.
Méthodes
culture cellulaire
La lignée cellulaire de cancer gastrique SGC7901 a été obtenu à partir de la banque de cellules à l'Académie chinoise des sciences et cultivées comme décrit précédemment [24]. SGC7901 cellules ont été infectées par un adénovirus codant pour la forme activée de Akt (Ad-Akt) ou le vecteur codant pour la commande adénoviral β-galactosidase (β-gal) à une multiplicité d'infection (MOI) de 10 pfu /cellule. Après l'infection avec des vecteurs pendant une heure, suivie par le remplacement du milieu et incubation pendant 24 heures supplémentaires, les cellules ont été traitées en présence ou en l'absence du HMBA et de protéines et de l'ARN ont été extraits à l'ouest et le nord-blot, respectivement. Matériaux
HMBA, TSA, SB-415286 et LiCl ont été achetés chez Sigma Chemical Company, USA. Les vecteurs adénoviraux codant pour β-gal et la forme active myristoylés de Akt (Ad-Akt) ont été achetés chez cellulaires BioLabs, États-Unis. Le vecteur codant pour le mutant catalytiquement actif de GSK3ß (HA-GSK-3βCA) a été acheté chez Addgene. Non-ciblage siRNA contrôle et Smartpool pour cibler GSK-3β ont été achetés chez Dharmacon, États-Unis. Toutes les sondes ont été marquées avec un étiquetage Kit biotine aléatoire Premier ADN (Pierce).
Anticorps
lapin anti-Akt, anti-phospho-Akt (Ser473) et antiphospho-GSK-3β (Ser9) ont été achetés auprès de Cell Signaling , ETATS-UNIS. anti-GSK-3β Mouse, souris anti-p27 Kip1, souris anti-Haut IIb et souris anti-p21 Waf1 ont été achetés chez BD Biosciences, USA. On a obtenu la souris anti-phospho-GSK-3 (Tyr278 /Tyr216) de Upstate, USA. Lapin d'anticorps anti-PARP clivée a été acheté chez Abcam, États-Unis. pompe anti-proton a été acheté à MBL International (USA). Polyclonaux anti-CDK2, anti-CDK4, anti-α-tubuline et anti-caspase-3 ont été obtenus à partir de Santa Cruz Biotechnology (USA):. Extraction de protéines sous-cellulaire et Western blot
nucléaire et les fractions cytosoliques ont été extraites en utilisant un kit NE-PER nucléaires et cytoplasmiques extraction Réactifs (Pierce, USA). protéine cytosolique (80 mg) ou de la protéine nucléaire (20 mg) a été résolu sur un gel de Polyacrylamide à 10% et transférées sur des membranes de PVDF tel que décrit précédemment [25]. Les filtres ont été mis en incubation pendant une heure à température ambiante dans une solution buvard. Les membranes ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires suivies par buvardage avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort pendant une heure, et visualisées en utilisant un système de détection ECL.
Northern Blot et des essais de protection à la RNase (RPA)
total L'ARN a été préparé en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen). Les échantillons ont été analysés sur des gels d'agarose à 1,2% /formaldehyde et transférés sur de la nitrocellulose en charge. Les membranes ont été hybridées avec un proton gastrique sonde pompe d'ADNc marqué à la biotine. Après hybridation avec la sonde GAPDH, un contrôle du chargement, les membranes ont été lavées et les signaux ont été détectés en utilisant un système de détection ECL. RNase expériences de protection ont été effectuées en utilisant le kit RPA-III de Ambion et du système de dosage RiboQuant MultiProbe Protection RNase a été utilisé pour détecter de multiples ARNm spécifiques. L'analyse du cycle cellulaire
32P-sondes marquées d'ARN antisens ont été préparées en utilisant les Apoptose Human Hcc-2 et hCYC-1 Ensembles de modèles et les hybridations ont été réalisées selon le protocole du fabricant.
cellules cancéreuses gastriques ont été récoltées en utilisant la trypsine . Les cellules ont été recueillies, lavées deux fois avec du PBS glacé et fixées dans de la glace froide 70% d'éthanol. Après avoir été lavé deux fois avec du PBS glacé, on remet en suspension dans du PBS contenant 100 U /ml d'ARNase A et incubées à 37 ° C pendant 30 min, les cellules ont été colorées avec du PI (20 mg /ml) et analysées en utilisant un FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), comme décrit précédemment [25].
In vitro
kinase tests
Les activités de CDK2, CDK4 et GSK-3β ont été mesurées comme décrit précédemment [26, 27]. En bref, la CDK2, de la CDK4 ou de la GSK-3β a été immunoprécipité à partir cytosolique (100 mg de protéine) ou nucléaire (25 mg de protéine) extraits. L'activité kinase a été mesurée par incubation immunoprécipitée CDK2, CDK4 ou GSK-3β dans 40 ml de tampon de kinase avec 4 mg de protéine Snail recombinante (pour mesurer l'activité de la kinase GSK-3β-associés), 5 mg d'histone H1 (pour mesurer la CDK2 associée à la kinase activité) ou une protéine de rétinoblastome (pour mesurer l'activité de la kinase CDK4 associée) à 30 ° C pendant 30 min. Les échantillons ont été traités comme décrit dans les rapports antérieurs [28] Les résultats de l'inhibition
. De la GSK-3β atténue HMBA induit un arrêt du cycle cellulaire et la différenciation des cellules SGC7901
SGC7901 cellules accumulées au G0 /G1 point de contrôle du cycle cellulaire et différenciées en un phénotype entérocytes comme après le traitement avec HMBA [29]. GSK-3β contribue à l'inhibition de la progression du cycle cellulaire dans les cellules différenciées [20, 30]. Par conséquent, si la GSK-3β joue un rôle dans l'inhibition SGC7901 du cycle cellulaire induite par le HMBA a été étudiée. Comme cela est démontré dans la figure 1a, le traitement avec des cellules induites HMBA à accumuler au G0 /G1 point de contrôle du cycle cellulaire. Traitement avec du chlorure de lithium (LiCl), qui inhibe la GSK-3β en Mg 2+ de manière compétitive [31], l'augmentation de la proportion de cellules dans la phase S. Le traitement avec une combinaison de LiCl et du HMBA HMBA inversé médié par un arrêt de la cellule G1. Des résultats similaires ont été obtenus après le traitement avec le SB-415286, un inhibiteur puissant de GSK-3β [32] (fichier supplémentaire 1). Ces résultats suggèrent que GSK-3β pourrait jouer un rôle dans induite HMBA-G1 arrestation. Pour déterminer si le HMBA a entraîné la mort cellulaire pendant la période de traitement de 24 h, on a extrait la protéine pour déterminer si on a augmenté le clivage PARP et /ou active la caspase-3. Comme le montre la figure 1b, il n'y avait pas d'augmentation de clivage PARP et active la caspase-3 jusqu'à 48 heures après le traitement du HMBA. Un événement précoce important dans la différenciation terminale des cellules est leur retrait du cycle cellulaire [6]. Étant donné que la GSK-3β est documenté pour jouer un rôle dans l'arrêt du cycle cellulaire [33], on a émis l'hypothèse que l'inhibition de la GSK-3β pourrait inhiber la différenciation. Par conséquent, les effets des inhibiteurs de GSK-3ß sur l'induction du HMBA à médiation par l'expression de la pompe à protons gastrique, un marqueur de différenciation gastrique ont été examinés. SGC7901 cellules ont été prétraitées avec du LiCl (Figure 1c et 1d) ou SB-415286 (figure 1e et 1f) à diverses concentrations pendant une heure, puis traité avec de HMBA pendant 24 h. LiCl gastrique inhibe l'expression de la pompe à protons HMBA induite d'une manière dépendante de la dose. En accord avec ces résultats, SB-415286 bloqué gastrique protéine de la pompe à protons et d'expression de l'ARNm, qui a été induite par HMBA. Pris ensemble, ces résultats indiquent que la GSK-3β joue un rôle important dans la différenciation cellulaire gastrique induite par HMBA. Figure 1 L'inhibition de la GSK-3β atténue HMBA induit un arrêt du cycle cellulaire et la différenciation des cellules SGC7901. A, SGC7901 cellules ont été pré-traitées avec ou sans 10 mM de LiCl pendant 30 minutes suivie d'un traitement de combinaison avec mM HMBA 10 pendant 24 h, suivi avec la quantification de la teneur en ADN par cytométrie en flux. B SGC7901 cellules ont été traitées avec du HMBA (10 mM) pendant 24 h ou 48 h et ont été préparés pour l'analyse par transfert de Western. C & E, SGC7901 cellules ont été prétraitées avec ou sans 10 mM de LiCl ou 10 μMSB-415286 pendant une heure suivie d'un traitement combiné avec 10 mMHMBA pendant 24 h. proton état d'expression de la pompe a été déterminée par analyse western blot. D & C, l'ARN total a été extrait des cellules et l'analyse Q-RT-PCR pour la pompe à protons expression de l'ARNm a été réalisée. (Les données représentent la moyenne ± écart-type; * = p < 0,05 par rapport au témoin; * = p < 0,05 vs. HMBA seul.)
Akt régule la différenciation gastrique induite par HMBA
GSK-3β est inactivé quand il. est phosphorylé en aval Akt [34]. Par conséquent, il serait prévu que l'activation de Akt par PI3-kinase serait associée à une inhibition de la GSK-3β et, par la suite, l'inhibition de la différenciation des cellules gastriques. Pour tester cette hypothèse, SGC7901 cellules ont été infectées avec Ad-Akt ou un vecteur de contrôle. L'infection par Ad-Akt phosphorylée expression accrue de l'Akt, Akt phosphorylée et la protéine GSK-3β (figure 2a), en accord avec les résultats précédents démontrent que les actes de GSK-3ß en tant que substrat de Akt. Comme le montre la figure 2b, l'infection des SGC7901 cellules avec le vecteur adenoviral Ad-Akt seul n'a eu aucun effet sur la pompe à protons gastrique et expression de l'ARNm. Cependant, l'infection par le vecteur Ad-Akt a entraîné une inhibition de l'estomac pompe à protons expression de l'ARNm induit par HMBA par rapport HMBA et de l'infection du témoin (β-gal), un adenovirus, suggérant que la signalisation par la PI3-kinase /Akt régule la cellule gastrique la différenciation induite par le traitement du HMBA. La figure 2 Akt régule la différenciation gastrique induite par le HMBA. A cytosol et les protéines nucléaires ont été extraites à partir de cellules traitées comme il est indiqué et résolues sur SDS-PAGE et transférés avec des anticorps anti-phospho-Akt, -Akt, phospho-GSK-3β et de GSK-3β, en utilisant l'anti-α-tubuline et Topo IIβ que le contrôle de la cytosolique et les fractions nucléaires respectivement. B, l'expression de la pompe à protons a été mesurée en utilisant un transfert de Western a suivi avec l'abondance de quantification. (Les données représentent la moyenne ± écart-type; * = p < 0,05 par rapport au témoin; † = p < 0,05 vs. HMBA seul.). C, l'ARN total (40 pg) a été fractionné, transféré sur des membranes de nitrocellulose et sondé avec un ADNc de la pompe à protons marqué; Le traitement des buvards ont été dénudés et resondés avec GAPDH. Avec HMBA a augmenté l'expression et l'activité de la GSK-3β dans le noyau
Pour tester si la GSK-3β a été influencée par le traitement HMBA, l'activité de la GSK-3β a été déterminée en mesurant la phosphorylation de recombinaison d'escargot, un substrat bien caractérisé de la GSK-3β [35, 36]. GSK-3β est situé dans les compartiments cytosoliques et nucléaires des cellules, mais principalement dans le cytoplasme au cours de la phase G1. Par conséquent, les protéines nucléaires et cytoplasmiques ont été fractionnés de cellules témoins et HMBA-traités et examinés pour l'activité GSK-3β. le traitement du HMBA a entraîné une augmentation de l'activité de la GSK-3β nucléaire (Figure 3a), et l'inhibition de la GSK-3β atténué HMBA à médiation par G1 arrêt, ce qui indique un rôle pour la GSK-3β en HMBA induite par l'arrêt du cycle cellulaire. Ser9 la phosphorylation de la GSK-3β diminue l'activité de la GSK-3β, tandis que la phosphorylation Tyr216 augmente l'activité de la GSK-3β [37]. Pour analyser les mécanismes sous-jacents augmentation de l'activité GSK-3β causée par un traitement HMBA, Ser9-phosphorylée et Tyr216-phosphorylée expression de la protéine GSK-3β a été déterminée en utilisant western blot. traitement HMBA niveaux d'expression nucléaires de GSK-3β totale et Tyr216 phosphorylée de GSK-3β a augmenté sans affecter leur expression dans le cytosol (figure 3b). Fait intéressant, le traitement HMBA augmenté Ser9-phosphorylée expression de la protéine GSK-3β tant dans le cytosol et les fractions nucléaires. Des résultats similaires ont été obtenus après le traitement avec d'autres CAH, SAHA et EMBA (fichier supplémentaire 2). En outre, le CHP a augmenté l'activité de GSK-3β dans le noyau comme l'a démontré in vitro
essais in kinases (fichier additionnel 3). Ces résultats suggèrent que le CHP augmente l'activité de la GSK-3β nucléaire, indépendamment de la phosphorylation au niveau Ser9. Figure 3 Le traitement avec le HMBA a augmenté l'expression et l'activité de la GSK-3β dans le noyau. A SGC7901 cellules ont été traitées avec du (+) ou sans (-) 10 mMHMBA pendant 24 heures, et récoltées à la fin du traitement. Cytosol et les fractions nucléaires ont été préparés et l'activité de la GSK-3β a été testée par analyse in vitro de la kinase en utilisant la protéine Snail comme substrat. signaux des protéines phosphorylées ont été escargot densitométrie a quantifié et exprimé en tant que facteur de variation par rapport aux groupes témoins non traités. B SGC7901 cellules ont été traitées avec 10 mM de HMBA à des moments différents. Cytosoliques et de protéines nucléaires fractions ont été extraites et western blot a été réalisée en utilisant des anticorps de GSK-3β, phospho-GSK-3β (Ser9), phospho-GSK-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-tubuline ou Topo IIβ.
L'inhibition de la GSK-3β remplace l'inhibition de la CDK2 HMBA induite
progression dans G1 dépend de CDK2 et CDK4 [38, 39]. Pour déterminer si la réglementation GSK-3β de HMBA médiée arrêt du cycle cellulaire G1 se produit via CDK2 ou CDK4 inhibition, SGC7901 cellules ont été pré-traitées avec LiCl (figure 4a) ou SB-415286 (figure 4b), puis soumis à un traitement de combinaison avec HMBA pendant 24 h avant les essais d'immunoprécipitation ont été réalisées sur des lysats cellulaires en utilisant des anticorps anti-CDK2 ou anti-CDK4, respectivement. En outre, la CDK2 ou l'activité de CDK4 a été déterminée en utilisant une vitro
kinase test in. Le traitement avec HMBA seule inhibé l'activité de CDK2 (en haut, à gauche), mais l'activité de CDK4 augmenté (en haut, à droite); l'inhibition de la GSK-3β à l'aide LiCl ou SB-415286 a significativement atténué HMBA inhibition de l'activité CDK2 (en bas). Le traitement avec le HMBA a augmenté l'expression et l'activité de la GSK-3β dans le noyau. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que la GSK-3β contribue à HMBA à médiation par un arrêt du cycle cellulaire de G1 par l'inhibition de la CDK2. Figure 4: Inhibition de la GSK-3β a priorité sur l'inhibition de la CDK2 induite HMBA. SGC7901 cellules ont été prétraitées avec du (+) ou sans (-) 10 mM LiCl (A) ou 10 uM de SB-415286 (B) pendant 30 minutes suivie d'un traitement combiné avec 10 mM HMBA pendant 24 h. Les extraits de protéine ont été immunoprécipités avec des anticorps anti-anti-CDK4 ou CDK2. complexes immuns résultants ont été analysés pour l'activité de CDK2 utilisant histone H1 comme substrat (panneau supérieur) ou pour une activité de CDK4 utilisant Rb comme substrat (panneau inférieur). signaux H1 histone phosphorylée ou de protéine Rb ont été quantifiées par densitométrie et exprimés en facteur de variation par rapport aux groupes témoins non traités.
GSK-3β réglemente p27Kip1protein nucléaire expression
Pour examiner les mécanismes sous-jacents HMBA médiation G1 arrestation et de l'inhibition de la CDK2 plus loin, le cycle cellulaire de régulation expression de l'ARNm a été analysé en utilisant des analyses de l'APR. Le traitement avec HMBA augmenté P27 d'expression Kip1 ARNm mais a diminué p53, p57, P15 (figure 5A à droite), la cycline A et la cycline D1 expression de l'ARNm (figure 5A gauche). Cependant, le traitement avec LiCl augmenté p21 expression Waf1 ARNm mais n'a pas affecté les niveaux d'autres gènes d'expression. Des résultats similaires ont été obtenus lorsque les cellules ont été traitées avec le SB-415286 (fichier complémentaire 4). Ces résultats suggèrent que la régulation de la GSK-3β du HMBA à médiation par un arrêt du cycle cellulaire ne comporte pas la régulation transcriptionnelle de gènes liés au cycle cellulaire. La figure 5 l'expression d'ARNm de gènes en ce qui concerne le cycle cellulaire. A, RNase de protection ont été effectuées en utilisant l'ARN provenant SGC7901 cellules traitées avec soit mM HMBA 10 mM LiCl 20, ou une combinaison de HMBA et de LiCl pendant 24 h, hybridées avec des multi-sondes pour des inhibiteurs du cycle cellulaire de la kinase dépendante (A; hCC- 2) ou cyclines (B; hCYC-1). B, les cellules SGC7901 ont été pré-traitées avec (+) ou sans (-) 10 mM LiCl (à droite) ou 10 uM SB-415286 (à gauche) pendant 30 min suivi d'un traitement de combinaison avec mM HMBA 10 pendant 24 h. des extraits protéiques de cellules entières ont été résolues sur SDS-PAGE, transférés sur des membranes de PVDF et immunotransfert avec des anticorps anti p27Kip1, p21WAF1, CDK2 ou β-actine. Le plus Pour analyser les mécanismes sous-tendant l'arrêt du cycle cellulaire de la GSK-3β associée en outre, l'expression de p21 p27 Waf1 et Kip1 protéines dans les cellules traitées avec SGC7901 HMBA en présence ou en l'absence de LiCl ou SB-415286 a été examiné. L'addition de LiCl (figure 5B droite) ou SB-415286 (figure 5B gauche) a atténué l'induction de p27 Kip1 mais pas p21 Waf1 expression de la protéine, ce qui suggère que p27 Kip1 participe aux transitions du cycle cellulaire régulé par GSK-3β. Quand p27 Kip1 accumule dans le noyau, il se lie à la CDK2, inhibant son activité, et, éventuellement, induit un arrêt du cycle cellulaire. En outre, HMBA (10 mM) a augmenté p27 Kip1 expression de la protéine dans le cytosol et le noyau 0-24 h après le traitement (figure 6a). HMBA (0-5 mM) a augmenté p27 expression Kip1 après 24 h dans les fractions cytosoliques et après 48 h HMBA (5-10 mM) a augmenté p27 d'expression Kip1 dans les fractions nucléaires (Figure 6b). L'addition de LiCl (Figure 6c) ou SB-415286 (Figure 6d) bloqué HMBA-augmentation de p27 Kip1 expression nucléaire sans affecter p27 expression Kip1 dans le cytosol, ce qui suggère une réglementation spécifique de p27 nucléaire d'expression Kip1 par GSK-3β. Pour démontrer le rôle de GSK-3β dans la régulation du p27 nucléaire expression Kip1 plus, les cellules ont été transfectées avec le siRNA dirigé contre GSK-3β (figure 6e). suppression de l'ARNi médiée par GSK-3β a été confirmée par immunotransfert et atténué p27 nucléaire Kip1 d'induction par HMBA sans affecter cytosolique p27 Kip1 induction. Pour confirmer le rôle de GSK-3β dans la régulation du p27 nucléaire expression Kip1, SGC7901 cellules ont été transfectées avec un vecteur codant pour la forme activée de GSK-3β (GSK-3β-CA) ou un contrôle vecteur vide. Cytosol et les protéines nucléaires ont été extraites et western blot a été réalisée pour déterminer p27 expression Kip1. Transfection de cellules avec le plasmide SGC7901 GSK-3βCA a entraîné une augmentation p27 Kip1 dans la fraction nucléaire (figure 6F) sans affecter p27 niveaux Kip1 dans le cytosol. Over-expression de la forme active de la GSK-3β a été confirmée par Western blot et in vitro
kinase en utilisant des dosages de protéine Snail comme substrat (Figure 6G). Pris ensemble, ces résultats indiquent que GSK-3β participe à la régulation du cycle cellulaire par la régulation spécifique de p27 nucléaire Kip1 protéines d'expression. Figure 6 p27 nucléaire expression Kip1 modulée par GSK-3β. A & B SGC7901 cellules ont été traitées avec du HMBA (10 mM), sur un décours temporel (A) ou avec diverses concentrations pendant 24 h. Cytosoliques et de protéines nucléaires fractions ont été extraites et western blot a été réalisée avec des anticorps à p27Kip1, α-tubuline ou Topo IIβ. C& D SGC7901 cellules ont été pré-traitées avec du (+) ou sans (-) 20 mM LiCl (C) ou 10 uM de SB-415286 (D) pendant 30 minutes suivie d'un traitement combiné avec 10 mM HMBA pendant 24 h. Cytosol et les protéines nucléaires ont été extraites pour l'analyse des p27Kip1 expression de la protéine. E, SGC7901 cellules ont été transfectées avec le siRNA dirigé vers GSK-3β ou siRNA contrôle. Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules ont été traitées avec le HMBA pendant un temps supplémentaire de 24 h. Cytosol et les protéines nucléaires ont été extraites pour l'analyse des p27Kip1 expression de la protéine. Knockdown d'expression GSK-3β a été confirmée par Western blot en utilisant un anticorps anti-GSK-3β. F, SGC7901 cellules ont été infectées avec Ad-HA-GSK-3βS9A ou Ad-β-gal à une MOI de 10 pfu /cellule. Après 48 heures d'incubation, le cytosol et les protéines nucléaires ont été extraites et western blot effectuées en utilisant anti-p27Kip1, anti-HA et-GSK-3 anticorps anti, en utilisant respectivement anti-α-tubuline ou Topo IIβ que le contrôle de chargement. les activités de GSK-3ß ont été analysés par test in vitro de kinase en utilisant une protéine Snail comme substrat (panneau inférieur). les signaux de P27KIP1 ont été quantifiés par densitométrie et sont exprimés en facteur de variation par rapport à l'a-tubuline ou TopIIβ.
GSK-3β régule p27Kip1binding à la CDK2 de HMBA augmentation p27 Kip1 expression de la protéine, l'augmentation de l'activité de la CDK4 de l'activité de la CDK2 inhibé et (figure 4). Extraits de contrôle ou cellules HMBA-traitées ont été immunoprécipités pour enquêter sur p27 liaison Kip1 à CDK2 et CDK4. Comme il est démontré sur la figure 7a, le traitement HMBA a augmenté le niveau de p27 Kip1 dans les complexes immunoprécipités avec un anticorps anti-CDK2, mais pas dans les complexes immunoprécipités avec un anti-CDK4. Re-sonder les filtres avec anti-CDK2 et des anticorps anti-CDK4 ont confirmé que les immunoprécipités de cellules témoins et HMBA traités contenaient les mêmes niveaux de CDK2 et CDK4. Par conséquent, le HMBA semble provoquer une augmentation sélective de la p27 Kip1 de liaison à la CDK2. Pour analyser si l'inhibition de GSK-3β affecte l'association de p27 Kip1 avec CDK2, SGC7901 cellules ont été pré-traitées avec LiCl ou SB-415286 et soumis à un traitement combiné avec HMBA pendant 24 h; des extraits de cellules entières ont été immunoprécipités. Le traitement avec les inhibiteurs de GSK-3ß, de LiCl (figure 7b) ou SB-415286 (figure 7c) est bloqué p27 Kip1 de liaison à la CDK2. Ces résultats suggèrent que la GSK-3β est essentielle pour la p27 induite par HMBA accrue Kip1 de liaison à la CDK2. Pour confirmer le rôle de GSK-3β dans la régulation du p27 association Kip1 avec CDK2, SGC7901 cellules ont été transfectées avec un vecteur codant pour la forme activée de GSK-3β ou Ad-β-gal. protéines cellules entières a été extrait et immunoprécipité. Comme présenté sur la figure 7d, la transfection de cellules avec SGC7901 le vecteur de GSK-3β-CA a donné lieu à une augmentation du niveau de p27 Kip1 dans les complexes immunoprécipités avec un anticorps anti-CDK2 par rapport à la transfection du plasmide de contrôle. Ceci suggère que GSK-3β est non seulement nécessaire pour p27 HMBA médiée liaison Kip1 à CDK2, mais aussi suffisante pour augmenter l'association de p27 Kip1 avec CDK2 dans SGC7901 cellules. Figure 7 de régulation GSK-3β de p27 Kip 1 association avec CDK2. A SGC7901 cellules ont été traitées avec du (+) ou sans - 10 mM de HMBA pendant 24 h (). Les extraits de protéine ont été immunoprécipités avec des anticorps anti-anti-CDK4 ou CDK2. IgG normale de lapin a été utilisé comme témoin. Le p27Kip1 CDK2 ou CDK4 associée dans les complexes immuns résultants a été analysé par western blot en utilisant un anticorps anti-p27Kip1 avec anti-CDK2 ou de l'anticorps -CDK4 comme témoins de chargement. B & C, SGC7901 cellules ont été pré-traitées avec (+) ou sans (-) 10 mM LiCl (B) ou 10 uM SB-415286 (C) pendant 30 minutes suivie d'un traitement de combinaison avec mM HMBA 10 pendant 24 h. Les extraits de protéine ont été immunoprécipités avec un anticorps anti-CDK2. La CDK2 associée p27Kip1 dans les complexes immuns résultants a été analysé semblable à A. D, SGC7901 cellules ont été infectées avec Ad-HA-GSK-3βCA ou contrôle vectoriel (Ad-β-gal) à une MOI de 10 pfu /cellule. Après 48 heures d'incubation, la protéine de cellule entière a été extraite et immunoprécipités avec un anticorps anti-CDK2 (panneau supérieur). p27Kip1 a été analysé par western semblable à A. surexpression de HA-tagged GSK-3CA blot a été confirmée par Western blot en utilisant un anticorps anti-GSK-3β (panneau inférieur). l'activité de la GSK-3β a été testée par un essai in vitro
dosage de kinase en utilisant la protéine Snail comme substrat (panneau inférieur). Rapport de The PI3-kinase /Akt /GSK-3β voie de signalisation a été impliquée dans la régulation de la croissance cellulaire, l'apoptose et la différenciation de divers types de cellules [46]. Dans la présente étude, l'inhibition de GSK-3β utilisant des approches complémentaires (ie l'inhibition chimique et constitutivement active Akt surexpression) proton atténué pompe expression, une mesure de différenciation gastrique semblables, dans la lignée de cellules SGC7901 dérivées de tumeurs gastriques.
la prolifération cellulaire et la différenciation sont traditionnellement perçus comme des processus réciproques, avec le retrait du cycle cellulaire étant requis pour la différenciation terminale [40], et P27 Kip1 jouant un rôle important [41, 42]. délétion génétique de p27 mais pas p21 a été démontré qu'elle affecte la différenciation des cellules gastriques, tandis que p27 forcée expression Kip1 conduit à la différenciation, ce qui suggère que p27 Kip1 est plus important que p21 Waf1 dans la régulation des cellules gastriques différenciation. En accord avec ces résultats, l'inhibition de la différenciation GSK-3β atténué HMBA médiée gastrique cellulaire et l'inhibition de GSK-3β bloqué HMBA médiée par p27 nucléaire expression Kip1, tandis que la surexpression de la forme active de GSK-3β accrue nucléaire p27 expression Kip1, ce qui suggère un rôle important dans la régulation de la différenciation des cellules gastriques par la régulation de p27 nucléaire d'expression Kip1.
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