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P27KIP1, regulado por la glucógeno sintasa quinasa-3β, da como resultado la diferenciación inducida por HMBA de P27 cells

cáncer gástrico humano Kip1, regulado por la glucógeno sintasa quinasa-3β, da como resultado la diferenciación inducida por HMBA de células de cáncer gástrico humano
Resumen Antecedentes

el cáncer gástrico es la segunda causa más común de mortalidad mundial relacionada con el cáncer. Aunque desdiferenciación predice mal pronóstico en el cáncer gástrico, la desdiferenciación mecanismo molecular subyacente, lo que podría proporcionar conocimientos fundamentales en el desarrollo y progresión tumoral, aún no se ha dilucidado. Además, el mecanismo molecular que subyace a los efectos de hexametileno bisacetamida (HMBA), un inductor de la diferenciación recientemente descubierto, requiere una investigación y no hay estudios informaron sobre el efecto de HMBA sobre el cáncer gástrico.
Métodos
Sobre la base de los resultados de análisis FACS, los niveles de las proteínas implicadas en el ciclo celular o la apoptosis se determinó utilizando el Western Blot después de los tratamientos individuales y combinaciones secuenciales de HMBA y LiCl. GSK-3β y la bomba de protones fueron investigados por el Western Blot después hasta la regulación de la expresión de Akt por la infección con Ad-Akt. Para investigar los efectos de HMBA sobre la localización de proteínas y la actividad de GSK-3β, CDK2 y CDK4, ensayos quinasa, inmunoprecipitación y Western Blot se realizaron. Además, la transferencia de Northern y ensayos de protección de RNasa se llevaron a cabo para determinar la concentración funcional de HMBA.
Resultados
HMBA aumento de la expresión p27Kip1 y la detención del ciclo celular inducida asociada con la diferenciación de células epiteliales gástricas. Además, el tratamiento de las células gástricas derivados con paro G0 /G1 HMBA inducido y la regulación de la bomba de protones, un marcador de la diferenciación de cáncer gástrico. Por otra parte, el tratamiento con HMBA aumento de la expresión y la actividad de GSK-3β en el núcleo pero no el citosol. HMBA disminución de la actividad CDK2 y la expresión de p27Kip1 inducida, lo que podría ser rescatado por la inhibición de la GSK-3β. Además, HMBA aumentó p27Kip1 unión a CDK2, y esto fue abolida por la inhibición de GSK-3β.
Conclusiones
Los resultados presentados en este documento sugieren que las funciones de GSK-3ß mediante la regulación de montaje p27Kip1 con CDK2, por lo tanto juega un papel crítico en G0 /G1 detención asociada con la diferenciación de las células epiteliales gástricas inducidas por HMBA.
Palabras clave
HMBA cáncer gástrico Antecedentes GSK-3β
el cáncer gástrico es uno de los cánceres más comunes en el mundo y, a menudo desarrolla resistencia a la quimioterapia y la radiación tratos. Por lo tanto, la terapia de combinación se ha propuesto para hacer frente a la enfermedad mejor y para reducir la probabilidad de desarrollar resistencia a [1]. bisacetamida de hexametileno (HMBA), un compuesto polar híbrido (HPC) desarrollado originalmente como un agente inductor de la diferenciación [2-6], causa gástrico de células re-diferenciación [7-9].
En el estómago, las células en el vástago zona de proliferación celular de la región del istmo de las glándulas gástricas diferenciar y dan lugar a diversos tipos de células [10, 11]. Una vez que el primer evento tumorigénico se lleva a cabo, la progresión del tumor depende de la naturaleza del suceso iniciador y la etapa de desarrollo de la célula que sustenta y mutaciones adicionales que podrían ocurrir. proliferación constante es una característica esencial de las células madre, y en los tejidos gastrointestinales mutaciones son susceptibles de dar lugar a la expansión de las células madre alterados, aumentando la probabilidad de mutaciones adicionales y la progresión del tumor [12]. Por lo tanto, dirigirse a las células madre de cáncer gástrico es probable que sea la forma más eficaz de tratar el cáncer gástrico. Aproximadamente el 50% de la población occidental desarrolla metaplasia, un paso clave en el desarrollo del cáncer [13], llamando la atención a las vías que controlan la proliferación y por lo tanto la diferenciación celular. Entre estos, el TGF-b, Myb, Wnt y Hedgehog vías son de especial relevancia, ocupan un lugar destacado en la celda de destino y la formación de patrones durante la embriogénesis renovación de los tejidos y de adultos. La elucidación de supresor de tumor complejo y vías de señalización de aceleración, cuyo efecto la diferenciación de células de transición de modulación /progenitoras, será fundamental para la optimización de la terapéutica para el tratamiento de cáncer gástrico.
Para que las células gástricas inmaduros para diferenciar, que requieren para permanecer en la fase G1 del ciclo celular durante un cierto período de tiempo. El ciclo celular en mamíferos está regulado por la activación secuencial y la inactivación de una familia altamente conservada de las quinasas dependientes de ciclina (CDKs); progresión a través de principios y mediados de G1 depende de CDK4 y CDK6 posiblemente, mientras que la progresión hasta finales de G1 y la fase S requiere la activación de CDK2. Las actividades de CDK pueden ser inhibidas por la unión de las proteínas inhibidoras de CDK que incluye la familia Cip /Kip (p21 Waf1, p27 Kip1 y p57 Kip2) y la familia INK4 (p15Ink4b, p16Ink4a, p18INK4C y p19Ink4d ). P27 Kip1 está regulada post-transcripcionalmente por la degradación proteolítica. CDK2 se une a p27 Kip1 y fosforila en treonina 187 [14], y la diferenciación de las células gástricas inducidas por HMBA está asociada con la sobre regulación de p27 Kip1 [15, 16] y G0 /G1 detención. Sin embargo, hay pocos estudios detallados sobre el mecanismo molecular de HMBA y no se han reportado estudios que investigan el efecto de HMBA sobre el cáncer gástrico.
Como objetivo abajo de la fosfatidilinositol-3 quinasa /Akt (PI3-kinase /Akt ) vía, la GSK-3β regula la proliferación y la diferenciación celular [17-20]. La acumulación de pruebas indica que la señalización de GSK3 hipoactivo, que funciona en G1 para recibir la entrada de varios de señalización y las vías de desarrollo, se produce en asociación con diversos cánceres humanos [21, 22]. GSK-3β ha sido implicado en varios procesos biológicos, ya que fosforila una amplia gama de sustratos, incluyendo varios puntos de control de diferenciación, incluyendo c-Myc, caracol y PI3K [23]. Anteriormente, se demostró que la inhibición de la vía de PI3-quinasa para mejorar la diferenciación celular gástrica mediada por HMBA [8]. En este estudio, el papel de GSK-3β durante la diferenciación celular gástrica se investigó usando la línea celular de cáncer gástrico humano SGC7901, que muestra un fenotipo pluripotente y representa un modelo bien caracterizado de la diferenciación gástrico. Los resultados sugieren un papel de aportación para GSK-3β en el p27 vía Kip1 durante la diferenciación celular gástrica inducida por HMBA.
Métodos Cultivo de células
México La línea celular de cáncer gástrico SGC7901 se obtuvo del banco de células en la Academia de Ciencias de china y se cultivaron como se describe anteriormente [24]. SGC7901 células se infectaron con un adenovirus que codifica la forma activada de Akt (Ad-Akt) o el control de adenoviral vector que codifica β-galactosidasa (β-gal) a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 pfu /célula. Después de la infección con vectores durante una hora, seguido de la sustitución del medio y la incubación durante otras 24 h, las células se trataron en presencia o ausencia de HMBA, y la proteína y el ARN se extrajeron para el Western Blot y del Norte, respectivamente.
Materiales
HMBA, TSA, SB-415286 y LiCl se adquirieron de Sigma Chemical Company, EE.UU.. Los vectores de adenovirus que codifican β-gal y la forma activa de Akt myristoylated (Ad-Akt) se adquirieron de Cell Biolabs, EE.UU.. El vector que codifica el mutante catalíticamente activa de GSK3 (HA-GSK-3βCA) se adquirió de Addgene. No director de control de siRNA y el SmartPool para la orientación de GSK-3β se adquirieron de Dharmacon, EE.UU.. Todas las sondas se marcaron con un kit de marcado de ADN Prime biotina Random (Pierce). Los anticuerpos

conejo anti-Akt, anti-fosfo-Akt (Ser473) y antiphospho-GSK-3β (Ser9) se adquirieron de Cell Signaling , ESTADOS UNIDOS. Mouse anti-GSK-3β, ratón anti-p27 Kip1, ratón anti-Top IIb y el ratón anti-p21 Waf1 se compraron de BD Biosciences, EE.UU.. Mouse anti-fosfo-GSK-3 (Tyr278 /Tyr216) se obtuvo de Upstate, EE.UU.. Anticuerpo de conejo anti-PARP escindido fue adquirido de Abcam, EE.UU.. bomba de anti-protones fue comprado a MBL Internacional (EE.UU.). Policlonales anti-CDK2, anti-CDK4, anti-α-tubulina y anti-caspasa-3 se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (EE.UU.).
Se extrajeron de extracción de proteínas Sub-celular y el Western Blot
Nuclear y fracciones citosólicas utilizando un kit de NE-PER nucleares y citoplasmáticas de extracción Reactivos (Pierce, EE.UU.). proteína citosólica (80 mg) o la proteína nuclear (20 mg) se resolvió en un gel de poliacrilamida al 10% y se transfirieron a membranas de PVDF como se describe anteriormente [25]. Los filtros se incubaron durante una hora a temperatura ambiente en solución secante. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios seguido de transferencia con un anticuerpo secundario de rábano picante conjugada con peroxidasa durante una hora, y se visualizaron utilizando un sistema de detección ECL.
Transferencia de Northern y ensayos de protección de RNasa (RPA)
Total se preparó ARN usando el reactivo TRIzol (Invitrogen). Las muestras se corrieron en geles de agarosa al 1,2% /formaldehído y se transfirieron a nitrocelulosa soportada. Las membranas se hibridaron con una sonda de ADNc de la bomba de protones gástrica marcado con biotina. Después de la hibridación con la sonda de GAPDH, un control de carga, las membranas se lavaron y se detectaron señales usando un sistema de detección ECL. experimentos de protección de RNasa se realizaron utilizando el kit RPA-III de Ambion y el sistema de ensayo de protección de RNasa RiboQuant MultiProbe se utilizó para la detección de múltiples mRNAs específicos. El análisis del ciclo celular
32 P-etiquetados sondas de ARN antisentido se prepararon utilizando los HCC-2 y hCYC-1 plantilla fija de apoptosis humano y se realizaron hibridaciones de acuerdo con el protocolo del fabricante.
células de cáncer gástrico ha sido capturado mediante tripsina . Las células se recogieron, se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo y se fijaron en etanol helado al 70%. Después de ser lavado dos veces con hielo frío PBS, se resuspendieron en PBS que contiene 100 U /ml de RNasa A y se incubó a 37 ° C durante 30 min, las células se tiñeron con PI (20 mg /ml) y se analizaron mediante FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.), tal como se describe anteriormente [25].
in vitro
ensayos quinasa
Las actividades de CDK2, CDK4 y GSK-3β se midieron como se describe anteriormente [26, 27]. Brevemente, CDK2, CDK4 o GSK-3β se inmunoprecipitó a partir citosólica (100 mg de proteína) o nuclear (25 mg de proteína) de extractos. La actividad quinasa se midió incubando inmunoprecipitado CDK2, CDK4 o GSK-3β en 40 ml de tampón de quinasa con 4 mg de proteína Snail recombinante (para medir la actividad quinasa asociada-GSK-3β), 5 mg de histona H1 (para medir la quinasa CDK2 asociadas actividad) o la proteína retinoblastoma (para medir la actividad de la quinasa CDK4-asociado) a 30 ° C durante 30 min. Las muestras se procesaron tal como se describe en los informes anteriores [28].
Resultados
La inhibición de la GSK-3β atenúa la detención del ciclo celular inducida por HMBA y la diferenciación celular SGC7901
SGC7901 células acumuladas en el punto de control del ciclo celular G0 /G1 y diferenciarse en un fenotipo similar al enterocito después del tratamiento con HMBA [29]. GSK-3β contribuye a la inhibición de la progresión del ciclo celular en células que se diferencian [20, 30]. Por lo tanto, si GSK-3β juega un papel en la inhibición del ciclo celular SGC7901 HMBA inducida fue investigado. Como se demuestra en la Figura 1a, el tratamiento con células HMBA inducida a acumularse en el puesto de control del ciclo celular G0 /G1. El tratamiento con cloruro de litio (LiCl), que inhibe la GSK-3β en un Mg 2 + manera competitiva [31], el aumento de la proporción de células en la fase S. El tratamiento con una combinación de LiCl y HMBA invierte arresto celular G1 mediada por HMBA. Resultados similares fueron obtenidos después del tratamiento con SB-415286, un potente inhibidor de GSK-3β [32] (archivo adicional 1). Estos resultados sugieren que la GSK-3β podría desempeñar un papel en la detención de G1 HMBA inducida. Para determinar si HMBA resultó en la muerte celular durante el período de tratamiento de 24 h, se extrajo la proteína para evaluar si hubo una mayor PARP división y /o activa la caspasa-3. Como se demuestra en la Figura 1b, no hubo aumento en la escisión de PARP y activa la caspasa-3 hasta 48 h después del tratamiento HMBA. Un evento temprano importante en la diferenciación terminal de las células es su retirada del ciclo celular [6]. Desde GSK-3β se documenta a desempeñar un papel en la detención del ciclo celular [33], se postuló que la inhibición de GSK-3β podría inhibir la diferenciación. Por lo tanto los efectos de los inhibidores de GSK-3ß sobre la inducción de la expresión de la bomba de protones gástrica mediada por HMBA, un marcador de diferenciación gástrico, se examinaron. SGC7901 células se pre-trataron con LiCl (Figura 1c y 1d) o SB-415286 (Figura 1e y 1f) a diversas concentraciones durante una hora, y después se trató con HMBA para 24 h. LiCl inhibió la expresión de la bomba de protones gástrica inducida por HMBA en una forma dependiente de la dosis. De acuerdo con estos resultados, SB-415286 bloqueado proteína de la bomba de protones gástrica y la expresión de ARNm, que fue inducida por HMBA. Tomados en conjunto, estos resultados indican que GSK-3β juega un papel importante en la diferenciación celular gástrica mediada por HMBA. Figura 1 La inhibición de la GSK-3β atenúa la detención del ciclo celular inducida por HMBA y la diferenciación celular SGC7901. A, SGC7901 células se trataron previamente con o sin LiCl 10 mM durante 30 min seguido de tratamiento de combinación con HMBA 10 mM durante 24 h, seguido de cuantificación del contenido de ADN por citometría de flujo. B, SGC7901 células se trataron con HMBA (10 mM) durante 24 h o 48 h y se prepararon para el análisis de Western Blot. C & E, SGC7901 células se pre-trataron con o sin LiCl 10 mM o 10 μMSB-415286 durante una hora seguido por tratamiento de combinación con 10 mMHMBA para 24 h. protones estado de la expresión de la bomba se determinó mediante análisis de Western Blot. D & F, el ARN total se extrajo de las células y se realizó el análisis de Q-RT-PCR para la expresión de ARNm de la bomba de protones. (Los datos representan la media ± SD; * = p < 0,05 frente a control; * = p < 0,05 vs. HMBA solo.)
Akt regula la diferenciación gástrica inducida por HMBA
GSK-3β se inactiva cuando. es fosforilado aguas abajo de Akt [34]. Por lo tanto, se predijo que la activación de Akt por PI3-quinasa se asocia con la inhibición de la GSK-3β y, posteriormente, la inhibición de la diferenciación de células gástrico. Para probar esta hipótesis, SGC7901 células fueron infectadas con Ad-Akt o un vector control. La infección con Ad-Akt aumento de la expresión de Akt fosforilada, Akt y fosforilados proteína GSK-3β (figura 2a), consistente con resultados previos que demuestran actos que GSK-3ß como un sustrato de Akt. Como se demuestra en la Figura 2b, la infección de SGC7901 células con el vector adenoviral Ad-Akt solo no tuvo ningún efecto sobre la bomba de protones gástrica y la expresión de ARNm. Sin embargo, la infección con el vector Ad-Akt resultó en la inhibición de la expresión del ARNm de la bomba de protones gástrica inducida por HMBA en comparación con HMBA y la infección del control (β-gal) adenovirus, lo que sugiere que la señalización a través de la PI3-quinasa /Akt regula célula gástrica la diferenciación inducida por el tratamiento HMBA. Figura 2 Akt regula la diferenciación gástrica inducida por HMBA. A, citosol y proteínas nucleares se extrajeron de las células tratadas como se indica y se resolvieron en SDS-PAGE y la inmunotransferencia con anti-fosfo-Akt, -Akt, fosfo-GSK-3β, y GSK-3β, usando anti-α-tubulina y Topo IIβ como el control de la citosólica y las fracciones nucleares, respectivamente. B, la expresión de la bomba de protones se midió utilizando el Western Blot siguió con la cuantificación abundancia. (Los datos representan la media ± SD; * = p < 0,05 frente a control; † = p < 0,05 vs. HMBA solo.). C, el ARN total (40 g) se fraccionó, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sondó con un ADNc de bomba de protones marcado; blots fueron despojados y reprobed con GAPDH.
El tratamiento con HMBA aumento de la expresión y la actividad de GSK-3β en el núcleo
Para probar si GSK-3β fue influenciado por tratamiento HMBA, se determinó la actividad de GSK-3β midiendo la fosforilación de Snail recombinante, un sustrato bien caracterizado de GSK-3β [35, 36]. GSK-3β se encuentra en los compartimentos citosólicos y nucleares de las células, pero predominantemente en el citoplasma durante la fase G1. Por lo tanto, las proteínas nucleares y citoplasmáticas se fraccionaron de control y células tratadas con HMBA y se examinó la actividad de GSK-3β. tratamiento HMBA como resultado un aumento en la actividad de GSK-3β nuclear (Figura 3a), y la inhibición de GSK-3β atenuada arresto G1 HMBA mediada, lo que indica un papel para la GSK-3β en la detención del ciclo celular inducida por HMBA. Ser9 fosforilación de GSK-3β disminuye la actividad de GSK-3β, mientras que Tyr216 fosforilación aumenta la actividad de GSK-3β [37]. Para el análisis de los mecanismos que subyacen a la actividad de GSK-3β aumento causado por el tratamiento HMBA, Ser9 fosforilada y la expresión de la proteína GSK-3β-Tyr216 fosforilada se determinó mediante Western Blot. tratamiento HMBA aumentó los niveles de expresión nuclear de total de GSK-3β y fosforilados-Tyr216 GSK-3β sin afectar a su expresión en el citosol (Figura 3b). Curiosamente, el tratamiento HMBA aumento de la expresión de proteína GSK-3β Ser9 fosforilada tanto en el citosol y las fracciones nucleares. Resultados similares fueron obtenidos después del tratamiento con otros HPC, SAHA y EMBA (archivo adicional 2). Además, HPC aumentó la actividad de GSK-3β en el núcleo como se ha demostrado in vitro por
ensayos de quinasa en (archivo adicional 3). Estos resultados sugieren que HPC aumenta la actividad nuclear GSK-3β independientemente de la fosforilación en Ser9. Figura 3 El tratamiento con HMBA aumento de la expresión y la actividad de GSK-3β en el núcleo. A, SGC7901 células se trataron con (+) o sin (-) 10 mMHMBA durante 24 h, y se cosecha al final del tratamiento. Citosol y fracciones nucleares se prepararon y la actividad GSK-3β se ensayó por ensayo de quinasa in vitro usando proteína Snail como sustrato. señales de la proteína fosforilada del caracol se densitométrica cuantificaron y se expresaron como factor de cambio con respecto a los grupos de control no tratados. B, SGC7901 células se trataron con HMBA 10 mM durante diversos tiempos. fracciones citosólicas y proteínas nucleares fueron extraídos y Western Blot se realizó utilizando anticuerpos contra GSK-3β, fosfato GSK-3β (Ser9), fosfato GSK-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-tubulina o Topo IIβ.
La inhibición de la GSK-3β anula la inhibición de CDK2 inducida por HMBA
progresión a través de G1 depende de CDK2 y CDK4 [38, 39]. Para determinar si la regulación de GSK-3β de G1 del ciclo celular mediada por HMBA se produce a través de la inhibición de CDK2 o CDK4, SGC7901 células fueron pre-tratados con LiCl (Figura 4a) o SB-415286 (Figura 4b) y después se sometieron a un tratamiento combinado con HMBA durante 24 h antes de los ensayos de inmunoprecipitación se llevaron a cabo en los lisados ​​celulares usando anticuerpos anti-CDK2 o anti-CDK4, respectivamente. Además, la actividad de CDK2 o CDK4 se determinó usando un ensayo de quinasa in vitro
en. El tratamiento con HMBA sola inhibió la actividad de CDK2 (arriba, izquierda), pero aumentó la actividad de CDK4 (arriba, derecha); la inhibición de la GSK-3β mediante LiCl o SB-415286 atenuó significativamente la inhibición de la actividad CDK2 HMBA (parte inferior). El tratamiento con HMBA aumento de la expresión y la actividad de GSK-3β en el núcleo. En conjunto, estos resultados sugieren que la GSK-3β contribuye a la detención del ciclo celular G1 mediada por HMBA través de la inhibición de CDK2. Figura 4 La inhibición de la GSK-3β anula la inhibición de CDK2 inducida por HMBA. SGC7901 células se pre-trataron con (+) o sin (-) 10 mM LiCl (A) o 10 mM SB-415286 (B) durante 30 minutos seguido de tratamiento de combinación con HMBA 10 mM durante 24 h. Los extractos de proteína se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-CDK4 anti-CDK2 o. complejos inmunes resultantes se analizaron para la actividad de CDK2 utilizando la histona H1 como sustrato (panel superior) o para la actividad de CDK4 usando Rb como sustrato (panel inferior). señales fosforilados histona H1 o la proteína Rb se cuantificaron densitométrica y se expresaron como factor de cambio con respecto a los grupos de control no tratados.
GSK-3β regula la expresión nuclear p27Kip1protein
Para examinar los mecanismos subyacentes HMBA mediada por la detención de G1 y la inhibición de CDK2 más, la expresión del ARNm del ciclo de regulador celular se analizó utilizando ensayos de EPR. El tratamiento con HMBA aumentó P27 Kip1 expresión de ARNm pero disminuyó p53, p57, P15 (Figura 5A derecha), ciclina A y ciclina D1 expresión de ARNm (Figura 5A izquierda). Sin embargo, el tratamiento con LiCl aumenta la expresión de p21 Waf1 ARNm pero no afectó los niveles de expresión de otros genes. Se obtuvieron resultados similares cuando las células fueron tratadas con SB-415286 (archivo adicional 4). Estos resultados sugieren que la regulación de GSK-3β de la detención del ciclo celular mediada por HMBA no implica la regulación transcripcional de los genes relacionados con el ciclo celular. Figura 5 la expresión de ARNm de genes con respecto a la del ciclo celular. A, ensayos de protección de RNasa se realizaron utilizando ARN de SGC7901 células tratadas con cualquiera de HMBA 10 mM, LiCl 20 mM, o una combinación de HMBA y LiCl durante 24 h, se hibridó con múltiples sondas para inhibidores de la quinasa dependiente del ciclo celular (A; hCC- 2) o ciclinas (B; hCYC-1). B, las células SGC7901 se pre-trató con (+) o sin (-) 10 mM LiCl (derecha) o 10 mM SB-415286 (izquierda) durante 30 minutos seguido de tratamiento de combinación con HMBA 10 mM durante 24 h. extractos de proteínas de células enteras se resolvieron en SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF, y a inmunotransferencia con anticuerpos a p27Kip1, p21Waf1, CDK2, o β-actina.
a analizar los mecanismos que subyacen a la detención del ciclo celular asociada-GSK-3β más, la expresión de p21 Waf1 y p27 proteínas Kip1 en SGC7901 células tratadas con HMBA en presencia o ausencia de LiCl o SB-415286 se examinó. La adición de LiCl (Figura 5B derecha) o SB-415286 (Figura 5B izquierda) atenuó la inducción de p27 Kip1 pero no p21 expresión de la proteína Waf1, lo que sugiere que p27 Kip1 participa en las transiciones del ciclo celular regulados por GSK-3β. Cuando p27 Kip1 acumula en el núcleo se une a CDK2, la inhibición de su actividad, y, finalmente, induce la detención del ciclo celular. Además, HMBA (10 mM) aumentó p27 expresión de la proteína Kip1 en el citosol y el núcleo de 0 a 24 h después del tratamiento (Figura 6a). HMBA (0-5 mM) aumentó p27 Kip1 expresión después de 24 h en fracciones citosólicas y después de 48 h HMBA (5-10 mM) aumentó p27 Kip1 expresión en las fracciones nucleares (Figura 6b). La adición de LiCl (Figura 6c) o SB-415286 (Figura 6d) bloqueó el aumento de-HMBA p27 Kip1 expresión nuclear sin afectar p27 expresión Kip1 en el citosol, lo que sugiere una regulación específica de p27 nuclear expresión Kip1 por GSK-3β. Para demostrar el papel de GSK-3β en la regulación de p27 nuclear Kip1 expresión aún más, las células fueron transfectadas con siRNA dirigido contra GSK-3β (figura 6e). supresión de RNAi mediada por GSK-3β se confirmó por inmunotransferencia y atenúa p27 nuclear inducción Kip1 por HMBA sin afectar citosólicas p27 inducción Kip1. Para confirmar el papel de GSK-3β en la regulación de p27 nuclear expresión Kip1, SGC7901 células fueron transfectadas con un vector que codifica la forma activada de GSK-3β (GSK-3β-CA) o un vector de control vacío. Citosol y las proteínas nucleares se extrajeron y se realizó el Western Blot para determinar la expresión de p27 Kip1. La transfección de células con el plásmido SGC7901 GSK-3βCA produjo un aumento de p27 Kip1 en la fracción nuclear (Figura 6F) sin afectar p27 niveles Kip1 en el citosol. La sobreexpresión de la forma activa de la GSK-3β se confirmó mediante Western Blot y ensayos de quinasa in vitro
en el uso de la proteína Snail como sustrato (Figura 6G). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la GSK-3β participa en la regulación del ciclo celular a través de la regulación específica de p27 nuclear Kip1 expresión de la proteína. Figura expresión Kip1 6 p27 Nuclear modulada por GSK-3β. A & B, SGC7901 células se trataron con HMBA (10 mM) durante un transcurso de tiempo (A) o con varias concentraciones de 24 h. fracciones citosólicas y nucleares de proteínas se extrajeron y Western Blot se realizó con anticuerpos frente a p27Kip1, α-tubulina o Topo IIβ. Acampar; D, SGC7901 células se pre-trató con (+) o sin (-) 20 mM LiCl (C) o 10 mM SB-415286 (D) durante 30 minutos seguido de tratamiento de combinación con HMBA 10 mM durante 24 h. Citosol y proteínas nucleares se extrajeron para el análisis de expresión de la proteína p27Kip1. E, SGC7901 células fueron transfectadas con siRNA dirigido a GSK-3β o controlar siRNA. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se trataron con HMBA para un 24 h adicionales. Citosol y proteínas nucleares se extrajeron para el análisis de expresión de la proteína p27Kip1. Desmontables de expresión GSK-3β se confirmó por transferencia de Western usando el anticuerpo anti-GSK-3β. F, SGC7901 células fueron infectadas con Ad-HA-GSK-3βS9A o Ad-β-gal a una MOI de 10 ufp /célula. Después de 48 h de incubación, citosol y la proteína nuclear se extrajeron y el Western Blot realizaron utilizando anti-p27Kip1, anti-HA, y anticuerpos anti-GSK-3, respectivamente, utilizando anti-α-tubulina o Topo IIβ como control de carga. actividades de GSK-3ß se ensayaron mediante ensayo de quinasa in vitro usando proteína Snail como sustrato (panel inferior). p27Kip1 señales se cuantificaron densitométrica y se expresaron como factor de cambio con respecto a alfa-tubulina o TopIIβ.
GSK-3β regula p27Kip1binding de CDK2
HMBA aumentado Kip1 expresión de la proteína, la actividad de CDK2 inhibido y aumento de la actividad de CDK4 p27 (Figura 4). Extractos de control o células tratadas con HMBA se inmunoprecipitaron para investigar p27 Kip1 unión a CDK2 y CDK4. Como se demuestra en la figura 7a, el tratamiento HMBA aumentó el nivel de p27 Kip1 en los complejos inmunoprecipitados con anti-CDK2, pero no en los complejos inmunoprecipitados con anti-CDK4. Re-sondeo de los filtros con anticuerpos anti-CDK4 anti-CDK2 y confirmó que los inmunoprecipitados de control y células tratadas con HMBA contenían los mismos niveles de CDK2 y CDK4. Por lo tanto, HMBA parece causar un aumento selectivo de la p27 Kip1 unión a CDK2. Para analizar si la inhibición de la GSK-3β afecta a la asociación de p27 Kip1 con CDK2, SGC7901 células fueron pre-tratados con LiCl o SB-415286 y se sometieron a un tratamiento combinado con HMBA durante 24 h; Se inmunoprecipitaron extractos de células enteras. El tratamiento con inhibidores de GSK-3ß, LiCl (Figura 7b) o SB-415286 (Figura 7c) bloqueó p27 Kip1 unión a CDK2. Estos resultados sugieren que GSK-3β es esencial para HMBA inducida por aumento de la p27 Kip1 unión a CDK2. Para confirmar el papel de GSK-3β en la regulación de p27 asociación Kip1 con CDK2, SGC7901 células fueron transfectadas con un vector que codifica la forma activada de GSK-3β o Ad-β-gal. proteína de células total se extrajo y se inmunoprecipitaron. Tal como se presenta en la figura 7d, la transfección de células con el SGC7901 vector GSK-3β-CA dio lugar a un mayor nivel de p27 Kip1 en los complejos inmunoprecipitados con anti-CDK2 en comparación con la transfección del plásmido de control. Esto sugiere que la GSK-3β no sólo es necesario para p27 HMBA mediada Kip1 unión a CDK2, sino también suficiente para aumentar la asociación de p27 Kip1 con CDK2 en SGC7901 células. Figura 7 regulación GSK-3β de p27 Kip 1 asociación con CDK2. A, SGC7901 células se trataron con (+) o sin - HMBA 10 mM durante 24 h (). Los extractos de proteína se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-CDK4 anti-CDK2 o. IgG de conejo normal se utiliza como el control. El p27Kip1 CDK2 o CDK4 asociada en los complejos inmunes resultantes se analizó mediante transferencia Western utilizando anti-p27Kip1 anticuerpo con anti-CDK2 o anticuerpo -CDK4 como controles de carga. B & C, SGC7901 células se pre-trató con (+) o sin (-) 10 LiCl mM (B) o 10 mM SB-415286 (C) durante 30 minutos seguido de tratamiento de combinación con HMBA 10 mM durante 24 h. Los extractos de proteína se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-CDK2. El p27Kip1 CDK2 asociados en los complejos inmunes resultantes se analizó similar a A. D, SGC7901 células fueron infectadas con Ad-HA-GSK-3βCA o el control de vectores (Ad-β-gal) a una MOI de 10 ufp /célula. Después de 48 h de incubación, la proteína celular total se extrajo y se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-CDK2 (panel superior). p27Kip1 se analizó mediante transferencia Western similar a A. La sobreexpresión de HA-etiquetados GSK-3CA se confirmó por transferencia de Western usando el anticuerpo anti-GSK-3β (panel inferior). la actividad de GSK-3β se ensayó mediante un ensayo in vitro usando proteína quinasa
Caracol como sustrato (panel inferior).
Discusión Francia El PI3-kinase /Akt vía de señalización /GSK-3β se ha implicado en la regulación del crecimiento celular, la apoptosis y la diferenciación de diversos tipos de células [46]. En el presente estudio, la inhibición de la GSK-3β utilizando enfoques complementarios (es decir, la inhibición química y constitutivamente activa de Akt sobre-expresión) expresión de la bomba de protones atenuada, una medida de la diferenciación gástrica similar, en la línea celular SGC7901 derivado de tumor gástrico.
la proliferación celular y la diferenciación son percibidos tradicionalmente como procesos recíprocos, con la retirada del ciclo celular que se requieren para la diferenciación terminal [40], y p27 Kip1 juega un papel importante [41, 42]. la eliminación genética de p27 pero no de p21 se ha demostrado que afectan a la diferenciación de las células gástricas, mientras que p27 forzada expresión Kip1 conduce a la diferenciación, lo que sugiere que p27 Kip1 es más importante que la p21 Waf1 en la regulación de las células gástricas diferenciación. De acuerdo con estos resultados, la inhibición de GSK-3β atenuada diferenciación celular gástrica HMBA mediada y la inhibición de GSK-3β bloqueado HMBA mediada por p27 nuclear expresión Kip1, mientras que la sobre expresión de la forma activa de GSK-3β aumento nuclear p27 Kip1 expresión, lo que sugiere un papel importante en la regulación de la diferenciación de las células gástricas a través de la regulación de p27 nuclear Kip1 expresión.
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