| Stomach Health > žalúdok zdravie >  > Stomach Knowledges > výskumy

P27Kip1, regulované kináza glykogénsyntázu-3p, vedie k diferenciácii HMBA indukovanej ľudských buniek karcinómu žalúdka

P27 Kip1, regulované kináza glykogénsyntázu-3p, má za následok HMBA indukované diferenciáciu ľudských buniek karcinómu žalúdka
abstraktné
pozadia
žalúdočné rakovina je druhou najčastejšou príčinou globálneho úmrtnosti súvisiacej s rakovinou , Hoci Dediferenciace predpovedá zlou prognózou u rakoviny žalúdka, molekulárnej mechanizmus základný Dediferenciace, ktorý by mohol poskytnúť základné vhľad do vývoja nádorov a progresiou, musia nebol objasnený. Okrem toho je molekulárnej mechanizmus stojaci účinky hexamethylen bisacetamid (HMBA), nedávno objavené diferenciačné induktory, vyžaduje vyšetrovanie a nie sú hlásené žiadne štúdie týkajúce sa vplyvu HMBA na rakovinu žalúdka.
Metódy
na základe výsledkov FACS analýza, hladiny proteínov zapojených do bunkového cyklu a apoptózy boli stanovené pomocou western blotting po jednotlivých ošetrení a sekvenčné kombinácia HMBA a LiCl. GSK-3β a protónovej pumpy boli skúmané pomocou westernovým prenosom po up-reguláciu expresie Akt Ad-Akt infekcie. Ak chcete skúmať účinky HMBA na lokalizáciu proteínu a aktivity GSK-3p, CDK2 a CDK4, kinázy testy, Imunoprecipitácia a western blotting boli vykonané. Okrem toho, severnej blot a testy ochrany RNázy boli vykonané pre určenie funkčné koncentráciu HMBA.
Výsledky
HMBA zvýšenej p27Kip1 expresiu a indukované zastavenie bunkového cyklu spojeného s žalúdočnej epiteliálne bunkovej diferenciácie. Okrem toho, liečenie žalúdočných buniek odvodených s HMBA vyvolané G0 /G1 zástave a up-regulácia protónovej pumpy, markeru diferenciácie žalúdka rakoviny. Okrem toho liečba HMBA zvýšila expresiu a aktivitu GSK-3p v jadre, ale nie cytosolu. HMBA znížil aktivitu a CDK2 indukovanú p27Kip1 výraz, ktorý by mohol byť zachránená inhibíciu GSK-3p. Okrem toho, zvýšenie HMBA p27Kip1 väzbu na CDK2, a to bol zrušený inhibícia GSK-3p.
Závery
Výsledky uvedené v tomto dokumente ukazujú, že GSK-3p funkcie reguláciou zostavy p27Kip1 s CDK2, čím zohrávajú kľúčovú úlohu v G0 /G1 zástava spojená s žalúdočnej epiteliálne diferenciáciu HMBA-indukovanú bunkovú.
Kľúčové
HMBA rakovina žalúdka GSK-3β pozadia
karcinómu žalúdka je jedným z najčastejších nádorových ochorení na svete a často vyvíja rezistenciu k chemoterapii a ožarovaní liečby. Z tohto dôvodu, kombinovaná terapia bolo navrhnuté riešenie choroby lepšie a znížiť pravdepodobnosť vzniku rezistencie [1]. Hexamethylen bisacetamid (HMBA), hybridné polárne zlúčenina (HPC), pôvodne vyvinutý ako indukujúce diferenciáciu činidlá [2-6], spôsobuje žalúdočné bunky re-diferenciáciu [7-9].
V žalúdku, kmeňové bunky v proliferatívne bunky zóna šije oblasti žalúdočných žliaz rozlíšiť a viesť k rôzne typy buniek [10, 11]. Akonáhle je prvý tumorigénny akcia koná, ďalší progresie nádoru, závisí na povahe, štartovať a vývojovej fáze bunky, ktorá je trvalé a ďalšie mutácie, ktoré by mohli nastať. Konštanta proliferácia je dôležitým znakom kmeňových buniek, a v gastrointestinálne tkanive mutácie sú pravdepodobne za následok expanziu zmenených kmeňových buniek, čím sa zvyšuje pravdepodobnosť ďalších mutácií a progresie nádoru [12]. Z tohto dôvodu sa zameraním žalúdočné rakovina kmeňových buniek je pravdepodobné, že bude najefektívnejší spôsob liečenia rakoviny žalúdka. Približne 50% západnej populácie vyvíja metaplázia, kľúčový krok v onkologickej rozvoja [13], upozorňovať na dráhach, ktoré riadia proliferáciu a tým aj diferenciáciu buniek. Medzi nimi je TGF-b, Myb, Wnt a Ježek dráhy majú osobitný význam, predstavovať prominentnú v špecifikácii bunkového osudu a formovanie vzoru počas embryogenézy a dospelých obnove tkanív. Objasnenie komplexného nádorový supresor a urýchľovače signalizačných dráhach, ktoré ovplyvňujú diferenciáciu moduláciu prechodné /progenitorových buniek, bude kľúčové pre optimalizáciu liečiv pre liečbu rakoviny žalúdka.
Aby nezrelých žalúdočných bunkách bolo možné rozlišovať, oni vyžadujú, aby zostali v G1 fáze bunkového cyklu, po určité časové obdobie. Cicavčie bunkový cyklus je regulovaný postupnou aktiváciu a inaktiváciu vysoko konzervované rodiny cyklin-dependentných kináz (CDK); progresie cez čoskoro k strednej-G1 je závislá na CDK4 a prípadne CDK6, zatiaľ čo progresie cez neskorej G1 a S fázy vyžaduje aktiváciu CDK2. Činnosť CDK môžu byť inhibovaná väzba inhibičných proteínov CDK, vrátane rodu Cip /Kip (p21 Waf1, p27 Kip1 a p57 Kip2) a INK4 rodiny (p15Ink4b, p16INK4a, p18Ink4c a p19Ink4d ). P27 Kip1 je regulovaná post-transkripčné proteolytickou degradáciou. CDK2 sa viaže na p27 Kip1 a fosforizuje ju na treonínu 187 [14], a HMBA-indukovanej diferenciácie buniek žalúdka je spojený s up-regulácia p27 Kip1 [15, 16] a G0 /G1 väzenia. Avšak, existuje len málo detailné štúdie týkajúce sa molekulárnej mechanizmus HMBA a tam boli hlásené žiadne štúdie skúmajúce účinok HMBA na rakovinu žalúdka.
Ako downstream cieľ pre fosfatidylinozitol-3 kinázy /Akt (PI3-kinázy /Akt ) chodník, GSK-3β reguluje proliferáciu a diferenciáciu [17-20] buniek. Hromadia sa dôkazy naznačujú, že hypoaktívna GSK3p signalizácia, ktorá funguje v G1 prijímať podnety od niekoľkých signalizácie a vývojové dráhy, sa vyskytuje v súvislosti s rôznymi ľudských nádorov [21, 22]. GSK-3β sa podieľa na mnohých biologických procesoch, pretože fosforyluje celý rad substrátov, vrátane niekoľkých diferenciáciu kontrolných bodov vrátane c-myc, šnek a PI3K [23]. Skôr, inhibícia PI3-kinázy Bolo preukázané, že zvýšenie HMBA-sprostredkovanú bunkovú diferenciáciu žalúdočné [8]. V tejto štúdii, úloha GSK-3p počas diferenciácie buniek žalúdočnej bola skúmaná s použitím rakovina žalúdka bunkovú líniu SGC7901, ktorý zobrazuje multipotentní fenotyp a predstavuje dobre charakterizovaný model žalúdočné diferenciácie. Výsledky naznačujú príspevkové úlohu GSK-3p v p27 Kip1 dráhy počas diferenciácie buniek žalúdočnej indukovanej HMBA.
Metódy Bunková kultúra
žalúdočné bunková línia rakoviny SGC7901 bol získaný z bunkovej banky v čínskej akadémie vied a kultivované ako bolo opísané skôr [24]. SGC7901 bunky boli infikované adenovírusom kódujúcim aktivovanú formu Akt (Ad-Akt) alebo adenovirový kontrolný vektor kódujúci p-galaktozidázy (β-gal) pri multiplicitě infekcie (MOI) 10 PFU /bunku. Po infekcii vektorov po dobu jednej hodiny, s následným nahradením média a inkubácia po dobu ďalších 24 hodín, bunky boli ošetrené v prítomnosti alebo neprítomnosti HMBA a proteínov a RNA boli extrahované pre západné a Northern blotting, v danom poradí.
Materiály
HMBA, TSA, SB-415286 a LiCl boli zakúpené od Sigma Chemical Company, USA. Adenovirové vektory kódujúce beta-gal a myristoylated aktívnu formu Akt (Ad-Akt) boli kúpené od Cell Biolabs, USA. Vektor kódujúci katalyticky aktívny mutant GSK3P (HA-GSK-3βCA) bol zakúpený od Addgene. Non-zacielenie kontrolné siRNA a SMARTpool pre zacielenie GSK-3p boli zakúpené od Dharmacon, USA. Všetky sondy boli značené s Biotín Random Prime DNA Labeling Kit (Pierce).
Protilátky
Králičie anti-Akt, anti-fosfo-Akt (Ser473) a antiphospho-GSK-3β (Ser9) boli zakúpené od firmy Cell Signaling , USA. Myšou anti-GSK-3β, myší anti-p27 Kip1, myší anti-Top IIb a myšou anti-p21 Waf1 boli zakúpené od BD Biosciences, USA. Myšou anti-fosfo-GSK-3 (Tyr278 /Tyr216) bola získaná od Upstate, USA. Králičie anti-štiepené PARP protilátka bola získaná od abca, USA. Anti-protónové pumpa bola kúpená od MBL International (USA). Polyklonálne anti-CDK2, CDK4 anti-anti-α-tubulín a anti-kaspasy-3 bola získaná od Santa Cruz Biotechnology (USA).
Extrakcia Sub-bunkový proteín a western blotting
jadrovej a cytozolové frakcie boli extrahované použitím NE-PER Jadrové a cytoplazme Ťažobné Činidlá kitu (Pierce, USA). Cytozólový proteín (80 mg) alebo nukleárnu proteín (20 mg) bola rozdelená na 10% polyakrylamidovom gélu a prenesené na PVDF membrány, ako bolo opísané skôr [25]. Filtre boli inkubované po dobu jednej hodiny pri izbovej teplote v roztoku blotting. Membrány sa inkubujú cez noc pri 4 ° C s primárnymi protilátkami a následne blotting s chrenovou peroxidázou konjugovanou sekundárnou protilátkou po dobu jednej hodiny, a vizualizované za použitia detekčného systému ECL.
Northern blotting a testy ochrany RNázy (RPA)
Celkom RNA bola pripravená za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen). Vzorky boli o 1,2% agaróza /formaldehydu géloch a prenesené na nitrocelulózu podporované. Membrány boli hybridizovány s biotínom značenej žalúdočnej protónovej pumpy cDNA sondou. Po hybridizácii so sondou GAPDH, kontrola nanášania, membrány sa promyly a signály boli detekované použitím ECL detekčného systému. Pokusy ochrany RNázy boli vykonávané s použitím súpravy RPA-III z Ambion a testovací systém RiboQuant Multiprobe RNase Protection bol použitý pre detekciu viac špecifických mRNA. 32P-značenej antisencie RNA sondy boli pripravené za použitia ľudských apoptózy HCC-2 a hCYC-1 šablóny sady a hybridizácie boli vykonané podľa protokolu výrobcu. Analýza bunkového cyklu
žalúdočné rakovinových buniek boli zbierané s použitím trypsínu , Bunky sa zhromaždí, premyje sa dvakrát ľadovo chladným PBS a fixované v ľadovo chladného 70% etanolu. Potom, čo bol dvakrát premyjú ľadovo chladným PBS, resuspendovaly sa v PBS obsahujúcom 100 U /ml RNase A a inkubujú sa pri teplote 37 ° C počas 30 minút, bunky boli farbené s PI (20 mg /ml) a analyzované pomocou FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), ako bolo opísané skôr [25].
in vitro kinázovej testami
aktivity CDK2, CDK4 a GSK-3p bola meraná, ako bolo predtým popísané [26, 27]. Stručne povedané, CDK2, CDK4 alebo GSK-3β bola imunoprecipitována z cytosolické (100 mg proteínu) alebo nukleárnu (25 mg proteínu) extraktov. Kinázy bola meraná inkubáciou imunoprecipitovány CDK2, CDK4 alebo GSK-3β v 40 ml kinázového pufra s 4 mg rekombinantného Slimák proteínu (pre meranie GSK-3β asociované kinázy), 5 mg Histon H1 (pre meranie CDK2 asociované kinázy aktivita) alebo proteín retinoblastomem (pre meranie CDK4 asociované kinázy) pri teplote 30 ° C počas 30 minút. Vzorky boli spracované, ako je popísané v predchádzajúcich správach [28]. Výsledky
Inhibícia GSK-3p zmierňuje HMBA-indukovanej zastavenie bunkového cyklu a diferenciácie buniek SGC7901
SGC7901 buniek nahromadené v G0 /G1 kontrolného bodu bunkového cyklu a diferencované do enterocytov podobný fenotypu po liečbe HMBA [29]. GSK-3β prispieva k inhibícii progresie bunkového cyklu pre odlíšenie buniek [20, 30]. Preto, či GSK-3β hrá úlohu v inhibíciu bunkového cyklu SGC7901 HMBA vyvolané bola skúmaná. Ako je ukázané na obrázku 1a, liečba s bunkami indukovanej HMBA sa hromadiť v G0 /G1 kontrolného bodu bunkového cyklu. Reakciou s lítium-chloridu (LiCl), ktorý inhibuje GSK-3p v Mg 2+ konkurenčným spôsobom [31], zvýšil sa podiel buniek v S fáze. Liečba kombináciou LiCl a HMBA reverznej HMBA-sprostredkovanú bunkovú G1 zastaviť. Podobné výsledky boli získané po liečbe s SB-415286, silný inhibítor GSK-3p [32] (ďalší súbor 1). Tieto výsledky naznačujú, že GSK-3β by mohol hrať úlohu v HMBA vyvolané G1 zástave. Na určenie, či HMBA za následok bunkovú smrť počas liečebného obdobia 24 h, proteín bol extrahovaný posúdiť, či došlo k zvýšeniu štiepenie PARP a /alebo aktívny kaspázy-3. Ako je ukázané na obrázku 1b, nebolo na štiepenie PARP a aktívne kaspázy-3 až 48 hodín bez zvýšenia po ošetrení HMBA. Dôležitou čoskoro udalosť v terminálny diferenciácie buniek je ich stiahnutie z bunkového cyklu [6]. Vzhľadom k tomu, GSK-3β dokumentuje, že hrá úlohu pri zástave bunkového cyklu [33], bolo nastolila, že inhibícia GSK-3p môže inhibovať diferenciáciu. Z tohto dôvodu, markeru diferenciácie žalúdka, boli skúmané účinky inhibítorov GSK-3p na indukciu HMBA sprostredkovanej expresie žalúdočnej protónovej pumpy. SGC7901 bunky boli vopred ošetrené s LiCl (Obrázok 1C a 1D) alebo SB-415286 (obrázok 1E a 1F) v rôznych koncentráciách po dobu jednej hodiny a potom sa spracuje s HMBA po dobu 24 hodín. LiCl inhibuje HMBA-indukovanú expresiu žalúdočnej protónovej pumpy v spôsobom závislým od dávky. V súlade s týmito výsledkami, SB-415286 blokovaný žalúdočné protónovej pumpy proteín a mRNA expresie, ktoré bolo vyvolané HMBA. Dohromady tieto výsledky naznačujú, že GSK-3β hrá dôležitú úlohu v HMBA-sprostredkovanú diferenciáciu žalúdočné buniek. Obrázok 1 Inhibícia GSK-3p zmierňuje HMBA-indukovanej zastavenie bunkového cyklu a diferenciácie SGC7901 buniek. A, SGC7901 bunky boli vopred ošetrené s alebo bez 10 mM LiCl po dobu 30 minút s následným kombinovanej liečbe s 10 mM HMBA po dobu 24 hodín, načo sa kvantifikáciou obsahu DNA pomocou prietokovej cytometrie. B, SGC7901 boli bunky ošetrené HMBA (10 mM) po dobu 24 hodín alebo 48 hodín a boli pripravené pre Western blot analýzu. C a E, SGC7901 boli bunky vopred ošetrené s alebo bez 10 mM LiCl alebo 10 μMSB-415286 po dobu jednej hodiny a následne kombinovanej liečbe s 10 mMHMBA po dobu 24 hodín. protónovej pumpy výraz status bol stanovený pomocou Western blot analýzy. D a F, celková RNA bola extrahovaná z buniek a bola vykonaná Q-RT-PCR analýza expresie mRNA protónovej pumpy. (Data predstavujú priemer ± SD; * = p menšie ako 0,05 verzus kontrola; * = p menšie ako 0,05 vs. HMBA sám.)
Akt upravuje žalúdočnú diferenciáciu vyvolanú HMBA
GSK-3p sa deaktivuje, keď ho. je fosforylovaný smeru Akt [34]. Z tohto dôvodu by sa predpokladá, že aktivácia Akt podľa PI3-kinázy by byť spojená s inhibíciu GSK-3p, a následne, inhibíciu diferenciácie buniek žalúdka. Pre testovanie tejto hypotézy, SGC7901 bunky boli infikované Ad-Akt, alebo kontrolným vektorom. Infekcia Ad-Akt zvýšenou expresiou fosforylovaného Akt, Akt a fosforylovanej GSK-3p proteínu (obrázok 2a), je v súlade s predchádzajúcimi výsledkami, ktoré dokazujú, že GSK-3 P pôsobí ako substrát Akt. Ako je ukázané na obrázku 2b, infekcie SGC7901 buniek s adenovirového vektora Ad-Akt samotný nemá žiadny účinok na žalúdočné protónovej pumpy a mRNA expresie. Avšak, infekcie s Ad-Akt vektora malo za následok inhibíciu žalúdočnej protónovej pumpy mRNA expresie indukované HMBA v porovnaní s HMBA a infekciou ovládacieho prvku (β-gal) adenovírusu, čo naznačuje, že signalizácia prostredníctvom PI3-kinázy /Akt dráhy reguluje žalúdočné bunky diferenciácia vyvolaná pôsobením HMBA. Obrázok 2 Akt upravuje žalúdočnú diferenciáciu indukovanú HMBA. A, cytosolu a jadrové proteíny boli extrahované z buniek ošetrených ako je uvedené a rozdelené na SDS-PAGE a blotovány s anti-fosfo-Akt, fosfo - Akt, GSK-3p, a GSK-3p, s použitím anti-a-tubulín a Topo IIβ ako kontrola na cytosolické a jadrových frakcie resp. B, výrazom protónovej pumpy bola meraná pomocou Western blotting a následne sa hojnosti kvantifikácie. (Data predstavujú priemer ± SD; * = p menšie ako 0,05 vs. kontrolnej správy; † = p menšie ako 0,05 vs. samotného HMBA.). C, Celková RNA (40 ug) bol frakcionovaný, prenesené na nitrocelulózové membrány a skúmal sa značenú cDNA protónovej pumpy; Bloty boli odstránené a znovu skúšaný s GAPDH.
Liečba HMBA zvýšila expresiu a aktivitu GSK-3p v jadre
Pre testovanie, či GSK-3β bol ovplyvnený pôsobením HMBA, GSK-3β aktivita bola stanovená meraním fosforylácie rekombinantný slimák, dobre charakterizované substrátom GSK-3p [35, 36]. GSK-3β sa nachádza v cytosolu a nukleárnych kompartmentoch buniek, ale prevažne v cytoplazme v priebehu fázy G1. Z tohto dôvodu, jadrové a cytoplazmatické proteíny boli frakčnom z kontroly a HMBA buniek ošetrených a vyšetrená na GSK-3p činnosti. Liečba HMBA viedlo k zvýšeniu aktivity jadrového GSK-3p (obrázok 3a), a inhibícia GSK-3β atenuovaný HMBA sprostredkované fáze G1, čo ukazuje na úlohu GSK-3p v HMBA-indukovanej zastavenie bunkového cyklu. Ser9 fosforylácie GSK-3p znižuje GSK-3p aktivitu, vzhľadom k tomu, Tyr216 fosforylácie zvyšuje GSK-3p aktivitu [37]. Analyzovať základné mechanizmy zvýšenej GSK-3p aktivity spôsobené pôsobením HMBA, Ser9-fosforylovaný a Tyr216-fosforylovaný GSK-3p expresia proteínu bola stanovená pomocou Western blotting. Liečba HMBA zvýšenej jadrovej expresných hladín celkového GSK-3p a Tyr216-fosforylovaný GSK-3p bez ovplyvnenia ich expresiu v cytosolu (obrázok 3b). Je zaujímavé, že liečba HMBA zvýšená GSK-3p expresiu Ser9-fosforylovaného proteínu ako v cytosolické a jadrových frakcií. Podobné výsledky boli získané po liečbe s inými HPC, SAHA a EMBA (ďalší súbor 2). Okrem toho HPC zvýšil aktivitu GSK-3p v jadre ako bolo stanovené in vitro
kinázy testoch (ďalší súbor 3). Tieto výsledky naznačujú, že HPC zvyšuje nukleárnej GSK-3p aktivitu bez ohľadu na to fosforylácie na Ser9. Obrázok 3 Ošetrenie HMBA zvýšila expresiu a aktivitu GSK-3p v jadre. A, SGC7901 bunky boli ošetrené (+) alebo bez (-) 10 mMHMBA po dobu 24 hodín, a zberá sa na konci liečby. Cytosol a nukleárnej frakcie boli pripravené a GSK-3β aktivita bola testovaná in vitro kinázového testu s použitím šnek proteínu ako substrátu. Fosforylovaný Slimák proteínové signály boli denzitometrické kvantifikované a vyjadrené ako násobok-zmenu vzhľadom k neošetreným kontrolným skupinám. B, SGC7901 bunky boli ošetrené s 10 mM HMBA pre rôzne časy. Cytozolové a jadrové proteínové frakcie boli extrahované a western blotting bol vykonaný s použitím protilátok proti GSK-3p, fosfo-GSK-3P (Ser9), fosfo-GSK-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-tubulínu alebo Topo IIβ.
inhibícia GSK-3p prepíše HMBA-indukovanej inhibícia CDK2 progresiu
cez G1 je závislé na CDK2 a CDK4 [38, 39]. Na určenie, či regulácia GSK-3β HMBA-sprostredkované zastavenie bunkového cyklu G1 prebieha cez inhibíciu CDK2 alebo CDK4, SGC7901 bunky boli vopred ošetrené s LiCl (obrázok 4a), alebo SB-415286 (obrázok 4b), a potom sa podrobí kombinovanej liečbe s HMBA po dobu 24 h pred imunoprecipitační testy boli vykonávané na bunkových lyzátov s použitím anti-CDK2 alebo anti-CDK4 protilátky, v danom poradí. Okrem toho, CDK2 alebo CDK4 aktivita bola stanovená za použitia in vitro testu kinázy
v. Liečba HMBA sám inhibuje CDK2 aktivita (hore, ľavý panel), ale zvýšená aktivita CDK4 (hore, pravý panel); Inhibícia GSK-3p pomocou LiCl alebo SB-415286 významne zoslabený HMBA inhibíciu CDK2 aktivity (dole). Liečba HMBA zvýšila expresiu a aktivitu GSK-3p v jadre. Dohromady tieto výsledky naznačujú, že GSK-3β prispieva k HMBA sprostredkovanú zástavu G1 bunkového cyklu prostredníctvom inhibície CDK2. Obrázok 4 Inhibícia GSK-3p prepíše HMBA indukovanú inhibíciu CDK2. SGC7901 bunky boli vopred ošetrené (+) alebo bez (-), 10 mM LiCl (A) alebo 10 uM SB-415286 (B) po dobu 30 minút s následným kombinovanej liečbe s 10 mM HMBA po dobu 24 hodín. Proteínové extrakty boli imunoprecipitovány s anti-CDK2 alebo anti-CDK4 protilátok. Výsledné imunokomplexami boli analyzované na aktivitu za použitia CDK2 Histon H1 ako substrátu (horný panel), alebo pre CDK4 aktivitu za použitia Rb ako substrátu (dolný panel). Fosforylovaný Histon H1 alebo Rb proteín signály boli vyčíslené denzitometrické a vyjadrí sa ako rozkladací zmeny vzhľadom na neošetrených kontrolných skupín.
GSK-3p reguluje jadrový p27Kip1protein výraz
pri skúmaní mechanizmov základnej HMBA sprostredkované G1 zatknutie a inhibíciu CDK2 ďalej, bunková expresia mRNA cyklu regulácia bola analyzovaná pomocou RPA testov. Liečba HMBA zvýšenej P27 Kip1 mRNA expresie, ale znížila p53, P57, P15 (Obrázok 5A vpravo), cyklin A a cyklin D1 mRNA expresie (Obrázok 5A vľavo). Avšak liečba s LiCl zvýšenej expresie p21 Waf1 mRNA, ale nemalo vplyv na hladinu expresie iných génov. Podobné výsledky boli získané, keď boli bunky ošetrené SB-415286 (ďalší súbor 4). Tieto výsledky naznačujú, že regulácia GSK-3β HMBA-sprostredkované zastavenie bunkového cyklu nezahŕňa transkripčný reguláciu génov bunkového cyklu účely. Obrázok 5 mRNA expresie génov s ohľadom na bunkový cyklus. A, testy ochrany RNázy boli vykonané za použitia RNA z SGC7901 buniek ošetrených buď 10 mM HMBA, 20 mM LiCl, alebo kombinácia HMBA a LiCl po dobu 24 hodín, hybridizuje s multi-sondami pre inhibítory bunkového cyklu závislej kinázy (A; hCC- 2) alebo cyklin (B; hCYC-1). B, SGC7901 bunky boli vopred ošetrené (+) alebo bez (-) 10 mM LiCl (vpravo) alebo 10 uM SB-415286 (vľavo) počas 30 minút s následným kombinovanej liečbe s 10 mM HMBA po dobu 24 hodín. Celé bunkové proteínové extrakty boli rozdelené na SDS-PAGE, prenesené na PVDF membrány a imunoblotovány s protilátkami proti p27Kip1, p21Waf1, CDK2, alebo p-aktínu.
Analyzovať základné mechanizmy GSK-3β-spojený bunkového cyklu ďalej, expresia p21 Waf1 a p27 Kip1 proteínov v bunkách ošetrených SGC7901 HMBA v prítomnosti alebo neprítomnosti LiCl alebo SB-415286 bola skúmaná. Prídavok LiCl (obrázok 5B vpravo) alebo SB-415286 (obrázok 5B vľavo) oslabený indukcii p27 Kip1 ale nie p21 expresie proteínov Waf1, čo naznačuje, že P27 Kip1 podieľa na prechodoch bunkového cyklu regulované GSK-3p. Pri p27 Kip1 akumuluje v jadre sa viaže na CDK2, inhibuje jej aktivitu, a nakoniec sa indukuje zástavu bunkového cyklu. Okrem toho, HMBA (10 mM) sa zvýšila p27 expresiu Kip1 proteínu cytosolické a jadra od 0 do 24 hodín po ukončení liečby (pozri obrázok 6a). HMBA (0-5 mM) sa zvýšil p27 Kip1 výraz po 24 hodinách v cytozolové frakcie a po 48 hodinách HMBA (5-10 mM) vzrástol p27 Kip1 expresie v jadrových frakcií (obrázok 6b). Prídavok LiCl (obrázok 6c) alebo SB-415286 (obrázok 6d) blokované HMBA-zvýšenou p27 Kip1 jadrový výraz bez toho aby to ovplyvnilo p27 Kip1 výraz cytosolické, čo naznačuje špecifickú reguláciu jadrovej p27 Kip1 výrazu GSK-3β. Demonštrovať úlohu GSK-3p v regulácii jadrového p27 Kip1 výraz ďalšie, bunky boli transfekovány siRNA namierenou proti GSK-3P (obrázok 6E). RNAi sprostredkovanú potlačenie GSK-3p bola potvrdená imuno-blottingom a oslabený jadrového p27 Kip1 indukcie HMBA bez toho aby to ovplyvnilo cytozolové p27 Kip1 indukcie. Pre potvrdenie úlohy GSK-3p v regulácii jadrového p27 Kip1 výraz, SGC7901 bunky boli transfekovány vektorom kódujúcim aktivovanú formu GSK-3p (GSK-3β-CA) alebo prázdnym kontrolným vektorom. Cytosol a jadrové proteíny boli extrahované a western blotting sa vykonáva na stanovenie p27 Kip1 výraz. Transfekcia SGC7901 buniek s GSK-3βCA plazmidu za následok zvýšenie p27 Kip1 v nukleárnej frakcii (obr 6F) bez ovplyvnenia p27 úrovňou Kip1 cytosolické. Zvýšená expresia aktívnej formy GSK-3p sa potvrdí pomocou Western blotting a in vitro
kinázovej testy pri používaní šnek proteín ako substrátu (obr 6G). Dohromady tieto výsledky naznačujú, že GSK-3β sa podieľa na regulácii bunkového cyklu prostredníctvom špeciálneho regulácie jadrového p27 Kip1 expresie proteínov. Obrázok 6 Nuclear p27 Kip1 expresie modulovaný GSK-3p. A & B, SGC7901 boli bunky ošetrené HMBA (10 mM) v časovom priebehu (A), alebo s rôznymi koncentráciami po dobu 24 hodín. Cytozolové a jadrové proteínové frakcie boli extrahované a western blotting bol uskutočnený s protilátkami proti p27Kip1, a-tubulínu alebo Topo IIβ. C & D, SGC7901 bunky boli vopred ošetrené (+) alebo bez (-), 20 mM LiCl (C), alebo 10 uM SB-415286 (D) po dobu 30 minút s následným kombinovanej liečbe s 10 mM HMBA po dobu 24 hodín. Cytosol a jadrové proteíny boli extrahované pre analýzu expresie proteínu p27Kip1. E, SGC7901 bunky boli transfekovány siRNA namierené na GSK-3p alebo ovládať siRNA. Dvadsaťštyri hodín po transfekciu boli bunky ošetrené HMBA po dobu ďalších 24 hodín. Cytosol a jadrové proteíny boli extrahované pre analýzu expresie proteínu p27Kip1. Vyradenie GSK-3p expresie bola potvrdená metódou Western blot s použitím anti-GSK-3p protilátky. F, SGC7901 bunky boli infikované Ad-HA-GSK-3βS9A alebo Ad-beta-gal pri MOI 10 PFU /bunka. Po 48 hodinách inkubácie cytosol a jadrový proteín sa vyťažilo a western blotting vykonáva pomocou anti-p27Kip1, anti-HA a anti-GSK-3 protilátok, respektíve za použitia anti-alfa-tubulínu alebo Topo IIβ ako kontrola nanášania. GSK-3p aktivity boli testované in vitro s použitím testu kinázy šnek proteínu ako substrátu (spodný panel). p27Kip1 signály boli vyčíslené denzitometrické a vyjadrí sa ako rozkladací zmeny vzhľadom na alfa-tubulínu alebo TopIIβ.
GSK-3p reguluje p27Kip1binding na CDK2
HMBA zvýšil p27 expresie proteínov Kip1, potlačený CDK2 aktivita a zvýšená aktivita CDK4 (Obrázok 4). Extrakty z kontroly alebo HMBA ošetrených buniek boli imunoprecipitovány vyšetrovať p27 Kip1 väzby na CDK2 a CDK4. Ako je ukázané na obrázku 7a, liečba HMBA zvýšila úroveň P27 Kip1 v komplexoch imunoprecipitovány anti-CDK2, ale nie v komplexoch imunoprecipitovány anti-CDK4. Re-sondovania filtre s anti-CDK2 a CDK4 anti-protilátkami potvrdili, že imunoprecipitáty z kontroly a HMBA ošetrených buniek obsahovali rovnaké úrovne CDK2 a CDK4. Z tohto dôvodu sa zdá HMBA spôsobiť selektívne zvýšenie p27 Kip1 väzby na CDK2. Analyzovať, či inhibícia GSK-3p ovplyvňuje asociáciu p27 Kip1 s CDK2, SGC7901 bunky boli vopred ošetrené s LiCl alebo SB-415286 a podrobené kombinovanej liečbe s HMBA po dobu 24 hodín; Celý-bunkové extrakty boli imunoprecipitovány. Liečba GSK-3p inhibítory, LiCl (obrázok 7b) alebo SB-415286 (7c) blokované p27 Kip1 záväzný pre CDK2. Tieto výsledky naznačujú, že GSK-3β je nevyhnutné pre HMBA vyvolané zvýšenou p27 Kip1 väzby na CDK2. Pre potvrdenie úlohy GSK-3p v regulácii p27 Kip1 pridružení s CDK2, SGC7901 bunky boli transfekovány vektorom kódujúcim aktivovanú formu GSK-3p alebo Ad-p-gal. Celý-cell proteín bol extrahovaný a vykonaná Imunoprecipitácia. Ako je uvedené na obrázku 7d, transfekcia SGC7901 buniek s GSK-3β-CA vektora malo za následok zvýšené hladiny p27 Kip1 v komplexoch imunoprecipitovány anti-CDK2 v porovnaní s transfekciu kontrolným plazmidom. To naznačuje, že GSK-3β nie je potrebná iba na HMBA sprostredkované p27 Kip1 väzby na CDK2, ale aj dostatočné pre zvýšenie asociáciu p27 Kip1 s CDK2 v SGC7901 bunkách. Obrázok 7 Regulácia GSK-3β of p27 Kip 1 asociáciu s CDK2. A, SGC7901 boli bunky ošetrené (+) alebo bez (-), 10 mM HMBA po dobu 24 hodín. Proteínové extrakty boli imunoprecipitovány s anti-CDK2 alebo anti-CDK4 protilátok. Normálne králičie IgG bol použitý ako kontrola. CDK2, CDK4 alebo asociované p27Kip1 vo výsledných imunitných komplexov bol analyzovaný westernovým prenosom za použitia anti-p27Kip1 protilátky s anti-CDK2 alebo -CDK4 protilátky ako nakladacia kontroly. B a C, SGC7901 bunky boli vopred ošetrené (+) alebo bez (-), 10 mM LiCl (B) alebo 10 uM SB-415286 (C) počas 30 minút s následným kombinovanej liečbe s 10 mM HMBA po dobu 24 hodín. Proteínové extrakty boli imunoprecipitovány s anti-CDK2 protilátky. CDK2 spojený p27Kip1 vo výsledných imunitných komplexov bola analyzovaná podobná A. D, SGC7901 bunky boli infikované Ad-HA-GSK-3βCA alebo kontrolné vektor (Ad-β-gal) pri MOI 10 PFU /bunka. Po 48 hodinách inkubácie, celá bunka proteín bol extrahovaný a imunoprecipitovány s anti-CDK2 protilátky (horný panel). p27Kip1 bola analyzovaná pomocou western blotting podobná A. nadmernou expresiou HA-označili GSK-3CA bola potvrdená metódou Western blot s použitím anti-GSK-3p protilátky (dolný panel). GSK-3β aktivita bola testovaná in vitro
teste kinázy za použitia šnek proteín ako substrátu (spodný panel).
Diskusia
PI3-kinázy /Akt /GSK-3β signálne dráhy je zapojený do regulácie bunkového rastu, apoptózy a diferenciáciu rôznych typov buniek [46]. V tejto štúdii, že inhibícia GSK-3p pomocou doplňujúce prístupy (tj chemické inhibícia a konštitutívne aktívny Akt nadmernej expresie) oslabený protónovej expresie čerpadla, ktorým sa meria žalúdočné ako je diferenciácia, v žalúdočnej nádorové odvodenej SGC7901 bunkové línie.
proliferácie a diferenciácie buniek sú tradične považované za vzájomných procesov, s vysadením bunkového cyklu bolo vyžadované pre terminálny diferenciácie [40], a P27 Kip1 hrá dôležitú úlohu [41, 42]. Genetická delécie p27, ale nie p21 bolo preukázané, že vplyv na diferenciáciu žalúdočné buniek, zatiaľ čo nútenej p27 Kip1 expresie vedie k diferenciácii, čo naznačuje, že P27 Kip1 je oveľa dôležitejšie ako p21 Waf1 v regulácii žalúdočné bunky diferenciácie. V súlade s týmito zisteniami, že inhibícia GSK-3P oslabenej HMBA sprostredkované žalúdočné bunkovej diferenciácie a inhibícia GSK-3p zablokované HMBA sprostredkované nukleárna p27 Kip1 výraz, zatiaľ čo zvýšená expresia aktívnej formy GSK-3p zvýšila nukleárnej p27 Kip1 expresie, čo naznačuje významnú úlohu v regulácii diferenciácie buniek žalúdočnej vďaka regulácii jadrovej p27 Kip1 výrazu.
  • žalúdok článok
    •   
  • žalúdočné štruktúra
    •   
  • Starostlivosť o žalúdka
    •   
  • výskumy

    • výskumy

    výskumy

    Other Languages

    žalúdok zdravie © https://www.stomachillness.com/sk