| Stomach Health > želudac Zdravlje >  > Stomach Knowledges > Istraživanja

P27Kip1, regulirani glikogen sintetaze kinaze-3β, rezultira HMBA-inducirana diferencijacije humanog želučanog raka cells

p27 Kip1, regulirani glikogen sintetaze kinaze-3β, rezultira HMBA-inducirana diferencijacijom stanica raka želuca
Sažetak pregled Pozadina pregled, raka želuca je drugi najčešći uzrok globalne smrtnosti od raka povezanih. Iako dediferencijacija predviđa lošu prognozu karcinoma želuca, molekularni mehanizam temeljni dediferencijacija, koji bi mogao pružiti temeljne uvide u razvoj tumora i napredovanje, još treba razjasniti. Nadalje, molekularni mehanizam u podlozi učinke heksametilen bisacetamid (HMBA), nedavno otkrivene diferencijacije induktora, zahtijeva istraživanje i nema prijavljenih studije o učinku HMBA na rak želuca.
Metode
Na temelju rezultata FACS analiza, razina proteina uključenih u staničnog ciklusa ili apoptozu određene su pomoću western blotting-a, nakon jednog tretmana i uzastopnih kombinacijama HMBA i LiCl. GSK-3β i protonske pumpe ispitano je Western blot pokusa nakon regulaciju Akt ekspresija Ad-Akt infekcije. Da bi istražili učinke HMBA na protein lokalizaciju i aktivnosti GSK-3β, CDK2 i CDK4, kinaze testovima, imuno i zapadnoj upijajući su izvedene. Osim toga, Sjeverna upijajući i testovi za zaštitu RNaza se provode kako bi se utvrdilo funkcionalnu koncentraciju HMBA. Pregled Rezultati
HMBA povećana ekspresija p27Kip1 i potaknulo staničnog ciklusa povezan s želučanim diferencijaciju epitelnih stanica. Osim toga, liječenje stanica želučane izveden sa HMBA inducirane G0 /G1 zastoja i doreguliranje protonske pumpe, markera diferencijacije želučane raka. Osim toga, liječenje HMBA povećao ekspresiju i aktivnost GSK-3β u jezgri, ali ne citosolu. HMBA smanjena aktivnosti cdk2 i potaknulo p27Kip1 izraz, koji bi mogao biti spas inhibicijom GSK-3β. Nadalje, HMBA povećane p27Kip1 vezivanja na CDK2, a to je ukinuto inhibicijom GSK-3β. Pregled Zaključci
rezultata predstavljenih ovdje ukazuju da GSK-3β funkcije reguliranjem p27Kip1 sklop s CDK2 pri čemu igra ključnu ulogu u G0 /G1 uhićenje povezano s želučanom diferencijaciju epitelnih stanica HMBA-inducirana. pregled Ključne riječi pregled HMBA rak želuca GSK-3β Pozadina pregled, rak želuca je jedan od najčešćih oblika raka u svijetu, a često razvija otpornost na kemoterapiju i zračenje tretmani. Stoga kombinirana terapija je predloženo da se bolje rješavanje bolesti i smanjiti vjerojatnost razvoja otpornosti [1]. Heksametilen bisacetamid (HMBA), hibridni polarni spoj (HPC) izvorno razvijen kao sredstvo diferencijacije inducira [2-6], uzrokuje želučane stanica ponovno diferencijaciju [7-9].
U želucu matičnih stanica u proliferativna stanična zona prevlaci predjelu želučanim žlijezdama diferenciraju i dovode do različitih staničnih tipova [10, 11]. Kad je prvi tumorogene događaj odvija dalje napredovanje tumora ovisi o prirodi događaja iniciranje i razvojnog stadija stanice koja je kontinuirana i dodatne mutacije koje mogu nastati. Stalno proliferacija je vitalni značajka matičnih stanica, te u gastrointestinalnim tkivima mutacije su vjerojatno da će dovesti do širenja promijenjenim matičnih stanica, čime se povećava vjerojatnost daljnjih mutacija i progresiju tumora [12]. Stoga, ciljanje želučanog karcinoma matičnih stanica je vjerojatno da će biti najučinkovitiji način liječenja raka želuca. Oko 50% zapadne populacije razvija metaplazije, ključni korak u razvoju raka [13], crtanje pozornost na puteve koji kontroliraju proliferaciju a time i diferencijaciju stanica. Među tim, TGF-b, MYB, Wnt i Jež putevi su od posebnog značaja, s vidljivo u stanične sudbina specifikacije i formiranje uzoraka tijekom embriogeneze i odraslih obnovu tkiva. Rasvjetljavanje kompleksa tumor supresor i akcelerator signalizaciju putova, što je učinak diferencijacije modulaciju Prijelazni /ishodišnih stanica, biti ključan za optimizaciju lijekova za liječenje karcinoma želuca,
Da bi nezrelih stanica želuca diferenciranja, zahtijevaju da ostanu u G1 fazi staničnog ciklusa u određenom vremenskom razdoblju. Stanični ciklus sisavca reguliran sekvencijalnom aktivacija i inaktivacija visoko očuvanih obitelji kinaza ovisnih ciklinu (CDK-e); napredovanje kroz rano do sredine G1 ovisi o cdk4 i eventualno CDK6, dok je napredovanje kroz kasne G1 i S fazi zahtijeva aktivaciju CDK2. Aktivnosti CDK mogu inhibirati vezanje inhibitornih proteina CDK uključujući obitelj Cip /Kip (p21 WAF1, p27 Kip1 i p57 Kip2) i obitelji INK 4 (p15Ink4b, p16INK4a, p18Ink4c i p19Ink4d ). P27 Kip1 regulirano post-transkripcijski od proteolitičke razgradnje. CDK2 veže na p27 Kip1 i fosforilira ga na treonin 187 [14], a HMBA-inducirana diferencijacija želuca stanica je povezana s up-regulaciji p27 Kip1 [15, 16] i G0 /G1 uhićenje. Međutim, postoji nekoliko detaljne studije koje se odnose na molekularni mehanizam HMBA i nije bilo prijavljene studije koje su ispitivale učinak HMBA na rak želuca.
Kao nizvodno meti fosfatidilinozitol-3 kinaze /Akt (PI3-kinaze /Akt ) put, GSK-3β regulira stanične proliferacije i diferencijacije [17-20]. Prikupljeni dokazi ukazuju da poremećaj smanjene GSK3β signalizacija, koji djeluje u G1 za primanje ulaza od nekoliko signalizacije i razvojnih putova, pojavljuje u suradnji s različitim ljudskim raka [21, 22]. GSK-3β je uključen u više bioloških procesa jer fosforilira široki spektar supstrata uključujući nekoliko diferencijaciju punktova, uključujući c-myc, puževa i PI3K [23]. Prije toga, inhibicija puta PI3-kinaze pokazalo se kako bi se poboljšala HMBA-posredovane diferencijacije stanica želučane [8]. U ovom istraživanju, uloga GSK-3β u diferencijacije želuca stanica ispitana je pomoću humanog želučanog raka stanične linije SGC7901, koji prikazuje multipotentnim fenotip i predstavlja dobro opisanih modela želučane diferencijacije. Rezultati ukazuju doprinose razvoju za GSK-3β u p27 Kip1 put tijekom diferencijacije želučane stanica inducirano HMBA.
Methods pregled Stanična kultura
želučanu stanična linija karcinoma SGC7901 se dobiva iz stanične banke u kineske akademije znanosti i kultivirani kao što je prethodno opisano [24]. SGC7901 stanice su zaražene s adenovirus kodira aktiviranog oblika Akt (Ad-Akt) ili adenovirusni vektor kontrole kodiraju P-galaktozidaze (β-gal) pri multiplicitetu infekcije (MOI) od 10 pfu /stanica. Nakon infekcije vektora tijekom jednog sata, nakon čega slijedi zamjena medija i inkubaciju se daljnjih 24 sata, stanice su tretirane u prisutnosti ili odsutnosti HMBA i proteina i RNA se ekstrahira za Northern blot 'zapadnog i, respektivno.
Materijali pregled HMBA, TSA, SB-415286 i Lici su kupljeni od Sigma Chemical Company, SAD. Adenovirus vektori P-gal i myristoylated aktivnog oblika Akt (Ad-Akt) kupljeni su od Cell Biolabs, USA. Vektor koji kodira katalitičku aktivni mutant GSK3β (HA-GSK-3βCA) se nabavlja od Addgene. Non-ciljanje kontrole siRNA i SMARTpool za ciljanje GSK-3β su kupljena od Dharmacon, SAD. Sve probe su označene s Biotin Random Prime DNA Labeling Kit (Pierce).
Antitijela
zec anti-Akt, anti-fosfo-Akt (Ser473) i antifosfo-GSK-3β (Ser9) nabavljeni su od tvrtke Cell Signaling , USA. Miš protiv GSK-3β, miš anti-p27 Kip1, miš anti-Top IIb i miš anti-p21 WAF1 kupljeni su iz BD Biosciences, SAD. Mišji anti-fosfo-GSK-3 (Tyr278 /Tyr216) se dobiti iz Upstate, SAD. Kunić protiv cijepanja PARP antitijelo je kupljen od Abcam, SAD. Anti-protonske pumpe je kupio od MBL International (USA). Poliklonski anti-CDK2, CDK4 anti-anti-α-tubulin i anti-kaspaze-3 su dobiveni od Santa Cruz Biotechnology (SAD). Pregled substanične ekstrakcija proteina i western bloting pregled nuklearnih i citosolne frakcije su ekstrahirane pomoću NE-pO jezgri i u citoplazmi Ekstrakcija Reagensi kit (Pierce, USA). Citosolni protein (80 mg) ili nuklearnih proteina (20 mg) je otopljen u 10% -tnom poliakrilamidnom gelu i prenese PVDF membrane kao što je opisano [25]. Filteri su inkubirane tijekom jednog sata pri sobnoj temperaturi u upijajući rješenje. Membrane su inkubirane preko noći na 4 ° C s primarnim antitijelima i zatim upijanjem sa peroksidaza-konjugiranog sekundarnog antitijela za jedan sat, i promatrana pomoću sustava za detekciju ECL.
Northen bloting i testova zaštite RNase (RPA)
Ukupno RNA je pripravljen pomoću Trizol reagensa (Invitrogen). Uzorci su provedeni kroz 1,2% agarozni /formaldehid gelu i prenese u podržani nitrocelulozu. Membrane su hibridizirani sa obilježen biotinom želučana protonske pumpe cDNA sondom. Nakon hibridizacije s GAPDH sonde, kontrola doziranja, membrane su isprane i signali su detektirani pomoću sustava za detekciju ECL. Eksperimenti zaštite RNaza-a korištenjem RPA-III kita od Ambion i Assay System RiboQuant MultiProbe RNaza zaštite, čime je otkriti više specifičnih mRNA. 32P-obilježeni antisense RNA sonde su pripravljeni korištenjem Human apoptozu HCC-2 i hCYC-1 Podešavanje predložak i provedeno Hibridizacija prema protokolu proizvođača. Analiza staničnog ciklusa pregled pregled želučanom kancerozne stanice su prikupljene koristeći tripsin , Stanice su sakupljene, isprane dva puta s ledeno hladnim PBS-om i učvršćene u ledeno-hladnim 70% etanolom. Nakon ispiranja dva puta s ledeno hladnim PBS-om, ponovno suspendirane u PBS koji sadrži 100 U /mL RNAze A i inkubira na 37 ° C tijekom 30 min, stanice su obojene s PI (20 mg /mL) i analizirana pomoću FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, SAD), kao što je prethodno opisano [25]. pregled In vitro
kinaze testovi
aktivnosti CDK2, CDK4 i GSK-3β su mjerene kao što je prethodno opisano [26, 27]. Ukratko, CDK2, CDK4 ili GSK-3β imunoprecipitiran s citosolnim (100 mg proteina) ili nuklearni (25 mg proteina) ekstrakata. Kinaze je mjereno sa inkubacijom imunoprecipitiran CDK2, CDK4 ili GSK-3β u 40 ml pufera kinaze sa 4 mg rekombinantnog puž proteina (za mjerenje GSK-3β-povezana aktivnost kinaze), 5 mg histon H1 (za mjerenje CDK2 povezana kinaze aktivnost) ili retinoblastom protein (za mjerenje aktivnosti CDK4 povezana kinaze) na 30 ° C tijekom 30 minuta. Uzorci su obrađeni kao što je opisano u prethodnim izvješćima [28]. | Rezultati
inhibicija GSK-3β prigušuje HMBA-inducirana staničnog ciklusa i diferencijaciju stanica SGC7901
SGC7901 nakupljene stanice u točke staničnog ciklusa G0 /G1 i diferencira u enterocita nalik fenotipa nakon tretmana sa HMBA [29]. GSK-3β doprinosi inhibiciju napredovanja staničnog ciklusa i na diferenciranih stanica [20, 30]. Stoga, bilo GSK-3β igra ulogu u inhibiciji SGC7901 staničnog ciklusa HMBA-inducirana je istraživan. Kao što je prikazano na slici 1a, liječenje HMBA inducirane stanice nakupljaju na točke staničnog ciklusa G0 /G1. Tretman s litij-kloridom (LiCl), koji inhibira GSK-3β u Mg 2+ kompetiraju [31], povećao udio stanica u S fazi. Liječenje s kombinacijom LiCl i HMBA reverzne HMBA-posredovane G1 staničnog zastoj. Slični rezultati dobiveni su nakon tretmana s SB-415286, moćan inhibitor GSK-3β [32] (dodatni file 1). Ovi rezultati ukazuju da GSK-3β mogao igrati ulogu u HMBA-inducirana G1 uhićenja. Da bi se utvrdilo da li HMBA nastupila smrt stanica tijekom perioda liječenja od 24 h, protein je ekstrahiran procijeniti da li postoji povećan PARP dekolte i /ili aktivne kaspaze-3. Kao što je prikazano na slici 1b, nije bilo povećanja cijepanja PARP i aktivnom kaspazom-3 ​​do 48 h nakon tretmana HMBA. Važan rani događaj u terminalnoj diferencijaciji stanica njihovo povlačenje iz staničnog ciklusa [6]. Budući da GSK-3β dokumentirano da igraju ulogu u zaustavljaju staničnog ciklusa [33], je pretpostavio da inhibicija GSK-3β mogu inhibirati diferencijaciju. Stoga su učinci inhibitora GSK-3β na induciranje HMBA posredovanog ekspresijom želuca protonske pumpe, marker želučane diferencijacije, su ispitivani. SGC7901 Stanice su prethodno obrađene sa LiCl (Slika 1c i 1d) ili SB-415286 (slika 1E i 1F) pri različitim koncentracijama tijekom jednog sata, a zatim je obrađena sa HMBA 24 h. LiCl inhibirana HMBA-inducirana želučane ekspresiju protonske pumpe na način ovisan o dozi. U skladu s tim rezultatima, SB-415.286 blokira želučani proteina protonske crpke i mRNA, koja je inducirana HMBA. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da GSK-3β igra važnu ulogu u HMBA posredovane diferencijacije želuca stanica. Slika 1 Inhibicija GSK-3β slabi HMBA-inducirana staničnog ciklusa i diferencijaciju SGC7901 stanica. A, SGC7901 stanice prethodno su tretirani sa ili bez 10 mM LiCl, u trajanju od 30 min, nakon čega kombinirano liječenje s 10 mM HMBA 24 h, a zatim s kvantificiranja sadržaja DNA protočnom citometrijom. B, SGC7901 stanice su tretirane sa HMBA (10 mM) tijekom 24 h ili 48 h, a pripravljeni su iz zapadne blot analize. C &E, SGC7901 stanice su prethodno tretirani sa ili bez 10 mM LiCl ili 10 μMSB-415286 tijekom jednog sata, nakon čega slijedi kombinirano liječenje s 10 mMHMBA 24 sata. protonske status izraz pumpe određena je putem Western blot analize. D &F, ukupna RNA je ekstrahirana iz stanica i izvedena je Q-RT-PCR analize za protonske pumpe mRNA ekspresije. (Podaci predstavljaju srednja vrijednost ± SD, * = p < 0,05 prema kontroli; * = p < 0,05 prema HMBA sami.) Pregled Akt regulira želučanu diferencijaciju izazvanu HMBA pregled GSK-3β inaktivira kada je. fosforiliran nizvodno od Akt [34]. Dakle, predviđa se da aktivacija Akt po PI3-kinaze biti povezani s inhibicijom GSK-3β, a potom, inhibicija želučane diferencijacije stanica. Da bi testirali tu hipotezu, SGC7901 stanice su zaražene s Ad-Akt ili kontrolnim vektorom. Infekcija s Ad-Akt povećanom ekspresijom fosforiliranog Akt, Akt i fosforilirani GSK-3β proteina (slika 2a), u skladu s prethodnim rezultatima koji pokazuju da GSK-3β djeluje kao supstrat za Akt. Kao što je prikazano na slici 2b, infekcije SGC7901 stanica s Ad-Akt adenoviralnim vektorom koji sam nije imao učinka na želučane protonske pumpe i mRNA ekspresije. Međutim, infekcije s Ad-Akt vektor rezultiralo inhibicijom želučanog protonske pumpe mRNA ekspresije inducirane HMBA odnosu HMBA i infekcije od kontrole (β-gal) adenovirus, sugerirajući da signaliziranje putem PI3-kinaze /Akt put regulira želučane stanice diferencijacija izazvana HMBA liječenja. Slika 2 Akt regulira želučanu diferencijaciju izazvano HMBA. A, citosolu i nuklearnih proteina su iz stanica koje su tretirane kako je naznačeno i razdvojeni na SDS-PAGE i mrlja s anti-fosfo-Akt, -Akt, fosfo-GSK-3β i GSK-3β, koristeći anti-a-tubulin i topografske IIβ kao kontrolu citoplazmatske i nuklearne frakcija respektivno. B, izraz protonske pumpe mjerena je pomoću Western upijanja slijedi s obiljem kvantifikacije. (Podaci predstavljaju srednja vrijednost ± SD, * = p < 0,05 prema kontroli, † = p < 0,05 prema samim HMBA.). C Ukupna RNA (40 ug) je razdijeljen, prenesu na nitrocelulozne membrane i obilježeni oznakom cDNA protonske pumpe; blotovi su bili oguljeni i re-sondirani s GAPDH. pregled tretman sa HMBA povećava ekspresiju i aktivnost GSK-3β u jezgri
Za ispitivanje da li GSK-3β je utjecao HMBA tretman, GSK-3β aktivnost je određena mjerenjem fosforilacija rekombinantne puž, dobro karakterizira supstrat GSK-3β [35, 36]. GSK-3β nalazi se u citosolu i nuklearnih odjeljaka stanica, ali uglavnom u citoplazmi u fazi G1. Dakle, nuklearne i citoplazmatski Proteini su iz kontrole i tretiranih HMBA-stanicama i ispituje za GSK-3β aktivnosti. HMBA liječenje rezultirala je povećanjem aktivnosti nuklearne GSK-3β (slika 3a), a inhibicija GSK-3β prigušuje HMBA posredovanih G1 zastoj, što ukazuje na ulogu GSK-3β u HMBA-inducirana staničnog ciklusa. Ser9 fosforilacija GSK-3β smanjuje GSK-3β aktivnost, dok Tyr216 fosforilacija povećava GSK-3β aktivnost [37]. Za analizu mehanizma koji je fundamentalan povećanu aktivnost GSK-3β uzrokovane HMBA liječenje, Ser9-fosforilirani i Tyr216-fosforiliranog GSK-3β ekspresiju proteina je određena pomoću Western blot. HMBA tretman povećao nuklearne razine ekspresije ukupnog GSK-3β i Tyr216-fosforiliranog GSK-3β bez utjecaja na njihovu ekspresiju u citosolu (slika 3b). Zanimljivo je HMBA liječenje povećane Ser9-fosforilirani GSK-3β ekspresije proteina u oba citoplazmatske i nuklearne frakcije. Slični rezultati dobiveni su nakon tretiranja s drugim HPCs SAHA i EMBA (Dodatni file 2). Osim toga, HPC povećana aktivnost GSK-3β u jezgri kao što je pokazano in vitro testovima
kinaze (Dodatni datoteka 3). Ovi rezultati sugeriraju da HPC povećava nuklearno GSK-3β aktivnost bez obzira na fosforilaciju Ser9. Slika 3 Tretman sa HMBA povećao ekspresiju i aktivnost GSK-3β u jezgri. A, SGC7901 stanice su tretirane s (+) ili bez (-) 10 mMHMBA 24 h, a sakupljeni na kraju tretmana. Citosol i nuklearnih frakcije su pripremljeni i GSK-3β aktivnost je ispitivana u in vitro testu kinaze pomoću puža proteina kao supstrata. Fosforilirani protein puž signali densitometrically kvantificirane i izražena kao višestruki broj promjena u odnosu na netretirane kontrolne skupine. B, SGC7901 stanice su tretirane s 10 mM HMBA za različita vremena. Citoplazmatske i nuklearna proteinske frakcije su izvađeni i Western blot je provedena primjenom antitijela za GSK-3β, fosfo-GSK-3β (Ser9), fosfo-GSK-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-tubulina ili Topo IIβ.
inhibicija GSK-3β nadjačava HMBA-inducirana inhibicija CDK2 pregled napredovanje kroz G1 ovisi o CDK2 i CDK4 [38, 39]. Da bi se odredilo da li se pojavljuje GSK-3β reguliranje HMBA posredovanog G1 staničnog ciklusa putem CDK2 ili CDK4 inhibicije SGC7901 stanice su prethodno tretirani s LiCl (Slika 4a) ili SB-415286 (slika 4b), a zatim se podvrgne kombinirano liječenje s HMBA kroz 24 h, imunoprecipitacijski testovi su izvedeni na staničnim lizatima koristeći anti-CDK2 ili anti-CDK4 antitijela, respektivno. Osim toga, CDK2 ili CDK4 aktivnost je određena pomoću in vitro pokusom
kinaze. Tretman sa HMBA sami inhibirani CDK2 aktivnosti (gornji, lijevi panel), ali povećana aktivnost CDK4 (vrh, desni panel); Inhibicija GSK-3β pomoću LiCl ili SB-415286 značajno prigušuje HMBA inhibicije CDK2 aktivnosti (dolje). Tretman sa HMBA povećao ekspresiju i aktivnost GSK-3β u jezgri. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da GSK-3β doprinosi HMBA posredovanog ciklusa zastoja G1 stanica putem inhibicije CDK2. Slika 4 Inhibicija GSK-3β premošćuje HMBA-inducirana inhibicija CDK2. SGC7901 stanice prethodno su tretirani s (+) ili bez (-) 10 mM LiCl (A) ili 10 uM SB-415.286 (B) tijekom 30 minuta, nakon čega slijedi kombinirano liječenje s 10 mM HMBA 24 sata. Proteinski ekstrakti imunoprecipitiran s protu-CDK2 ili anti-CDK4 antitijela. Dobivene imuni kompleksi analizirani su na CDK2 aktivnosti pomoću histon H1 kao supstrata (gornje ploče) ili CDK4 aktivnost korištenjem Rb kao supstrata (donji prikaz). Fosforilirani histona H1 ili Rb proteina signali se kvantificiraju densitometrically i izražena kao višestruki broj promjena u odnosu na netretirane kontrolne skupine.
GSK-3β regulira nuklearna p27Kip1protein izraz
ispitati mehanizmi u podlozi HMBA posredovano G1 uhićenje i CDK2 inhibicije dalje, stanica ekspresija mRNA ciklus regulacije je analiziran pomoću RPA testovima. Tretman sa HMBA povećao P27 Kip1 mRNA ekspresije, ali smanjio p53, p57, p15 (slika 5A desno), ciklin A i ciklin izraz D1 mRNA (slika 5A lijevo). Međutim, tretman s LiCl povećava p21 WAF1 mRNA, ali ne utječe na razinu ekspresije drugim genima. Slični rezultati su dobiveni kada su stanice tretirane sa SB-415286 (dodatne datoteke 4). Ovi rezultati ukazuju da GSK-3β reguliranje HMBA posredovanog staničnog ciklusa ne uključuje regulaciju transkripcije gena staničnog ciklusa vezane. Slika 5 ekspresija mRNA gena s obzirom na stanični ciklus. A, testovi za zaštitu RNaza provedena su pomoću RNA iz SGC7901 stanice tretirane bilo s 10 mM HMBA, 20 mM LiCl, ili kombinacija HMBA i LiCl 24 h, hibridizira sa multi-sonde za inhibitore kinaza ovisnih o staničnom ciklusu (A; hCC- 2) ili ciklini (B-hCYC-1). B, SGC7901 stanice prethodno su tretirani s (+) ili bez (-) 10 mM LiCl (desne) ili 10 uM SB-415.286 (lijeva) tijekom 30 min, nakon čega kombinirano liječenje s 10 mM HMBA 24 sata. Proteina stanica ekstrakti su razdvojeni na SDS-PAGE, preneseni na PVDF membrane i imunoblot s antitijelima za p27Kip1, p21Waf1, CDK2 ili beta-aktin.
Za analizu mehanizma koji je fundamentalan GSK-3β-povezan staničnog ciklusa dalje ekspresija p21 WAF1 i p27 Kip1 proteina u SGC7901 stanica tretiranih sa HMBA u prisutnosti ili odsutnosti LiCl ili SB-415286 je ispitan. Dodavanjem Lici (slika 5B desno) ili SB-415286 (slika 5B lijevo) oslabljena indukciju p27 Kip1 ali ne i p21 WAF1 ekspresije proteina, što ukazuje da je p27 Kip1 sudjeluje u staničnog ciklusa prijelaza reguliran od strane GSK-3β. Kada p27 Kip1 akumulira u jezgri se veže za CDK2, inhibirati njezino djelovanje, i na kraju uzrokuje prekid staničnog ciklusa. Nadalje, HMBA (10 mM) povećala p27 Kip1 ekspresije proteina u citosolu i u jezgru od 0 do 24 sata nakon tretmana (slika 6a). HMBA (0-5 mM) povećala p27 Kip1 izraz nakon 24 sati u citosolu frakcija, a nakon 48 sati HMBA (5-10 mm) povećana p27 Kip1 izraz u nuklearnim frakcija (Slika 6b). Dodavanje Lici (Slika 6c) ili SB-415286 (Slika 6d) blokirano HMBA-povećanu p27 Kip1 nuklearne izraz bez utjecaja na p27 Kip1 izraz u citosolu, što ukazuje na određenu regulaciju nuklearne p27 Kip1 izražavanja GSK-3β. Da se pokaže uloga GSK-3β u regulaciji nuklearne p27 Kip1 ekspresiju dalje, stanice su transfektirane s siRNA usmjerenom protiv GSK-3β (slika 6e). RNAi posredovane suzbijanje GSK-3β je potvrdio imunoblotinga i oslabljena nuklearne p27 indukcijski Kip1 po HMBA bez utjecaja citosolu p27 indukciju Kip1. Potvrditi uloga GSK-3β u regulaciji nuklearne p27 Kip1 ekspresija SGC7901 stanice su transficirane sa vektorom koji kodira aktivirani oblik GSK-3β (GSK-3β-CA) ili prazna kontrolnom vektoru. Citosolu i nuklearne proteini su izvađeni i Western blot je provedena kako bi se utvrdilo p27 Kip1 izraz. Transformacija SGC7901 stanica s GSK-3βCA plazmida rezultirala je povećanom p27 Kip1 u nuklearnoj frakciji (Slika 6F) bez utjecaja p27 Kip1 razinama u citosolu. Prekomjerna ekspresija aktivnog oblika GSK-3β potvrđena je pomoću Western blotting i in vivo ispitivanjima
kinaze pomoću puža proteina kao supstrata (Slika 6 g). Uzeti zajedno, ovi rezultati ukazuju da GSK-3β sudjeluje u regulaciji staničnog ciklusa preko posebnog propisa nuklearne p27 Kip1 ekspresije proteina. Slika 6 nuklearne p27 izraz Kip1 modulirana GSK-3β. A & B, SGC7901 stanice su tretirane sa HMBA (10 mM) tijekom vremenskog tijeka (A), ili s različitim koncentracijama tijekom 24 sata. Citoplazmatske i nuklearna proteinske frakcije su izvađeni i Western blot je izvedena s protutijelima na p27Kip1, a-tubulina ili Topo IIβ. K& D SGC7901 stanice prethodno su tretirani s (+) ili bez (-) 20 mM LiCl (C) ili 10 uM SB-415.286 (D) tijekom 30 minuta, nakon čega slijedi kombinirano liječenje s 10 mM HMBA 24 sata. Citosol i nuklearnih proteina ekstrahiraju za analizu p27Kip1 proteina. E, SGC7901 stanice su transfektirane s siRNA usmjeren na GSK-3β i kontrolu siRNA. Dvadeset i četiri sata nakon transfekcije, stanice su tretirane sa HMBA tijekom dodatnih 24 h. Citosol i nuklearnih proteina ekstrahiraju za analizu p27Kip1 proteina. Obaranje GSK-3β ekspresije je potvrđena pomoću Western blota koristeći anti-GSK-3β antitijela. F, SGC7901 stanice su zaražene s Ad-HA-GSK-3βS9A ili Ad-P-gal za MOI od 10 pfu /stanica. Nakon 48 sati inkubacije, Citosol i nuklearna proteina su izvađeni i Western blot provedena pomoću anti-p27Kip1, anti-HA i anti-GSK-3 antitijela, odnosno pomoću anti-a-tubulin ili topografsko IIβ kao kontrola punjenja. GSK-3β aktivnosti su ispitani in vitro pokusom kinaze pomoću puža proteina kao supstrata (donji panel). p27Kip1 signali se kvantificiraju densitometrically i izražena kao višestruki broj promjena u odnosu na a-tubulin ili TopIIβ.
GSK-3β regulira p27Kip1binding da CDK2 pregled HMBA povećava p27 Kip1 ekspresija proteina, inhibiciju aktivnosti cdk2 i povećana aktivnost CDK4 (Slika 4). Izvodi iz kontrole ili obrađenih HMBA-stanica se imunoistaloži istražiti p27 Kip1 vezivanje na CDK2 i CDK4. Kao što je pokazano na slici 7a, HMBA liječenje povećane razine p27 Kip1 u kompleksima imunoistaloži s anti-CDK2, ali ne u kompleksima imunoistaloži s anti-CDK4. Ponovno sondiranje filtera sa anti-CDK2 i anti-CDK4 antitijela potvrdio je da je Imunoprecipitati iz kontrole i tretiranih HMBA-stanica sadržavala iste razine CDK2 i CDK4. Stoga, čini se da uzrokuje HMBA selektivno povećanje p27 Kip1 vezanje na CDK2. Analizirati da li inhibicija GSK-3β utječe na povezanost p27 Kip1 s CDK2, SGC7901 stanice su prethodno tretirani s LiCl ili SB-415286 i podvrgne kombinirano liječenje s HMBA 24 sata; cjelostaničnim ekstrakti su imunoprecipitirane. Liječenje s GSK-3β inhibitora, Lici (slika 7b) ili SB-415286 (Slika 7c) blokiran p27 Kip1 vezivanje CDK2. Ovi rezultati ukazuju da GSK-3β je neophodan za HMBA-inducirana povećanom p27 Kip1 vezanja na CDK2. Potvrditi uloga GSK-3β u regulaciji p27 pridruživanja Kip1 s CDK2, SGC7901 stanice su transficirane sa vektorom koji kodira aktivirani oblik GSK-3β ili Ad-P-gal. Cjelostanična protein se ekstrahira i imunoprecipitirane. Kao što je prikazano na Slici 7d transfekcija SGC7901 stanica sa GSK-3β-CA vektor rezultirao je povećanjem razine p27 Kip1 u kompleksima imunoprecipitiran s protu-CDK2 odnosu transfekcijom kontrolnog plazmida. To upućuje na zaključak da je GSK-3β nije nužno samo za HMBA posredovan p27 Kip1 vezivanje na CDK2, ali dovoljno da se poveća povezanost p27 Kip1 s CDK2 u SGC7901 stanicama. Slika 7 GSK-3β regulacija p27 1 suradnji s CDK2. A, SGC7901 stanice su tretirane s (+) ili bez (-) 10 mM HMBA 24 sata. Proteinski ekstrakti imunoprecipitiran s protu-CDK2 ili anti-CDK4 antitijela. Normalni zec IgG je korišten kao kontrola. CDK2 ili CDK4 povezana p27Kip1 u dobivenim imunih kompleksa je analiziran pomoću Western blota koristeći antitijelo anti-p27Kip1 s anti-CDK2 ili -CDK4 antitijela kao kontrola opterećenja. B & C, SGC7901 stanice prethodno su tretirani s (+) ili bez (-) 10 mM LiCl (B) ili 10 uM SB-415.286 (C) tijekom 30 min, nakon čega kombinirano liječenje s 10 mM HMBA 24 sata. Proteinski ekstrakti su imunoprecipitirane s anti-CDK2 antitijela. CDK2 povezan p27Kip1 u dobivenim imunih kompleksa analiziran sličan A. D, SGC7901 stanice su inficirane sa Ad-HA-GSK-3βCA ili kontrolu prijenosnika (Ad-β-gal) za MOI od 10 pfu /stanica. Nakon 48 sati inkubacije, proteina stanica je ekstrahiran i imunoistaloži s anti-CDK2 antitijela (gornji panel). p27Kip1 je analiziran pomoću Western blot sličan A. prekomjernom ekspresijom HA-označeni GSK-3CA potvrđena pomoću Western blota koristeći anti-GSK-3β antitijelo (donji panel). GSK-3β aktivnost je ispitivana in vitro
testu u kinaze pomoću puža proteina kao supstrata (donji panel). Pregled Rasprava
PI3-kinaze /Akt /GSK-3β signalni put je bio povezan s regulacijom staničnog rasta, apoptozu i diferencijaciju različitih staničnih tipova [46]. U ovom istraživanju, inhibicija GSK-3β pomoću komplementarna pristupa (npr kemijski inhibicije i konstitutivno aktivnu Akt prekomjerna ekspresija) oslabljeni proton ekspresije pumpe, mjere prema želučanom kao diferencijacije u SGC7901 staničnoj liniji želučane tumor potječe.
stanične proliferacije i diferencijacije tradicionalno smatra uzajamnim procesima, s povlačenjem staničnog ciklusa bude potrebno za terminalne diferencijacije [40], i p27 Kip1 igra važnu ulogu [41, 42]. Genetska brisanje p27, ali ne i p21 je pokazala da utječu na diferencijaciju želučane stanica, dok je prisilni p27 Kip1 izraz dovodi do diferencijacije, sugerirajući da p27 Kip1 je važnija od p21 WAF1 u regulaciji želučane stanice diferencijacija. U skladu s tim rezultatima, inhibicija GSK-3β oslabljenim HMBA posredovanih staničnom diferencijacijom i inhibiciju GSK-3β želuca blokiran HMBA posredovane nuklearne p27 Kip1 izraz, a prekomjerna ekspresija aktivnog oblika GSK-3β povećava nuklearno p27 Kip1 izražavanja, sugerirajući važnu ulogu u regulaciji diferencijacije želučane stanica kroz regulaciju nuklearne p27 Kip1 izražavanja.
  • želudac članak
    •   
  • Želučani struktura
    •   
  • Njega u želucu
    •   
  • Istraživanja

    • Istraživanja

    Istraživanja

    Other Languages

    želudac Zdravlje © https://www.stomachillness.com/hr