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P27KIP1, von Glykogen-Synthase-Kinase-3β reguliert wird, führt zu HMBA-induzierte Differenzierung von humanen Magenkrebs cells

P27 Kip1, von Glykogen-Synthase-Kinase-3β reguliert wird, führt zu HMBA-induzierte Differenzierung von menschlichen Magenkrebszellen
Zusammenfassung
Hintergrund
Magenkrebs ist die zweithäufigste Ursache der globalen Krebs-Mortalität. Obwohl Entdifferenzierung schlechte Prognose bei Magenkrebs vorhersagt, der molekulare Mechanismus zugrunde liegenden Entdifferenzierung, die grundlegende Einsichten in die Tumorentwicklung und Progression bieten könnte, ist noch erforscht werden. Darüber hinaus ist die molekulare Mechanismus die Wirkung von Hexamethylenbisacetamid (HMBA), eine kürzlich entdeckte Differenzierungsinduktor, erfordert Untersuchung zugrunde liegen, und es gibt keine Berichte über Studien über die Wirkung von HMBA auf Magenkrebs.
Methoden
Basierend auf den Ergebnissen von FACS-Analyse, die Niveaus von Proteinen in den Zellzyklus oder Apoptose beteiligt waren, unter Verwendung von western-Blotting nach der Einzelbehandlungen und sequentielle Kombinationen von HMBA und LiCl bestimmt. GSK-3β und Protonenpumpen wurden mittels Western Blot untersucht nach oben regulierenden Akt Ausdruck von Ad-Akt-Infektion. Um die Auswirkungen von HMBA auf Proteinlokalisierung und die Aktivitäten von GSK-3β, CDK2 und CDK4, Kinase-Assays, Immunpräzipitation und Western-Blot untersuchen durchgeführt wurden. Außerdem wurden Northern Blot und RNase-Schutztests durchgeführt, die funktionelle Konzentration von HMBA zu bestimmen.
Ergebnisse
HMBA erhöhte Expression p27Kip1 und induzierter Zellzyklusarrest mit Magen epithelialen Zelldifferenzierung verbunden. Zusätzlich Behandlung Magen abgeleiteten Zellen mit HMBA induzierten G0 /G1-Arrest und Hochregulation der Protonenpumpe, einem Marker von Magenkrebs Differenzierung. Darüber hinaus führte die Behandlung mit HMBA erhöht die Expression und Aktivität von GSK-3β im Kern aber nicht das Cytosol. HMBA verringerte CDK2 Aktivität und induzierte p27Kip1 Ausdruck, die durch die Hemmung von GSK-3β gerettet werden konnte. Darüber hinaus HMBA erhöhte sich auf CDK2 p27Kip1 Bindung, und dies wird durch GSK-3β Hemmung wurde abgeschafft.
Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse hier vorgestellt legen nahe, dass GSK-3β-Funktionen durch die Regelung p27Kip1 Montage mit CDK2, wodurch eine kritische Rolle bei der G0 spielen /G1-Arrest mit HMBA-induzierten Magen-epithelialen Zelldifferenzierung verbunden.
Schlüsselwörter HMBA Magenkrebs GSK-3β hintergrund und Magenkrebs ist eine der häufigsten Krebserkrankungen in der Welt und entwickelt sich oft Widerstand gegen Chemotherapie und Bestrahlung Behandlungen. Daher Kombinationstherapie wurde vorgeschlagen, die Krankheit besser zu bewältigen und die Wahrscheinlichkeit der Resistenzentwicklung [1] zu reduzieren. Hexamethylenbisacetamid (HMBA), eine Hybrid-polare Verbindung (HPC), die ursprünglich als Differenzierungs auslösende Agens entwickelt [2-6], verursacht Magen-Zelle Redifferenzierung [7-9].
Im Magen, Stammzellen in der proliferative Zellzone des Isthmus Region der Magendrüsen unterscheiden und führen zu verschiedenen Zelltypen [10, 11]. Sobald der erste tumorigenen Ereignis stattfindet, Progression weitere Tumor hängt von der Art des auslösenden Ereignisses und der Entwicklungsphase der Zelle, die sie und zusätzliche Mutationen erlitten, die auftreten könnten. Konstante Proliferation ist eine wichtige Eigenschaft von Stammzellen und in gastrointestinalen Geweben Mutationen sind wahrscheinlich in Erweiterung der veränderten Stammzellen zu führen, um die Wahrscheinlichkeit von zusätzlichen Mutationen und Tumorprogressions zunehmende [12]. Daher Stammzellen Magenkrebs Targeting ist wahrscheinlich der effektivste Weg zur Behandlung von Magenkrebs zu sein. Etwa 50% der westlichen Bevölkerung entwickelt Metaplasie, einen wichtigen Schritt in der Entwicklung von Krebs [13], die Aufmerksamkeit auf Bahnen, die Proliferation steuern und dadurch die Zelldifferenzierung. Unter diesen sind die TGF-b, Myb, Wnt und Hedgehog Wege sind von besonderer Bedeutung, mit prominent in Zell-Schicksal Spezifikation und Musterbildung während der Embryonalentwicklung und Erwachsenengewebeerneuerung. Die Aufklärung komplexer Tumorsuppressor und Beschleuniger Signalwege, die Wirkung Differenzierung Modulation der Übergangs- /Vorläuferzellen werden zur Optimierung der Therapie entscheidend sein Magenkrebs zu behandeln. Um für unreife Zellen des Magens
zu unterscheiden, benötigen sie bleiben in die G1-Phase des Zellzyklus für eine bestimmte Zeitperiode. Die Säugetierzellzyklus wird durch sequentielle Aktivierung und Inaktivierung einer hochkonservierte Familie von Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) reguliert; Progression durch Anfang bis Mitte der G1 ist abhängig von CDK4 und möglicherweise CDK6, während die Progression durch späte G1 und der S-Phase Aktivierung von CDK2 erfordert. Die Aktivitäten der CDKs können durch die Bindung von CDK inhibitorischen Proteine ​​gehemmt werden, einschließlich der Cip /Kip Familie (p21 Waf1, p27 Kip1 und p57 Kip2) und INK4 Familie (p15INK4b, p16Ink4a, p18INK4C und p19INK4d ). P27 Kip1 reguliert posttranskriptionell durch proteolytischen Abbau. CDK2 bindet an p27 Kip1 und phosphoryliert es auf Threonin 187 [14], und HMBA-induzierten Magen-Zell-Differenzierung wird mit der Hochregulation von p27 Kip1 [15, 16] und G0 /G1-Arrest verbunden. Allerdings gibt es nur wenige detaillierte Studien über die molekularen Mechanismen der HMBA über und es wurden auf Magenkrebs keine Berichte über Studien, die die Wirkung von HMBA zu untersuchen.
Als nachgeschalteter Ziel der Phosphatidylinositol-3-Kinase /Akt (PI3-Kinase /Akt ) -Weg, GSK-3β reguliert Zellproliferation und Differenzierung [17-20]. Thesaurierend zeigt Anzeichen dafür, dass Patienten mit einem verminderten GSK3 &bgr Signalisierung, die in G1-Funktionen Eingang von mehreren Signal- und Entwicklungswege zu erhalten, in Verbindung mit verschiedenen Krebserkrankungen des Menschen auftritt [21, 22]. GSK-3β wurde in mehreren biologischen Prozessen beteiligt, weil es ein breites Spektrum an Substraten, einschließlich mehrerer Differenzierungs Checkpoints einschließlich c-Myc, Schnecke und PI3K [23] phosphoryliert. Zuvor Hemmung der PI3-Kinase-Weg konnte gezeigt werden HMBA-vermittelte Magenzelldifferenzierung [8] zu verbessern. In dieser Studie wurde die Rolle von GSK-3β während Magenzelldifferenzierung mit der menschlichen Magenkrebszelllinie SGC7901, untersucht, die einen multi Phänotyp zeigt und stellt ein gut charakterisiertes Modell der Magen-Differenzierung. Die Ergebnisse deuten auf eine beitragende Rolle für GSK-3β im p27 Kip1 Weg während Magen-Differenzierung Zelle induziert durch HMBA.
Methoden
Zellkultur
der Magenkrebs-Zelllinie SGC7901 aus der Zellbank erhalten wurde in der chinesischen Akademie der Wissenschaften und kultiviert wie zuvor beschrieben [24]. SGC7901 Zellen wurden mit einem Adenovirus, codierend das aktivierte Form von Akt (Ad-Akt) bzw. der adenoviralen Kontrollvektor Kodierung β-Galactosidase (β-gal) bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) infiziert von 10 pfu /Zelle. Nach der Infektion mit Vektoren für eine Stunde, gefolgt von Austausch des Mediums und die Inkubation für weitere 24 h wurden die Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von HMBA behandelt und Protein und RNA für die West- und Northern Blotting extrahiert, respectively.
Material
HMBA, TSA, SB-415286 und LiCl wurden von Sigma Chemical Company, USA gekauft. Adenovirus-Vektoren kodieren, β-gal und die myristoyliert aktive Form von Akt (Ad-Akt) wurden von der Zelle Biolabs, USA erworben. Der Vektor kodiert, die katalytisch aktive Mutante von GSK3 &bgr; (HA-GSK-3βCA) wurde von Addgene gekauft. Non-Targeting-Kontroll-siRNA und die Smartpool für das Targeting GSK-3β wurden von Dharmacon, USA erworben. Alle Proben wurden mit einem Biotin Random Prime DNA Labeling Kit (Pierce) markiert.
Antikörper
Kaninchen anti-Akt, anti-Phospho-Akt (Ser473) und antiphospho-GSK-3β (Ser9) wurden von Cell Signaling gekauft , USA. Maus anti-GSK-3β, Maus anti-p27 Kip1, Maus anti-Top-IIb-und-Maus-anti-p21 Waf1 von BD Biosciences, USA gekauft wurden. Maus anti-Phospho-GSK-3 (Tyr278 /Tyr216) wurde aus Upstate, USA erhalten. Kaninchen anti-gespaltenem PARP-Antikörper wurde von Abcam, USA erworben. Anti-Protonen-Pumpen wurde von MBL International (USA) gekauft. Polyklonale anti-CDK2, anti-CDK4, anti-α-Tubulin-und Anti-Caspase-3 wurden von Santa Cruz Biotechnology (USA) erhalten.
Subzellulären Proteinextraktion und Western Blotting
Kern- und Cytosol-Fraktionen wurden gewonnen mit einem NE-PER Kern- und Cytoplasma-Extraktionsreagenzien-Kit (Pierce, USA). Cytosolische Protein (80 mg) oder Kernprotein (20 mg) wurde auf einem 10% Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf PVDF-Membranen übertragen, wie zuvor beschrieben [25]. Filter wurden in Blotting-Lösung für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membranen wurden über Nacht bei 4 ° C mit primären Antikörpern, gefolgt von Blotting mit einem Meerrettich-Peroxidase-konjugierter sekundärer Antikörper für eine Stunde inkubiert und visualisiert eine ECL-Detektionssystem verwenden.
Northern-Blot und RNase-Schutzassays (RPA)
Gesamt RNA wurde unter Verwendung von Trizolreagenz (Invitrogen) hergestellt. Die Proben wurden auf 1,2% Agarose /Formaldehyd-Gelen und übertragen unterstützt Nitrocellulose laufen. Die Membranen wurden mit einem Biotin markiert Magen-Protonen-Pumpen-cDNA-Sonde hybridisiert. Nach der Hybridisierung mit dem GAPDH-Sonde, eine Ladesteuerung, wurden die Membranen gewaschen und die Signale wurden unter Verwendung eines ECL-Detektionssystem detektiert. RNase-Schutz-Experimente wurden unter Verwendung des RPA-III-Kit von Ambion durchgeführt und der RiboQuant Multiprobe RNase Protection Assay-System wurde mehrere spezifische mRNAs zu detektieren genutzt. 32 P-markierten Antisense-RNA-Sonden wurden hergestellt, die menschliche Apoptosis H-CKW 2 und HCYC-1 Template Sets verwenden und Hybridisierungen wurden durchgeführt, um nach dem Protokoll des Herstellers.
Zellzyklusanalyse
Magenkarzinomzellen wurden unter Verwendung von Trypsin geerntet . Die Zellen wurden gesammelt, zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und in eiskaltem 70% Ethanol fixiert. resuspendiert zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, für 30 min in PBS, enthaltend 100 U /ml RNase A und inkubiert bei 37 ° C, nachdem die Zellen wurden mit PI (20 mg /ml) gefärbt und analysiert unter Verwendung von FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), wie zuvor beschrieben [25].
In-vitro-
Kinase-Assays
Die Aktivitäten von CDK2, CDK4 und GSK-3β gemessen wurden, wie zuvor beschrieben [26, 27]. Kurz gesagt, wurde CDK2, CDK4 oder GSK-3β von cytosolischen (100 mg Protein) oder Kern (25 mg Protein) Extrakten immunpräzipitiert. Kinase-Aktivität durch Inkubieren immunpräzipitiert CDK2 gemessen wurde, CDK4 oder GSK-3β in 40 ml Kinase-Puffer mit 4 mg rekombinantes Snail-Protein (gemessen GSK-3β-assoziierte Kinaseaktivität), 5 mg Histon H1 (CDK2-associated kinase zu messen Aktivität) oder Retinoblastom-Protein (CDK4-assoziierte Kinaseaktivität) bei 30 ° C für 30 min zu messen. Die Proben wurden wie in früheren Berichten beschrieben verarbeitet [28].
Ergebnisse | Hemmung von GSK-3β dämpft HMBA-induzierten Zellzyklusarrest und SGC7901 Zelldifferenzierung
SGC7901 Zellen in der G0 /G1-Zellzyklus-Kontrollpunkt angesammelt und differenziert in einen Enterozyten-ähnlichen Phänotyp nach Behandlung mit HMBA [29]. GSK-3β trägt zur Hemmung der Zellzyklus-Progression in differenzierenden Zellen [20, 30]. Daher ob GSK-3β eine Rolle bei der HMBA-induzierte spielt SGC7901 Zellzyklus-Hemmung untersucht. Wie in 1a gezeigt, Behandlung mit HMBA induzierten Zellen in der G0 /G1 Zellzykluskontrollpunkt zu akkumulieren. Die Behandlung mit Lithiumchlorid (LiCl), die GSK-3β in einem Mg 2+ kompetitiv hemmt [31], erhöht den Anteil an Zellen in der S-Phase. Die Behandlung mit einer Kombination aus LiCl und HMBA umgekehrt HMBA-vermittelte G1 Zellstillstand. Ähnliche Ergebnisse wurden nach der Behandlung mit SB-415286, ein potenter Inhibitor von GSK-3β [32] (Zusätzliche Datei 1) erhalten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass GSK-3β eine Rolle bei der HMBA-induzierten G1-Arrest spielen könnte. Um zu bestimmen, ob HMBA während der 24 h Behandlungszeitraum in Zelltod resultiert, wurde Protein extrahiert zu beurteilen, ob es erhöht wurde PARP-Spaltung und /oder aktive Caspase-3. Wie in 1b gezeigt, gab es keinen Anstieg in PARP-Spaltung und aktive Caspase-3 bis zu 48 h nach der Behandlung HMBA. Ein wichtiges frühes Ereignis in der terminalen Differenzierung von Zellen ist deren Rückzug aus dem Zellzyklus [6]. Da GSK-3β dokumentiert eine Rolle bei der Zellzyklusarrest zu spielen [33], wurde postuliert, dass die Hemmung der GSK-3β Differenzierung hemmen könnte. Daher werden die Auswirkungen von GSK-3β-Inhibitoren auf die Induktion von HMBA-vermittelten Magenprotonenpumpen Expression ein Marker für Magen Differenzierung untersucht wurden. SGC7901 Zellen wurden mit LiCl (1c und 1d) oder SB-415286 (Figur 1e und 1f) bei verschiedenen Konzentrationen für eine Stunde vorbehandelt und dann mit HMBA für 24 h behandelt. LiCl gehemmt HMBA-induzierte Magenprotonenpumpen Expression in einer dosisabhängigen Weise. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen, SB-415286 blockiert Magen-Protonen-Pumpen-Protein und mRNA-Expression, die von HMBA induziert wurde. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass GSK-3β spielt eine wichtige Rolle in HMBA-vermittelten Magenzelldifferenzierung. Abbildung 1: Hemmung von GSK-3β dämpft HMBA-induzierten Zellzyklusarrest und SGC7901 Zelldifferenzierung. A, SGC7901 Zellen wurden vorbehandelt mit oder ohne 10 mM LiCl für 30 min gefolgt von einer Kombinationsbehandlung mit 10 mM HMBA für 24 h, gefolgt von Quantifizierung der DNA-Gehalt durch Durchflusszytometrie. B, SGC7901 Zellen wurden mit HMBA (10 mM) für 24 h behandelt oder 48 h und wurden für die Western-Blot-Analyse vorbereitet. C & E wurden SGC7901 Zellen vorbehandelt mit oder ohne 10 mM LiCl oder 10 μMSB-415286 für eine Stunde, gefolgt von der Kombinationsbehandlung mit 10 mMHMBA für 24 h. Protonenpumpenexpressionsstatus wurde mittels Western-Blot-Analyse bestimmt. D & F wurde Gesamt-RNA aus Zellen und Q-RT-PCR-Analyse für Protonenpumpen mRNA Expression extrahiert wurde durchgeführt. (Die Daten stellen Mittelwert ± SD; * = p < 0,05 vs. Kontrolle; * = p < 0,05 gegenüber HMBA allein.)
Akt Magen-Differenzierung reguliert, induziert durch HMBA
GSK-3β inaktiviert wird es, wenn. stromabwärts von Akt phosphoryliert [34]. Daher wäre es vorhergesagt, dass die Aktivierung von Akt von PI3-Kinase würde mit der Hemmung von GSK-3β und anschließend in Verbindung gebracht werden, die Hemmung der Magenzelldifferenzierung. Um diese Hypothese zu testen, wurden SGC7901 Zellen mit Ad-Akt oder einem Kontrollvektor infiziert. Infektion mit Ad-Akt erhöhte Expression von phosphoryliertem Akt, Akt und phosphoryliert GSK-3β-Protein (Figur 2a), was mit früheren Ergebnissen zeigt, dass GSK-3β wirkt als ein Substrat von Akt. Wie in 2b gezeigt, Infektion von SGC7901 Zellen mit dem Ad-Akt adenoviralen Vektor allein hatte keine Wirkung auf die Magen-Protonenpumpe und mRNA-Expression. Allerdings Infektion mit dem Ad-Akt Vektor führte zu einer Hemmung der Expression Magen-Protonen-Pumpen-mRNA induziert durch HMBA im Vergleich zu HMBA und Infektion der Kontrolle (β-gal) Adenovirus, was darauf hindeutet, dass durch die PI3-Kinase-Signalweg /Akt Signalweg Magen-Zelle reguliert Differenzierung induziert durch HMBA Behandlung. Abbildung 2 Akt reguliert Magen-Differenzierung, induziert durch HMBA. A, Cytosol und Kernproteine ​​wurden aus den Zellen extrahiert, wie angegeben behandelt und gelöst werden auf SDS-PAGE aufgetrennt und mit Anti-Phospho-Akt, -Akt, phospho-GSK-3β und GSK-3β, unter Verwendung von anti-α-Tubulin und Topo IIβ als Kontrolle der cytosolischen bzw. Kernfraktionen. B, Protonenpumpen Expression gemessen wurde Western-Blot unter Verwendung gefolgt mit einer Fülle Quantifizierung. (Daten stellen den Mittelwert ± SD; * = p < 0,05 vs. Kontrolle; † = p < 0,05 gegenüber HMBA allein.). C, Gesamt-RNA (40 ug) wurde fraktioniert, auf Nitrocellulose-Membranen und sondiert mit einem Protonenpumpen cDNA markiert ist; Blots wurden mit GAPDH gestrippt und erneut sondiert.
Behandlung mit HMBA die Expression und Aktivität von GSK-3β im Kern erhöht
ob GSK-3β von HMBA Behandlung GSK-3β-Aktivität wurde durch Messung der bestimmt beeinflusst Test wurde Phosphorylierung von rekombinantem Snail, einem gut charakterisierten Substrat von GSK-3β [35, 36]. GSK-3β ist in den zytosolischen und nuklearen Kompartimenten von Zellen befinden, jedoch vorwiegend im Zytoplasma während der G1-Phase. Daher wurden fraktioniert nukleäre und zytoplasmatische Proteine ​​aus Kontrolle und HMBA behandelten Zellen und für GSK-3β-Aktivität untersucht. HMBA Behandlung führte zu einer Erhöhung der Aktivität von GSK-3β Kern (Abbildung 3a) und GSK-3β Hemmung HMBA-vermittelten G1-Arrest, was auf eine Rolle für GSK-3β in HMBA-induzierte Arretierung des Zellzyklus gedämpft. Ser9 Phosphorylierung von GSK-3β verringert GSK-3β-Aktivität, wohingegen Tyr216 Phosphorylierung GSK-3β-Aktivität erhöht [37]. Zur Analyse der zugrunde liegenden Mechanismen erhöhte GSK-3β-Aktivität, verursacht durch HMBA Behandlung, Ser9-phosphoryliert und Tyr216-phosphoryliert GSK-3β-Protein-Expression wurde unter Verwendung von Western-Blot bestimmt. HMBA Behandlung nuklearen Expression von GSK-3β Gesamt und Tyr216-phosphoryliert GSK-3β erhöht, ohne deren Expression im Cytosol (Abbildung 3b) zu beeinflussen. Interessanterweise erhöhte HMBA Behandlung Ser9-phosphoryliert GSK-3β-Protein-Expression sowohl in der zytosolischen und nuklearen Fraktionen. Ähnliche Ergebnisse wurden nach der Behandlung mit anderen HPCs, SAHA und EMBA erhalten (zusätzliche Datei 2). Darüber hinaus erhöht HPC die Aktivität von GSK-3β in den Zellkern, wie durch in vitro Kinase-Assays
(Weitere Datei 3) demonstriert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass HPC Kern GSK-3β-Aktivität unabhängig von der Phosphorylierung bei Ser9 erhöht. Abbildung 3: Behandlung mit HMBA erhöht die Expression und Aktivität von GSK-3β im Kern. A, wurden SGC7901 Zellen, behandelt mit (+) oder ohne (-) 10 mMHMBA für 24 h, und am Ende der Behandlung geerntet. Cytosol und Kernfraktionen wurden hergestellt und GSK-3β-Aktivität wurde durch in vitro-Kinase-Assay unter Verwendung von Snail-Protein als Substrat getestet. Phosphorylated Snail Proteinsignale wurden densitometrisch mit Respekt als fold change zu unbehandelten Kontrollgruppen quantifiziert und ausgedrückt. B wurden SGC7901 Zellen mit 10 mM HMBA für verschiedene Zeiten behandelt. Cytosolic und Kernproteinfraktionen wurden extrahiert und Western-Blot wurde durchgeführt, Antikörper gegen GSK-3β, Phospho-GSK-3β (Ser9), Phospho-GSK-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-Tubulin oder Topo IIβ verwenden.
Die Hemmung von GSK-3β überschreibt HMBA-induzierte CDK2 Hemmung
Progression durch G1 auf CDK2 und CDK4 abhängig ist [38, 39]. Um zu bestimmen, ob GSK-3β Regulation der HMBA-vermittelten G1 Zellzyklusarrest erfolgt über CDK2 oder CDK4 Hemmung wurden SGC7901 Zellen mit LiCl vorbehandelt (4a) oder SB-415286 (4b) und dann mit HMBA zur Kombinationsbehandlung unterzogen für 24 h vor der Immunopräzipitation Assays wurden an den Zelllysaten anti-CDK2 oder anti-CDK4 Antikörper bzw. durchgeführt. Zusätzlich wurde CDK2 oder CDK4-Aktivität bestimmt einen in vitro Kinase-Assay unter Verwendung
. Die Behandlung mit HMBA allein CDK2 Aktivität gehemmt (oben, links), sondern erhöhte CDK4-Aktivität (oben, rechts); Hemmung von GSK-3β LiCl oder SB-415286 signifikant HMBA Hemmung von CDK2 Aktivität (unten) mit gedämpft. Die Behandlung mit HMBA erhöht die Expression und Aktivität von GSK-3β im Kern. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse, dass GSK-3β zu tragen HMBA-vermittelten G1 Zellzyklusarrest durch die Hemmung von CDK2. Figur 4 Hemmung von GSK-3β überschreibt HMBA-induzierte Hemmung CDK2. SGC7901 Zellen wurden vorbehandelt mit (+) oder ohne (-) 10 mM LiCl (A) oder 10 uM SB-415286 (B) für 30 min durch Kombinationsbehandlung gefolgt mit 10 mM HMBA für 24 h. Protein-Extrakte wurden mit anti-CDK2 oder anti-CDK4 Antikörper immunpräzipitiert. Resultierende Immunkomplexe wurden für CDK2 Aktivität unter Verwendung von Histon H1 als Substrat (oberes Feld) oder für CDK4-Aktivität unter Verwendung Rb als Substrat (unteres Bild) analysiert. Phosphorylated Histon H1 oder Rb-Protein-Signale wurden quantifiziert densitometrisch und als Fold-Änderung gegenüber unbehandelten Kontrollgruppen.
GSK-3β reguliert Kern p27Kip1protein Ausdruck
Um die zugrunde liegenden Mechanismen HMBA vermittelten G1-Arrest und CDK2 Hemmung weiter zu untersuchen, Zellzyklus-regulatorischen wurde mRNA-Expression unter Verwendung von RPA-Assays analysiert. Die Behandlung mit HMBA erhöht P27 Kip1 mRNA-Expression verringerte sich jedoch p53, p57, P15 (5A rechts), Cyclin A und Cyclin D1 mRNA-Expression (5A links). Die Behandlung mit LiCl erhöhte p21 Waf1 mRNA-Expression, aber nicht die Expression von anderen Genen beeinflussen. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn Zellen, die mit SB-415286 (Weitere Datei 4) behandelt wurden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass GSK-3β Regulation der HMBA-vermittelten Zellzyklusarrest nicht die transkriptionelle Regulation von Zellzyklus-Genen beinhalten. Figur 5 mRNA Expression von Genen in Bezug auf Zellzyklus. A, RNase-Schutz-Assays wurden unter Verwendung von RNA aus SGC7901 Zellen mit entweder 10 mM HMBA, 20 mM LiCl, oder eine Kombination von HMBA und LiCl für 24 h hybridisiert mit Multisonden für Zellzyklus-abhängigen Kinaseinhibitoren (A behandelt durchgeführt; hCC- 2) oder Cycline (B; HCYC-1). B, SGC7901 Zellen wurden vorbehandelt mit (+) oder ohne (-) 10 mM LiCl (rechts) oder 10 uM SB-415286 (links) für 30 min, gefolgt von Kombinationsbehandlung mit 10 mM HMBA für 24 h. Ganzzellproteinextrakte wurden auf SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen übertragen und einem Immunoblotting mit Antikörpern gegen p27Kip1, p21Waf1, CDK2 oder β-Actin.
Zum zugrunde liegenden Mechanismen GSK-3β-assoziiertes Zellzyklusarrest weiter zu analysieren, die Expression von p21 Waf1 und p27 Kip1 Proteine ​​in SGC7901 mit HMBA in Gegenwart oder Abwesenheit von LiCl oder SB-415.286 behandelten Zellen wurde untersucht. Die Zugabe von LiCl (5B rechts) oder SB-415286 (5B links) schwächte die Induktion von p27 Kip1 aber nicht p21 Waf1 Proteinexpression, was darauf hindeutet, dass p27 Kip1 beteiligt sich in den Zellzyklus-Übergänge geregelt von GSK-3β. Wenn p27 Kip1 im Kern ansammelt bindet es an CDK2, seine Hemmung der Aktivität, und schließlich induziert Verhaftung Zellzyklus. Weiterhin erhöht HMBA (10 mM) p27 Kip1 Protein-Expression im Cytosol und Nucleus 0-24 h nach der Behandlung (Figur 6a). HMBA (0-5 mM) erhöhte p27 Kip1 Expression nach 24 h in Cytosol-Fraktionen und nach 48 h HMBA (5-10 mM) erhöhte p27 Kip1 Ausdruck in Kernfraktionen (Abbildung 6b). Die Zugabe von LiCl (6c) oder SB-415286 (Abbildung 6d) blockiert HMBA-erhöhte p27 Kip1 Kernexpression ohne p27 zu beeinflussen Kip1 Ausdruck im Cytosol, was darauf hindeutet, spezifische Regulierung der nuklearen p27 Kip1 Ausdruck durch GSK-3β. Um die Rolle von GSK-3β in der Regulation der Kern p27 Kip1 Expression weiter zu demonstrieren, wurden die Zellen mit siRNA gegen GSK-3β (6e) transfiziert. RNAi-vermittelte Unterdrückung von GSK-3β wurde durch Immunoblotting bestätigt und nukleare p27 Kip1 Induktion von HMBA abgeschwächt ohne cytosolische p27 zu beeinflussen Kip1 Induktion. Um die Rolle von GSK-3β in der Regulation der p27 Kern bestätigen Kip1 Expression wurden SGC7901 Zellen mit einem Vektor transfiziert codierend die aktivierte Form von GSK-3β (GSK-3β-CA) oder einem leeren Kontrollvektor. Cytosol und wurden Kernproteine ​​extrahiert und Western-Blot wurde durchgeführt, um p27 Kip1 Ausdruck bestimmen. Die Transfektion von SGC7901 Zellen mit dem GSK-3βCA Plasmid führte zu einer erhöhten p27 Kip1 in der Kernfraktion (6F) ohne p27 zu beeinflussen Kip1 Ebenen im Cytosol. Überexpression der aktiven Form von GSK-3β wurde unter Verwendung von Western-Blotting bestätigt und in vitro
Kinase-Assays unter Verwendung von Snail-Protein als Substrat (Figur 6G). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass GSK-3β in der Regulation des Zellzyklus durch die gezielte Regulierung der nuklearen p27 beteiligt Kip1 Proteinexpression. Abbildung 6 Nuclear p27 Kip1 Expression von GSK-3β moduliert. A & B, SGC7901 Zellen wurden für 24 h mit HMBA (10 mM) über einen Zeitverlauf (A) oder mit verschiedenen Konzentrationen behandelt. Zytosolischen und nuklearen Proteinfraktionen wurden extrahiert und Western-Blot wurde mit Antikörpern gegen p27Kip1, α-Tubulin oder Topo IIβ durchgeführt. Lager; D wurden SGC7901 Zellen vorbehandelt mit (+) oder ohne (-) 20 mM LiCl (C) oder 10 uM SB-415286 (D) für 30 min durch Kombinationsbehandlung gefolgt mit 10 mM HMBA für 24 h. Cytosol und Kernproteine ​​wurden für die Analyse von p27Kip1 Proteinexpression extrahiert. E wurden SGC7901 Zellen mit siRNA gerichtet transfizierenden GSK-3β oder siRNA Kontrolle zu bringen. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit HMBA für weitere 24 h behandelt. Cytosol und Kernproteine ​​wurden für die Analyse von p27Kip1 Proteinexpression extrahiert. Preissturz von GSK-3β-Expression wurde durch Western-Blot unter Verwendung von Anti-GSK-3β-Antikörper bestätigt. F wurden SGC7901 infizierten Zellen mit Ad-HA-GSK-3βS9A oder Ad-β-gal mit einer MOI von 10 pfu /Zelle. Nach 48 h Inkubation Cytosol und Kernprotein wurden extrahiert und Western-Blotting unter Verwendung von anti-p27Kip1, anti-HA und Anti-GSK-3 Antikörper, die jeweils anti-α-Tubulin oder Topo IIβ als Ladekontrolle verwendet. GSK-3β-Aktivitäten wurden durch in vitro-Kinase-Assay unter Verwendung von Snail-Protein als Substrat (unten) getestet. p27Kip1 Signale densitometrisch und als Fold-Änderung in Bezug auf a-Tubulin oder TopIIβ.
GSK-3β reguliert p27Kip1binding zu CDK2
HMBA erhöhte p27 Kip1 Proteinexpression inhibiert CDK2 Aktivität und erhöhte CDK4-Aktivität quantifiziert (Abbildung 4). Auszüge aus Kontrolle oder HMBA behandelten Zellen wurden immunpräzipitiert p27 Kip1 Bindung an CDK2 und CDK4 zu untersuchen. Wie in Figur 7a gezeigt, erhöht HMBA Behandlung das Niveau der p27 Kip1 in den immunpräzipitierten Komplexe mit anti-CDK2, aber nicht in Komplexen immunpräzipitiert mit anti-CDK4. Re-Sondierung der Filter mit Anti-CDK2 und Anti-CDK4 Antikörper, bestätigt, dass die Immunpräzipitate von Kontrolle und HMBA behandelten Zellen die gleichen Niveaus von CDK2 und CDK4 enthalten. Daher scheint HMBA eine selektive Erhöhung der p27 Kip1 Bindung an CDK2 zu verursachen. Um zu analysieren, ob die Hemmung der GSK-3β die Assoziation von p27 wirkt Kip1 mit CDK2, SGC7901 Zellen wurden mit LiCl oder SB-415286 vorbehandelt und einer Kombinationsbehandlung mit HMBA für 24 h; Ganzzellextrakte wurden immunpräzipitiert. Die Behandlung mit GSK-3β-Inhibitoren, LiCl (7b) oder SB-415286 (Abbildung 7c) blockiert p27 Kip1 Bindung an CDK2. Diese Ergebnisse legen nahe, dass GSK-3β ist von wesentlicher Bedeutung für HMBA-induzierte erhöhte p27 Kip1 Bindung an CDK2. Um die Rolle von GSK-3β in der Regulation der p27 Kip1 Assoziation mit CDK2 zu bestätigen, wurden SGC7901 Zellen mit einem Vektor transfiziert codierend die aktivierte Form von GSK-3β oder Ad-β-gal. Whole-Cell-Protein wurde extrahiert und immunpräzipitiert. Wie in Figur 7d dargestellt, die Transfektion von SGC7901 Zellen mit dem GSK-3β-CA-Vektor führte zu einem erhöhten Niveau von p27 Kip1 in den immunpräzipitierten Komplexe mit anti-CDK2, verglichen mit der Transfektion des Steuer Plasmids. Dies legt nahe, dass GSK-3β nicht nur notwendig für HMBA-vermittelter p27 Kip1 Bindung an CDK2 ist, aber auch ausreichend in SGC7901 Zellen, die die Assoziation von p27 Kip1 mit CDK2 zu erhöhen. Abbildung 7 GSK-3β Regulation von p27 Kip 1 Assoziation mit CDK2. A, wurden SGC7901 Zellen mit (+) behandelt oder ohne (-) 10 mM HMBA für 24 h. Protein-Extrakte wurden mit anti-CDK2 oder anti-CDK4 Antikörper immunpräzipitiert. Normales Kaninchen-IgG wurde als Kontrolle verwendet. unter Verwendung von Anti-p27Kip1 Antikörper mit Anti-CDK2 oder -CDK4 Antikörper als Lade Kontrollen Die CDK2-oder CDK4-assoziierten p27Kip1 in den resultierenden Immunkomplexe wurde durch Western-Blot analysiert. B & C wurden SGC7901 Zellen vorbehandelt mit (+) oder ohne (-) 10 mM LiCl (B) oder 10 uM SB-415286 (C) für 30 min durch Kombinationsbehandlung gefolgt mit 10 mM HMBA für 24 h. Protein-Extrakte wurden mit einem Anti-CDK2-Antikörper immunpräzipitiert. Das CDK2 assoziiert p27Kip1 in den resultierenden Immunkomplexe wurde ähnlich wie A. D analysiert, SGC7901 Zellen mit Ad-HA-GSK-3βCA oder Vektorsteuerung (Ad-β-gal) bei einem MOI von 10 pfu /Zelle infiziert wurden. Nach 48 h Inkubation wurde Gesamt-Zellprotein extrahiert und immunpräzipitiert mit Anti-CDK2-Antikörper (oberes Bild). p27Kip1 wurde durch Western-Blot ähnlich wie A. Die Überexpression von HA-markierten GSK-3CA analysiert durch Western-Blot bestätigt wurde unter Verwendung von Anti-GSK-3β-Antikörper (unteres Bild). GSK-3β-Aktivität untersucht wurde durch einen in vitro Kinase-Assay unter Verwendung
Snail-Protein als Substrat (unteres Feld).
Discussion
die PI3-kinase /Akt /GSK-3β-Signalweg ist in der Regulation verwickelt Zellwachstum, Apoptose und Differenzierung verschiedener Zelltypen [46]. In der vorliegenden Studie, die Hemmung von GSK-3β mit komplementären Ansätzen (dh chemische Hemmung und konstitutiv aktiven Akt Überexpression) abgeschwächte Protonenpumpen Ausdruck, ein Maß für magen wie Differenzierung, in der Magen-Tumor-derived SGC7901 Zelllinie.
Die Zellproliferation und Differenzierung als reziproke Prozesse traditionell wahrgenommen, mit Zellzyklus-Rückzug für die terminale Differenzierung erforderlich ist, [40] und P27 Kip1 eine wichtige Rolle spielen [41, 42]. Genetische Deletion von p27, aber nicht p21 wurde Magen-Zelldifferenzierung gezeigt zu beeinflussen, während gezwungen p27 Kip1 Ausdruck Differenzierung führt, dass p27 was darauf hindeutet, Kip1 ist wichtiger als p21 Waf1 bei der Regulierung der Magen-Zelle Differenzierung. Magen-Zell-Differenzierung und Hemmung von GSK-3β blockiert HMBA-vermittelten Kern p27 Kip1 Ausdruck In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen, die Hemmung von GSK-3β abgeschwächten HMBA-vermittelte, während die Überexpression der aktiven Form von GSK-3β Erhöhung der nuklearen p27 Kip1 Ausdruck, eine wichtige Rolle bei der Regulation der Magenzelldifferenzierung durch die Regulierung der nuklearen p27 was darauf hindeutet, Kip1 Ausdruck.
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