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P27KIP1, regulamentada pelo glicogênio sintase-quinase-3β, resulta na diferenciação induzida HMBA de P27 cells

câncer gástrico humano KIP1, regulamentada pelo glicogênio sintase-quinase-3β, resulta na diferenciação induzida HMBA de células cancerosas gástricas humanas da arte abstracta
Fundo
o câncer gástrico é a segunda causa mais comum de mortalidade global, relacionada ao câncer. Embora desdiferenciação prediz mau prognóstico no câncer gástrico, a desdiferenciação subjacente mecanismo molecular, o que poderia fornecer insights fundamentais para o desenvolvimento e progressão tumoral, ainda não foi elucidado. Além disso, o mecanismo molecular subjacente aos efeitos da bisacetamida hexametileno (HMBA), um indutor de diferenciação recentemente descoberto, requer investigação e não há estudos relatados sobre o efeito das HMBA no câncer gástrico.
Métodos
Com base nos resultados de a análise FACS, os níveis de proteínas envolvidas no ciclo celular ou a apoptose foi determinada utilizando transferência de western após tratamentos individuais e combinações sequenciais de HMBA e de LiCl. GSK-3β e bomba de protões foram investigados por western blot após up-regulação da expressão Akt por infecção Ad-Akt. Para investigar os efeitos de HMBA na localização de proteínas e as atividades da GSK-3β, CDK2 e CDK4, ensaios de quinase, imunoprecipitação e western blot foram realizados. Além disso, a transferência de Northern e ensaios de protecção de RNase foram realizados para determinar a concentração funcional de HMBA.
Resultados
HMBA expressão aumentada p27Kip1 e paragem do ciclo celular induzida associada com a diferenciação celular epitelial gástrica. Além disso, o tratamento de células derivadas-gástrica com G0 induzida prisão HMBA /G1 e a sobre-regulação da bomba de protões, um marcador de diferenciação cancro gástrico. Além disso, o tratamento com HMBA aumentou a expressão e a actividade de GSK-3β no núcleo, mas não o citosol. HMBA diminuição da actividade de CDK2 e p27Kip1 expressão induzida, o que pode ser resgatada por inibição de GSK-3β. Além disso, o aumento de HMBA p27Kip1 ligação a CDK2, e esta foi abolida pela inibição de GSK-3β.

Conclusões Os resultados apresentados aqui sugerem que as funções de GSK-3p, regulando a montagem p27Kip1 com CDK2, desempenhando assim um papel crítico na fase G0 /paragem G1 associada com a diferenciação da célula epitelial gástrica induzida por HMBA.
Palavras-chave
HMBA câncer gástrico fundo GSK-3β
o câncer gástrico é um dos cancros mais comuns no mundo e muitas vezes desenvolve resistência à quimioterapia e radiação tratamentos. Por conseguinte, a terapia de combinação foi proposta para lidar com a doença e para diminuir a probabilidade de desenvolvimento de resistência [1]. bisacetamida de hexametileno (HMBA), um composto polar híbrido (HPC) originalmente desenvolvido como um agente indutor de diferenciação [2-6], faz com que células re-diferenciação gástrica [7-9].
No estômago, as células no tronco zona da célula proliferativa da região do istmo das glândulas gástricas diferenciam e dão origem a vários tipos de células [10, 11]. Uma vez que o primeiro evento tumorigénico tem lugar, a progressão do tumor depende da natureza do evento inicial e o estádio de desenvolvimento da célula que o sustenta e mutações adicionais que poderiam ocorrer. proliferação constante é uma característica fundamental das células estaminais e, em tecidos gastrointestinais mutações são susceptíveis de provocar a expansão de células estaminais alterados, aumentando a probabilidade de mutações adicionais e progressão do tumor [12]. Portanto, tendo como alvo as células-tronco do câncer gástrico é provável que seja a forma mais eficaz de tratamento do cancro gástrico. Aproximadamente 50% da população ocidental desenvolve metaplasia, um passo chave no desenvolvimento do cancro [13], chamando a atenção para caminhos que controlam a proliferação e diferenciação celular, assim. Entre estes, o TGF-b, MYB, Wnt e Hedgehog percursos são de particular relevância, com destaque na especificação de células-destino e formação de padrões durante a embriogênese e adultos renovação dos tecidos. A elucidação do supressor de tumor complexo e acelerador vias de sinalização, que a modulação efeito de diferenciação de células de transição /progenitoras, será crucial para a otimização da terapêutica para o tratamento de câncer gástrico.
Para que as células gástricas imaturos para diferenciar, eles exigem para ficar em a fase G1 do ciclo celular durante um certo período de tempo. O ciclo de células de mamíferos é regulado por activação sequencial e inactivação de uma família altamente conservadas de quinases dependentes de ciclina (CDKs); progressão através cedo para mid-G1 é dependente de CDK4 e possivelmente CDK6, enquanto a progressão através G1 tarde e a fase S requer ativação de CDK2. As atividades de CDKs pode ser inibida pela ligação de proteínas inibidoras de CDK incluindo a família Cip /Kip (p21 WAF1, p27 KIP1 e p57 Kip2) e da família INK4 (p15Ink4b, p16INK4a, p18Ink4c e p19Ink4d ). P27 KIP1 é regulado pós-transcricional por degradação proteolítica. CDK2 se liga a p27 KIP1 e fosforila-o na treonina 187 [14], e a diferenciação das células-gástrica induzida HMBA está associada com a sobre-regulação de p27 KIP1 [15, 16] e G0 /G1 prisão. No entanto, existem poucos estudos detalhados relativos ao mecanismo molecular de HMBA e não houve estudos relatados investigando o efeito de HMBA no câncer gástrico.
Como um alvo a jusante da fosfatidilinositol-3-quinase /Akt (PI3-quinase /Akt ) percurso, a GSK-3β regula a proliferação e diferenciação celular [17-20]. O acúmulo de evidências indica que hipoativo sinalização GSK3β, que funciona no G1 para receber a entrada de vários de sinalização e vias de desenvolvimento, ocorre em associação com diversos cancros humanos [21, 22]. A GSK-3β tem sido implicada em vários processos biológicos porque fosforila uma ampla gama de substratos, incluindo vários pontos de controlo de diferenciação, incluindo c-myc, caracol e PI3K [23]. Anteriormente, foi demonstrado a inibição da via de PI3-cinase para melhorar a diferenciação de células gástrica HMBA mediada [8]. Neste estudo, o papel de GSK-3β durante a diferenciação celular gástrica foi investigada utilizando a linha de células de cancro gástrico humano SGC7901, que exibe um fenótipo multipotentes e representa um modelo bem caracterizado de diferenciação gástrica. Os resultados sugerem um papel contributivo para a GSK-3β na p27 KIP1 via gástrica durante a diferenciação celular induzida por HMBA.
Métodos
cultura celular
A linha celular de cancro gástrico SGC7901 foi obtido a partir do banco de células na Academia chinesa de Ciências e cultivadas como descrito anteriormente [24]. SGC7901 células foram infectadas com um adenovírus que codifica para a forma activada de Akt (Ad-Akt) ou o controlo de vector adenoviral que codifica β-galactosidase (β-gal) a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 pfu /célula. Após a infecção com vectores de uma hora, seguido por substituição do meio e incubação durante mais 24 horas, as células foram tratadas na presença ou ausência de HMBA, e proteína e ARN foram extraídos por transferência de Western e Northern, respectivamente. Materiais

HMBA, TSA, SB-415286 e LiCl foram adquiridos a partir de Sigma Chemical Company, EUA. Os vectores de adenovírus que codificam β-gal e a forma activa miristoilada de Akt (Ad-Akt) foram adquiridos a partir de células Biolabs, EUA. O vector que codifica o mutante cataliticamente activo de GSK3β (HA-GSK-3βCA) foi adquirido a partir de Addgene. Non-alvo de controle siRNA ea SmartPool para a segmentação GSK-3β foram adquiridos de Dharmacon, EUA. Todas as sondas foram marcadas com uma Labeling Kit Biotina Aleatório Prime DNA (Pierce). Os anticorpos

coelho anti-Akt, anti-fosfo-AKT (Ser473) e antiphospho-GSK-3β (Ser9) foram adquiridos a partir de Cell Signaling , EUA. Rato anti-GSK-3β, rato anti-p27 KIP1, rato anti-Top IIb e rato anti-p21 WAF1 foram adquiridos da BD Biosciences, EUA. De ratinho anti-fosfo-GSK-3 (Tyr278 /Tyr216) foi obtido a partir de Upstate, EUA. Anticorpo de coelho anti-PARP clivada foi comprado de Abcam, EUA. bomba de anti-próton foi comprado de MBL International (EUA). Policlonal anti-CDK2 e anti-CDK4, anti-α-tubulina e anti-caspase-3 foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (EUA).
Extracção de proteína sub-celular e western blotting
fracções citosólicas e nucleares foram extraídas utilizando um kit de NE-PER nuclear e citoplasmática de extracção Reagentes (Pierce, EUA). proteína citosólica (80 mg) ou proteína nuclear (20 mg) foi resolvido num gel de poliacrilamida a 10% e transferidas para membranas de PVDF como previamente descrito [25]. Os filtros foram incubados durante uma hora à temperatura ambiente em solução de mata-borrão. As membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários seguido de blotting com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano, durante uma hora, e visualizada utilizando um sistema de detecção de ECL.
Northern blotting e ensaios de protecção de ARNase (RPA)
total O ARN foi preparado utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen). As amostras foram corridas em géis de agarose a 1,2% /formaldeído e transferido para nitrocelulose suportada. As membranas foram hibridadas com uma sonda de ADNc de protões gástrica bomba marcado com biotina. Após hibridação com a sonda GAPDH, um controlo de carga, as membranas foram lavadas e os sinais foram detectadas utilizando um sistema de detecção de ECL. experiências de protecção de ARNase foram realizados utilizando o kit RPA-III a partir de Ambion e o Sistema de Ensaio de Protecção RiboQuant Multiprobe ARNase foi utilizada para detectar vários mRNAs específicos. 32P-marcado com sondas de ARN anti-sentido foram preparadas utilizando os HCC-2 e hCYC-1 Define molde Apoptose humano e as hibridações foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante. A análise de ciclo celular

células gástricas cancerosas foram colhidas utilizando tripsina . As células foram recolhidas, lavadas duas vezes com PBS gelado e fixada em gelo-frio a 70% de etanol. Depois de ser lavado duas vezes com PBS gelado, ressuspensas em PBS contendo 100 U /ml de ARNase A e incubou-se a 37 ° C durante 30 min, as células foram coradas com PI (20 mg /ml) e analisadas utilizando FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA), como previamente descrito [25].
in vitro
quinase ensaios
As actividades de CDK2, CDK4 e GSK-3β foram medidos como descrito anteriormente [26, 27]. Resumidamente, CDK2, CDK4 ou GSK-3β foi imunoprecipitada a partir de citosólica (100 mg de proteína) ou de extractos nucleares (25 mg de proteína). A actividade de quinase foi medida por incubação imunoprecipitados de CDK2, CDK4 ou GSK-3β em 40 ml de tampão de quinase com 4 mg de proteína Snail recombinante (para medir a actividade da quinase GSK-3β-associados), 5 mg de histona H1 (para medir a cinase associada ao CDK2 actividade) ou a proteína do retinoblastoma (para medir a actividade de quinase associada a CDK4) a 30 ° C durante 30 min. As amostras foram processadas como descrito em relatórios anteriores [28].

Resultados da Inibição de GSK-3β atenua a paragem do ciclo celular induzida por HMBA e diferenciação celular SGC7901
SGC7901 células acumuladas na barreira do ciclo celular G0 /G1 e diferenciadas em um fenótipo enterócito semelhantes após tratamento com HMBA [29]. A GSK-3β contribui para a inibição da progressão do ciclo celular em células de diferenciação [20, 30]. Portanto, se a GSK-3β desempenha um papel na inibição do ciclo celular induzida por SGC7901 HMBA foi investigada. Como demonstrado na Figura 1a, o tratamento com células HMBA induzida para acumular no ponto de verificação do ciclo celular fase G0 /G1. O tratamento com cloreto de lítio (LiCl), que inibe a GSK-3β num Mg 2+ forma competitiva [31], aumentou a percentagem de células na fase S. O tratamento com uma combinação de LiCl e de HMBA invertida prisão celular G1 HMBA-mediada. Resultados semelhantes foram obtidos após o tratamento com SB-415.286, um potente inibidor de GSK-3β [32] (1 arquivo adicional). Estes resultados sugerem que a GSK-3β poderia desempenhar um papel na paragem em G1 induzida por HMBA. Para determinar se HMBA resultou na morte das células durante o período de tratamento de 24 h, a proteína foi extraído para avaliar se houve um aumento da clivagem de PARP e /ou caspase-3. Conforme demonstrado na figura 1b, não houve aumento na clivagem de PARP e activo caspase-3 até 48 h após o tratamento de HMBA. Um acontecimento precoce importante na diferenciação terminal de células é a sua retirada do ciclo celular [6]. Uma vez que a GSK-3β está documentado para desempenhar um papel na paragem do ciclo celular [33], foi postulado que a inibição de GSK-3β poderia inibir a diferenciação. Portanto, um marcador de diferenciação gástrica, foram examinados os efeitos de inibidores de GSK-3 sobre a indução da expressão da bomba de protões gástrica HMBA-mediada. SGC7901 células foram pré-tratadas com LiCl (Figura 1c e 1d) ou SB-415286 (Figura 1E e 1F) a várias concentrações durante uma hora, e depois tratou-se com HMBA, durante 24 h. LiCl inibiram a expressão da bomba de protões gástrica induzida por HMBA de um modo dependente da dose. Consistente com estes resultados, o SB-415286 bloqueado proteína da bomba de protões gástrica e a expressão de ARNm, que foi induzida por HMBA. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a GSK-3β desempenha um papel importante na diferenciação celular mediada por gástrico HMBA. Figura 1 A inibição de GSK-3β atenua a paragem do ciclo celular induzida por HMBA e diferenciação celular SGC7901. Um, SGC7901 células foram pré-tratadas com ou sem LiCl 10 mM durante 30 minutos, seguido de tratamento com combinação de HMBA 10 mM durante 24 horas, seguido de quantificação com conteúdo de ADN por citometria de fluxo. B, SGC7901 células foram tratadas com HMBA (10 mM) durante 24 h ou 48 h e foram preparados para análise de transferência de Western. C & E, SGC7901 células foram pré-tratadas com ou sem 10 mM de LiCl ou 10 μMSB-415286 durante uma hora seguido por tratamento combinado com 10 mMHMBA durante 24 h. protões estado bomba expressão foi determinado por análise de transferência de Western. D & M, o RNA total foi extraído a partir de células e análise Q-RT-PCR para a expressão do mRNA da bomba de protões foi realizada. (Os dados representam a média ± SD; * = p < 0,05 vs controlo; * = p < 0,05 vs. HMBA sozinho.)
Akt regula a diferenciação gástrica induzida por HMBA
GSK-3β é inactivada quando se. é fosforilado a jusante de Akt [34]. Portanto, seria previsível que a activação de Akt quinase por PI3-se estar associada com a inibição de GSK-3β e, subsequentemente, a inibição da diferenciação das células gástrico. Para testar esta hipótese, SGC7901 células foram infectadas com um vector de controlo Ad-Akt ou. Infecção com Ad-Akt fosforilada aumento da expressão de Akt, Akt fosforilada e GSK-3β proteína (Figura 2a), consistente com os resultados anteriores demonstram que os actos de GSK-3p como um substrato de Akt. Como demonstrado na Figura 2b, a infecção de células SGC7901 com o vector adenoviral Ad-Akt sozinho não teve efeito na bomba de protões gástrica e a expressão do mRNA. No entanto, a infecção com o vector Ad-Akt, resultou na inibição da expressão de mRNA da bomba de protões gástrica induzida por HMBA em comparação com HMBA e infecção do controlo (β-gal) adenovírus, sugerindo que a sinalização através da PI3-quinase /Akt regula célula gástrica a diferenciação induzida por tratamento de HMBA. Figura 2 Akt regula a diferenciação gástrica induzida por HMBA. A, citosol e as proteínas nucleares foram extraídas de células tratadas como indicado e resolvidos em SDS-PAGE e colocados a hibridar com anti-fosfo-Akt, -Akt, fosfo-GSK-3β, e GSK-3β, utilizando anticorpos anti-α-tubulina e Topo IIβ como controle do citosólica e frações nucleares, respectivamente. B, expressão da bomba de protões foi medido utilizando western blot seguiu com abundância quantificação. (Os dados representam a média ± SD; * = p < 0,05 vs controlo; † = p < 0,05 vs. sozinho HMBA.). C, o ARN total (40 ug) foi fraccionado, transferido para membranas de nitrocelulose e sondadas com um ADNc marcado com bomba de protões; blots foram retirados e sondado com GAPDH.
tratamento com HMBA aumentou a expressão e a actividade de GSK-3β no núcleo
Para testar se a GSK-3β foi influenciada pelo tratamento de HMBA, foi determinada a actividade de GSK-3β medindo a fosforilação de Snail recombinante, um substrato bem caracterizado de GSK-3β [35, 36]. A GSK-3β está localizado nos compartimentos citossólicos e nucleares de células, mas predominantemente no citoplasma durante a fase G1. Portanto, as proteínas nucleares e citoplasmáticos foram fraccionados a partir de controlo e as células tratadas com HMBA e examinadas para actividade de GSK-3β. HMBA tratamento resultou num aumento na actividade de GSK-3β nuclear (Figura 3a), e a inibição de GSK-3β atenuado a paragem em G1 mediada por HMBA, indicando um papel para a GSK-3β na paragem do ciclo celular induzida por HMBA. Ser9 fosforilação de GSK-3β diminui a actividade de GSK-3β, ao passo que a fosforilação Tyr216 aumenta a actividade de GSK-3β [37]. Para analisar os mecanismos subjacentes a um aumento da actividade de GSK-3β causada por tratamento de HMBA, Ser9-fosforilada e a expressão da proteína GSK-3β Tyr216-fosforilado foi determinada utilizando Western blotting. HMBA tratamento aumentou os níveis de expressão nuclear do total de GSK-3β e Tyr216-fosforilada por GSK-3β sem afectar a sua expressão no citosol (Figura 3b). Curiosamente, o tratamento de HMBA aumento da expressão da proteína GSK-3β Ser9-fosforilado em ambos os citosólica e fracções nucleares. Resultados semelhantes foram obtidos após o tratamento com outro HPCs, SAHA e EMBA (arquivo adicionais 2). Além disso, a HPC aumentou a actividade de GSK-3β no núcleo, como demonstrado in vitro por ensaios de cinase (
arquivo adicional 3). Estes resultados sugerem que o HPC aumenta a actividade de GSK-3β nuclear independentemente de fosforilação no Ser9. Figura 3 O tratamento com HMBA aumentou a expressão e a actividade de GSK-3β no núcleo. Um, SGC7901 células foram tratadas com (+) ou sem (-) 10 mMHMBA durante 24 horas, e colhidas no final do tratamento. Citosol e fracções nucleares foram preparados e a actividade de GSK-3β foi ensaiada pelo ensaio in vitro da quinase usando proteína Snail como substrato. sinais de proteína fosforilada Caracol foram densitometricamente quantificada e expressa como fold-change no que diz respeito aos grupos de controlo não tratados. B, SGC7901 células foram tratadas com 10 mM de HMBA por várias vezes. fracções citosólicas e proteínas nucleares foram extraídas e transferência de Western foi realizada utilizando anticorpos contra GSK-3β, fosfo-GSK-3β (Ser9), fosfo-GSK-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-tubulina ou Topo IIβ.
a inibição de GSK-3β substitui inibição de CDK2-induzida HMBA
Progressão através G1 é dependente de CDK2 e CDK4 [38, 39]. Para determinar se o regulamento de GSK-3β de paragem do ciclo celular G1 HMBA mediada ocorre através da inibição de CDK2 ou CDK4, SGC7901 células foram pré-tratadas com LiCl (Figura 4a) ou SB-415286 (Figura 4b) e, em seguida, submetido a tratamento de combinação com HMBA durante 24 h antes dos ensaios de imunoprecipitação foram efectuados com os lisados ​​de células utilizando anticorpos anti-CDK2 ou anti-CDK4, respectivamente. Além disso, CDK2 ou CDK4 actividade foi determinada usando um ensaio in vitro de cinase in
. O tratamento com HMBA sozinho inibiu a atividade CDK2 (parte superior, painel esquerdo), mas o aumento da atividade CDK4 (superior, painel da direita); inibição de GSK-3β usando LiCl ou SB-415286 atenuou significativamente a inibição da actividade de CDK2 HMBA (parte inferior). O tratamento com HMBA aumentou a expressão e a actividade de GSK-3β no núcleo. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a GSK-3β contribui para a paragem do ciclo celular G1 HMBA-mediada através da inibição da CDK2. Figura 4 Inibição de GSK-3β substitui inibição de CDK2-induzida HMBA. SGC7901 células foram pré-tratadas com (+) ou sem (-) 10 mM de LiCl (A) ou de 10 uM SB-415286 (B) durante 30 min, seguido de tratamento com combinação de HMBA 10 mM durante 24 h. Os extractos de proteína foram imunoprecipitadas com anticorpos anti-CDK4 anti-CDK2 ou. imunocomplexos resultantes foram analisadas quanto à actividade de CDK2 utilizando histona H1 como substrato (painel superior) ou para a actividade de CDK4 Rb usando como substrato (painel inferior). sinais de histona H1 fosforilada ou proteína Rb foram quantificados densitometricamente e expressa como vezes de alteração em relação aos grupos de controlo não tratados.
GSK-3β regula p27Kip1protein nuclear expressão
Para examinar os mecanismos subjacentes HMBA a paragem em G1 mediada por inibição de CDK2 e ainda mais, a expressão de ARNm ciclo-regulação celular foi analisada utilizando ensaios de RPA. O tratamento com HMBA aumentou P27 expressão de mRNA KIP1 mas diminuiu p53, p57, P15 (Figura 5A direita), ciclina A e ciclina D1 expressão de mRNA (Figura 5A esquerda). No entanto, o tratamento com LiCl aumento p21 expressão mRNA WAF1 mas não afetou os níveis de outros genes de expressão. Resultados semelhantes foram obtidos quando as células foram tratadas com o SB-415286 (arquivo adicional 4). Estes resultados sugerem que a regulação de GSK-3β de paragem do ciclo celular mediada por HMBA não envolve a regulação da transcrição de genes relacionados com o ciclo celular. Figura 5 a expressão de ARNm dos genes no que respeita ao ciclo celular. A, ensaios de protecção de RNase foram realizados utilizando o ARN de células tratadas com SGC7901 quer HMBA 10 mM, 20 mM de LiCl, ou uma combinação de HMBA e LiCl durante 24 h, hibridado com multi-sondas para inibidores do ciclo celular cinase dependente de (a; hCC- 2) ou ciclinas (B; hCYC-1). B, células SGC7901 foram pré-tratados com (+) ou sem (-) 10 mM de LiCl (à direita) ou 10 pM SB-415286 (à esquerda), durante 30 min, seguido de tratamento com combinação de HMBA 10 mM durante 24 h. extractos de proteína de célula total foram resolvidos em SDS-PAGE, transferidos para membranas de PVDF, e imunotransferidas com anticorpos para p27Kip1, p21Waf1, CDK2, ou β-actina.
Para analisar os mecanismos subjacentes a paragem do ciclo celular GSK-3β-associado ainda, a expressão de p21 e WAF1 p27 proteínas KIP1 SGC7901 em células tratadas com HMBA na presença ou ausência de LiCl ou SB-415286 foi examinada. A adição de LiCl (Figura 5B direita) ou SB-415286 (Figura 5B esquerda) atenuou a indução de p27 KIP1 mas não p21 expressão da proteína WAF1, sugerindo que a p27 KIP1 participa das transições do ciclo celular regulada por GSK-3β. Quando P27 KIP1 acumula-se no núcleo que se liga a CDK2, inibir a sua actividade, e, eventualmente, induz a paragem do ciclo celular. Além disso, HMBA (10 mM) aumentou p27 KIP1 expressão da proteína no citossol e no núcleo de 0 a 24 horas após o tratamento (Figura 6a). HMBA (0-5 mM) aumentou p27 expressão KIP1 após 24 h em fracções citosólicas e após 48 h de HMBA (5-10 mM) aumentaram p27 expressão KIP1 nas fracções nucleares (Figura 6b). A adição de LiCl (Figura 6c) ou SB-415286 (Figura 6d) bloqueou HMBA-aumentada expressão nuclear KIP1 p27 sem afetar p27 expressão KIP1 no citoplasma, sugerindo regulamentação específica da p27 nuclear expressão KIP1 por A GSK-3β. Para demonstrar o papel de GSK-3β na regulação de p27 nuclear expressão KIP1 Além disso, as células foram transfectadas com siARN dirigido contra a GSK-3β (Figura 6E). supressão mediada por RNAi da GSK-3β foi confirmada por immunoblotting e atenuou p27 nuclear indução KIP1 por HMBA sem afetar citosólica p27 indução KIP1. Para confirmar o papel de GSK-3β na regulação de p27 nuclear expressão KIP1, SGC7901 células foram transfectadas com um vector que codifica para a forma activada de GSK-3β (GSK-3β-CA) ou um vector de controlo vazio. Citosol e as proteínas nucleares foram extraídas e Western blotting foi realizado para determinar a expressão de p27 KIP1. A transfecção de células com o plasmídeo SGC7901 GSK-3βCA resultou num aumento da p27 KIP1 na fracção nuclear (Figura 6F) sem afectar o p27 KIP1 níveis no citosol. A sobre-expressão da forma activa de GSK-3β foi confirmada utilizando a transferência de Western e in vitro
ensaios de cinase utilizando proteína Snail como substrato (Figura 6G). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a GSK-3β participa na regulação do ciclo celular através da regulação específica de p27 nuclear expressão da proteína KIP1. Figura expressão KIP1 6 p27 Nuclear modulada por GSK-3β. A & B, SGC7901 células foram tratadas com HMBA (10 mM) ao longo de um curso de tempo (A) ou com várias concentrações durante 24 h. fracções citosólicas e proteínas nucleares foram extraídas e transferência de Western foi realizada com anticorpos para p27Kip1, α-tubulina ou Topo IIβ. Acampamento; D, SGC7901 células foram pré-tratadas com (+) ou sem (-) 20 mM de LiCl (C), ou 10 | iM SB-415286 (D) durante 30 minutos seguido de tratamento com combinação de HMBA 10 mM durante 24 h. Citosol e as proteínas nucleares foram extraídas para análise de expressão de proteína p27Kip1. E, SGC7901 células foram transfectadas com siARN dirigido para a GSK-3β ou ARNsi de controlo. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram tratadas com HMBA por um adicional de 24 h. Citosol e as proteínas nucleares foram extraídas para análise de expressão de proteína p27Kip1. Knockdown da expressão de GSK-3β foi confirmada por transferência Western usando anticorpo anti-GSK-3β. F, SGC7901 células foram infectadas com Ad-HA-GSK-3βS9A ou Ad-β-gal a uma MOI de 10 pfu /célula. Após 48 h de incubação, citosol e proteínas nucleares foram extraídas e transferência Western realizada usando anti-p27Kip1, anti-HA e anticorpos anti-GSK-3, respectivamente, utilizando anticorpos anti-α-tubulina ou Topo IIβ como controlo de carga. actividades de GSK-3 foram ensaiadas pelo ensaio in vitro da quinase utilizando como substrato proteína Snail (painel inferior). sinais p27KIP1 foram quantificados densitometricamente e expressa como dobra-mudança com relação a a-tubulina ou TopIIβ.
GSK-3β regula p27Kip1binding para CDK2
HMBA aumentou expressão da proteína KIP1, atividade e CDK2 inibiu o aumento da atividade CDK4 p27 (Figura 4). Extratos de controlo ou células tratadas com HMBA foram imunoprecipitadas para investigar p27 KIP1 ligação a CDK2 e CDK4. Como demonstrado na Figura 7a, o tratamento de HMBA aumentou o nível de p27 KIP1 nos complexos imunoprecipitados com anti-CDK2, mas não em complexos imunoprecipitados com anticorpo anti-CDK4. Re-sondar os filtros com anti-CDK2 e anti-CDK4 confirmaram que os imunoprecipitados de controlo e as células tratadas com HMBA continha os mesmos níveis de CDK2 e CDK4. Portanto, HMBA parece causar um aumento selectivo na p27 KIP1 ligação a CDK2. Para analisar se a inibição de GSK-3β afecta a associação de p27 KIP1 com CDK2, SGC7901 células foram pré-tratadas com LiCl ou SB-415286 e submetido a tratamento de combinação com HMBA por 24 h; extractos de células completas foram imunoprecipitados. O tratamento com inibidores de GSK-3, LiCl (Figura 7b) ou SB-415286 (Figura 7c) bloqueou p27 KIP1 ligação a CDK2. Estes resultados sugerem que a GSK-3β é essencial para o aumento induzido por HMBA p27 KIP1 ligação a CDK2. Para confirmar o papel de GSK-3β na regulação de p27 KIP1 associação com CDK2, SGC7901 células foram transfectadas com um vector que codifica para a forma activada de GSK-3β ou Ad-β-gal. proteína de célula total foi extraído e imunoprecipitada. Como apresentado na Figura 7d, a transfecção de células SGC7901 com o vector de GSK-3β-CA resultou num aumento do nível de P27 KIP1 nos complexos imunoprecipitados com anti-CDK2 em comparação com a transfecção do plasmídeo controlo. Isto sugere que a GSK-3β não é necessário apenas para p27 mediada por HMBA KIP1 ligação a CDK2, mas também suficiente para aumentar a associação de p27 KIP1 com CDK2 em SGC7901 células. Figura 7 regulação GSK-3β de p27 Kip 1 associação com CDK2. Um, SGC7901 células foram tratadas com (+) ou sem - HMBA 10 mM durante 24 h (). Os extractos de proteína foram imunoprecipitadas com anticorpos anti-CDK4 anti-CDK2 ou. IgG normal de coelho foi usado como controlo. O p27Kip1-CDK2 ou associada a CDK4 nas imunocomplexos resultantes foi analisada por Western blotting usando o anticorpo anti-p27Kip1 com anti-CDK2 ou anticorpo -CDK4 como controlos de carga. B & C, SGC7901 células foram pré-tratadas com (+) ou sem (-) 10 LiCl mM (B) ou 10 pM SB-415286 (C) durante 30 minutos, seguido de tratamento combinado com HMBA 10 mM durante 24 h. Os extractos de proteína foram imunoprecipitadas com um anticorpo anti-CDK2. O p27Kip1 CDK2 associado nos complexos imunes resultantes foi analisada semelhante ao A., SGC7901 células foram infectadas com Ad-HA-GSK-3βCA ou vector de controlo (Ad-β-gal) a uma MOI de 10 pfu /célula D. Após 48 h de incubação, a proteína celular total foi extraído e imunoprecipitadas com anticorpo anti-CDK2 (painel superior). p27Kip1 foi analisada por Western Blotting semelhante a A. A sobreexpressão de GSK marcada com HA-3ca foi confirmada por transferência Western usando anticorpo anti-GSK-3β (painel inferior). A actividade de GSK-3β foi ensaiada in vitro por um ensaio in
quinase utilizando como substrato proteína Snail (painel inferior).
Discussão of the PI3-cinase /via de sinalização de Akt /GSK-3β tem sido implicado na regulação do crescimento celular, apoptose e diferenciação de vários tipos de células [46]. No presente estudo, a inibição de GSK-3β utilizando abordagens complementares (isto é, inibição química e constitutivamente activa Akt sobre-expressão) expressão da bomba de protões atenuada, uma medida da diferenciação gástrica semelhante, na linha celular SGC7901 derivado de tumor gástrico.
proliferação e diferenciação celular são tradicionalmente vistos como processos recíprocos, com a retirada do ciclo celular que está sendo necessário para a diferenciação terminal [40], e P27 KIP1 desempenhando um papel importante [41, 42]. deleção genética de p27 mas não p21 tem sido demonstrado que afetam a diferenciação celular gástrica, enquanto p27 forçada expressão KIP1 leva a diferenciação, sugerindo que a p27 KIP1 é mais importante do que p21 WAF1 na regulação da célula gástrica diferenciação. De acordo com estes resultados, a inibição da diferenciação de GSK-3β atenuada mediada por HMBA gástrica de células e inibição da GSK-3β bloqueado HMBA mediada por p27 nuclear expressão KIP1, enquanto que a sobre-expressão da forma activa de GSK-3β aumento nuclear p27 expressão KIP1, sugerindo um papel importante na regulação da diferenciação celular gástrica através da regulação do p27 nuclear expressão KIP1.
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