| Stomach Health > skrandžio sveikatos >  > Stomach Knowledges > tyrimai

P27Kip1, reglamentuoja glikogensintazę kinazės-3β, rezultatai HMBA sukeltos diferenciacijos žmogaus skrandžio vėžys cells

P27 Kip1, reglamentuoja glikogensintazę kinazės-3β, rezultatai HMBA sukeltos diferenciacijos žmogaus skrandžio vėžio ląstelių
Anotacija
faktai
Skrandžio vėžys yra antra labiausiai paplitusi priežastis pasaulio vėžio susijusio mirtingumo. Nors dedifferentiation prognozuoja prastą prognozę skrandžio vėžio, molekulinė mechanizmo, lemiančio dedifferentiation, kuri galėtų suteikti pagrindines įžvalgas naviko vystymąsi ir progresavimą, dar reikia išsiaiškinti. Be to, molekulinė mechanizmo, lemiančio heksametileno bisacetamide (HMBA), neseniai atrastas diferenciacijos induktorius poveikį, reikia tyrimą ir nėra pranešta tyrimai, susiję su HMBA poveikį skrandžio vėžio.
Metodai
Remiantis rezultatais FACS analizė, baltymų, dalyvaujančių ląstelių ciklo ar apoptozės koncentracija buvo nustatoma naudojant Imunoblotingo po vieno gydymo ir nuosekliųjų derinių HMBA ir LiCl. GSK-3β ir protonų siurblio buvo tiriamas Imunoblotingo po iki reguliavimo Akt ekspresiją Ad Akt infekcijos. Ištirti HMBA poveikį baltymų lokalizavimo ir GSK-3β, CDK2 ir CDK4, kinazės tyrimus, Imunoprecipitacijos ir Imunoblotingo veiklą vykdė. Be to, Šiaurės blottingu ir RNaze apsaugos tyrimai buvo atliekami, siekiant nustatyti funkcinę koncentraciją HMBA.
Rezultatai
HMBA padidėjo p27Kip1 išraišką ir sukeliama ląstelių ciklo arešto, susijusio su skrandžio epitelio ląstelių diferenciaciją. Be to, gydant skrandžio gautas ląsteles HMBA sukeltas G0 /G1 suėmimo ir up-reguliavimo protonų siurblio, iš skrandžio vėžio diferenciacijos persekiotoją. Be to, gydymas HMBA padidino išraišką ir veiklą GSK-3β į branduolį, bet ne citozolyje. HMBA sumažėjo CDK2 veiklą ir sukeliama p27Kip1 išraiška, kuri gali būti išgelbėti slopindamas GSK-3β. Be to, HMBA padidėjo p27Kip1 privalomas CDK2, ir tai buvo panaikinta GSK-3β slopinimo.
Išvados
Pateikti rezultatai čia rodo, kad GSK-3β funkcijas reguliuojant p27Kip1 surinkimas su CDK2, taip žaisti lemiamą vaidmenį G0 /G1 suėmimas susijęs su HMBA sukelta skrandžio epitelio ląstelių diferenciaciją.
Raktiniai žodžiai
HMBA skrandžio vėžys GSK-3β faktai
skrandžio vėžys yra viena iš labiausiai paplitusių vėžio formų pasaulyje ir dažnai išsivysto atsparumas chemoterapijos ir radiacijos procedūros. Todėl, kombinuotas gydymas buvo pasiūlyta geriau kovai su šia liga ir sumažinti atsparumą [1] besivystančių tikimybę. Heksametilen bisacetamide (HMBA), hibridinis Polar junginys (GAK) iš pradžių sukurta kaip diferenciacijos skatinančius agentas [2-6], sukelia skrandžio ląstelių naujo diferenciaciją [7-9].
Skrandyje, kamieninės ląstelės proliferacijos ląstelių zona kyšulio regione skrandžio liaukų diferencijuoti ir sukelti įvairių tipų ląstelių [10, 11]. Po to, kai pirmasis tumorogeniškas įvykis vyksta, toliau naviko progresavimas priklauso nuo inicijavimo renginio pobūdį ir išsivystymo pakopos ląstelėje, kad ją palaikančių ir papildomus mutacijų, kurie galėtų vykti. Pastovi proliferacija yra gyvybiškai svarbus bruožas kamieninių ląstelių, ir virškinimo trakto audinių mutacijos gali sukelti plėsti pasikeitusių kamieninių ląstelių, didinant papildomų mutacijų ir naviko progresavimas [12] tikimybę. Todėl, skiriant skrandžio vėžio kamienines ląsteles gali būti efektyviausias būdas gydyti skrandžio vėžiu. Maždaug 50% iš Vakarų gyventojų plėtoja Metaplasia, svarbus žingsnis vėžio vystymąsi [13], atkreipiamas dėmesys į kelius, kurie kontroliuoja platinimu ir tokiu būdu ląstelių diferenciaciją. Tarp šių, TGF-b, myb, WNT ir Ežys keliai yra ypač svarbūs, featuring daug dėmesio ląstelių likimas specifikacijos ir modelio formavimo metu embriogenezę ir suaugusiųjų audinių atsinaujinimą. Sudėtingų naviko slopintuvas ir akceleratoriaus signalizacijos būdus, kurie poveikis diferenciacijos moduliavimo pereinamasis /kamieninių ląstelių, išaiškinimas bus lemiamas optimizuoti terapijos gydyti skrandžio vėžiu.
Kad nesubrendusių skrandžio ląstelių atskirti, jie reikalauja likti G1 etapas ląstelės ciklo tam tikrą laikotarpį. Žinduolio ląstelės ciklo reguliuoja paeiliui įjungti ir nukenksminimo labai konservatyvios šeimos nuo ciklinų priklausoma kinazės receptorius (CDKs); progresavimo per anksti viduryje G1 yra priklausoma nuo CDK4 ir galbūt CDK6, o progresavimo per vėlai G1 ir S fazėje reikalauja aktyvavimo CDK2. Į CDKs veikla gali būti slopinamas jungiasi CDK slopinančių baltymų įskaitant CIP /Kip šeimos (p21 Waf1, P27 Kip1 ir P57 Kip2) ir INK4 šeimos (p15Ink4b, p16Ink4a, p18Ink4c ir p19Ink4d ). P27 Kip1 reglamentuoja po transkripciškai iki proteolitus degradacija. CDK2 jungiasi prie p27 Kip1 ir fosforilina jį treoninas 187 [14], ir HMBA sukelta skrandžio ląstelių diferenciacija yra susijęs su up-reguliavimo P27 Kip1 [15, 16] ir G0 /G1 arešto. Tačiau, yra keletas išsamių tyrimų dėl molekulinės mechanizmą HMBA ir nebuvo jokių pranešimų apie tyrimuose HMBA poveikį skrandžio vėžio tyrimą.
Tolesniu planinį rodiklį fosfatidil-3 kinazės /Akt (PI3-kinazės /Akt ) kelias GSK-3β reguliuoja ląstelių dauginimąsi bei diferenciaciją [17-20]. Daugėja įrodymų rodo, kad hipoakyvus GSK3β signalizacijos, kuri veikia G1 gauti indėlį iš kelių signalizacijos ir vystymosi kelius, atsiranda kartu su įvairiais žmogaus vėžio [21, 22]. GSK-3β buvo susijęs keliais biologiniais procesais, nes ji fosforilina platų substratų įskaitant keletą diferenciacijos kontrolės punktuose, įskaitant c-Myc, sraigė ir PI3K [23]. Anksčiau, slopinimo PI3-kinazės keliu buvo įrodyta, kad pagerinti HMBA medijuojamo skrandžio ląstelių diferenciaciją [8]. Šiame tyrime GSK-3β vaidmuo per skrandžio ląstelių diferenciacijos buvo tiriamas naudojant žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijos SGC7901, kuris rodo multipotent fenotipą ir atstovauja gerai charakterizuojama modelį skrandžio diferenciacijos. Rezultatai rodo, kaupiamąją vaidmenį GSK-3β į p27 Kip1 kelias per skrandžio ląstelių diferenciacijos sukeltos HMBA.
Metodai
Mobilusis kultūra
skrandžio vėžio ląstelių linijos SGC7901 buvo gauta iš ląstelių bankas Kinijos mokslų akademijos ir kultūringas, kaip aprašyta anksčiau [24]. SGC7901 ląstelės buvo užsikrėtę adenoviruso koduojančio aktyvuota formą Akt (Ad-Akt) arba adenoviruso kontrolės vektorius kodavimo beta-galaktozidazė (β-GAL), esant infekcijos gausos (MOI) 10 pfu /ląstelę. Po to, kai infekcija su vektorių vieną valandą, po to pakeitimo vidutinių ir inkubuojant dar 24 h, ląstelės buvo gydyti buvimo ar nebuvimo HMBA, ir baltymų ir RNR buvo ekstrahuojamas Vakarų ir Šiaurės blotingo metodu, atitinkamai.
Medžiagos
HMBA, TSA, SB-415.286 ir LiCl buvo įsigytas iš Sigma Chemical Company, JAV. Adenovirus vektoriai kodavimo ß-gal ir myristoylated aktyvią formą Akt (Ad-Akt) buvo nupirkta iš mobiliųjų BioLabs, JAV. Vektorius kodavimas kataliziškai aktyviai mutantas GSK3β (HA-GSK-3βCA) buvo įsigytas iš Addgene. Ne nukreipimą kontrolės siRNA ir SMARTpool pasirinkdamos GSK-3β buvo įsigytas iš Dharmacon, JAV. Visi zondai buvo ženklinamos Biotinas Atsitiktinės pirmininkas DNR Žymėjimas Kit (Pierce).
Antikūnai
Triušis Anti-Akt anti-PHOSPHO-Akt (Ser473) ir antiphospho-GSK-3β (Ser9) buvo nupirkta iš ląstelių signalizacijos , JAV. Pelės anti-GSK-3β, pelės anti-P27 Kip1, pelės anti-viršų IIb ir pelės anti-P21 Waf1 buvo įsigytas iš BD biomokslų, JAV. Pelės anti-fosfo-GSK-3 (Tyr278 /Tyr216) buvo gauta iš Upstate, JAV. Triušis kovos suskaldyta PARP antikūnų buvo įsigytas iš Abcam, JAV. Anti-protonų siurblio buvo nupirktas iš MBL INTERNATIONAL (JAV). Polikloninis Anti-CDK2 anti-CDK4 anti-α-tubulino ir anti-kaspazės-3 buvo gauti iš Santa Cruz Biotechnology (JAV).
Subfondas ląstelių baltymų gavybos ir imunoblotingu
branduolinės ir citozolio frakcijų buvo paimti naudojant NE-PER Branduolinių ir citoplazmos Gavybos reagentų komplektas (Pierce, JAV). Citozolinių baltymų (80 mg) arba branduolinės baltymų (20 mg), buvo išspręstas 10% poliakrilamido gelyje ir perkelti į PVDF membranų kaip buvo aprašyta anksčiau [25]. Filtrai buvo inkubuojamos vieną valandą kambario temperatūroje sugeriamojo tirpalo. Membranos buvo inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje, turintis pirminių antikūnų, po to sugeriamojo su krienų peroksidazės-konjuguoto antrinio antikūno vieną valandą, ir vizualizuojama naudojant ECL aptikimo sistemą.
Šiaurės blotingą ir RNazės apsaugos tyrimai (RPA)
Iš viso RNR buvo parengta naudojant TRIzol reagento (Invitrogen). Mėginiai buvo paleisti 1,2% agarozės /formaldehido geliai ir perkelti į remiamų nitroceliulioze. Membranos buvo hibridizuoj biotino paženklinti skrandžio protonų siurblio kDNR zondo. Po to, kai hibridizacijos su GAPDH zondo, pakrovimo kontrolės, Membranos buvo plaunamos ir signalai buvo aptinkami naudojant ECL aptikimo sistemą. RNaze apsaugos eksperimentai buvo atlikti naudojant RPA-III komplektą iš Ambion ir RiboQuant MultiProbe RNazės apsaugos prabavimo sistema buvo naudojama aptikti kelis konkrečius mRNR. 32P žymėto RNR zondai buvo paruošti naudojant žmogaus apoptozę HCC-2 ir hCYC-1 Šablono rinkiniai ir buvo atlikta hibridizacija pagal gamintojo protokolą.
Mobilusis ciklo analizė
skrandžio vėžio ląstelių buvo surinktos naudojant tripsino , Ląstelės buvo surinkti, plaunama du kartus ledinio PBS ir nustatyta ledinio 70% etanolio. Po to, kai du kartus plaunamas ledinio PBS, vėl suspenduojamos PBS, kuriame yra 100 U /ml RNaze A ir inkubuoti 37 ° C temperatūroje 30 min, ląstelės buvo tamsintas su PI (20 mg /ml) ir analizuojami naudojant FACScan (Becton Dickinson, San Chosė, CA, JAV), kaip buvo aprašyta anksčiau [25].
in vitro
kinazės tyrimai Viesbutis The apie CDK2, CDK4 ir GSK-3β veikla buvo matuojamas kaip aprašyta anksčiau [26, 27]. Trumpai tariant, CDK2, CDK4 arba GSK-3β buvo immunoprecipitated iš citozolinių (100 mg baltymo) arba branduolinės (25 mg baltymų) ekstraktais. Kinazės aktyvumas buvo matuojamas inkubavimą su immunoprecipitated CDK2, CDK4 arba GSK-3β 40 ml kinazės buferio su 4 mg rekombinantinio sraigė baltymo (matuoti GSK-3β-susietą kinazės aktyvumo), 5 mg Histonas H1 (matuoti CDK2-susijęs kinazę veikla) ​​arba retinoblastoma baltymų (matuoti CDK4-susijęs kinazės aktyvumo), esant 30 ° C temperatūroje 30 min. Bandiniai buvo apdorotos, kaip nurodyta ankstesnėse ataskaitose [28].
Rezultatai
slopinimas GSK-3β sumažina HMBA sukeltas ląstelių ciklo suėmimą ir SGC7901 ląstelių diferenciaciją
SGC7901 ląstelių kaupiami G0 /G1 ląstelės ciklo kontrolės punkto ir diferencijuojamas į enterocitus panašaus fenotipo po gydymo HMBA [29]. GSK-3β prisideda prie ląstelių ciklo progresavimo slopinimo diferencijuojant ląstelių [20, 30]. Todėl, ar GSK-3β vaidina svarbų vaidmenį HMBA sukeltos SGC7901 ląstelių ciklo slopinimo buvo tiriami. Kaip parodė 1a paveiksle, gydymas HMBA sukelta ląstelių kauptis tuo G0 /G1 ląstelės ciklo kontrolės punkto. Gydymas ličio chlorido (LiCl), kuris slopina GSK-3β į Mg 2 + konkurencingai [31], padidino ląstelių proporciją S fazėje. Gydymas su LiCl ir HMBA kartu atstatomi HMBA-tarpininkaujant G1 mobilųjį suimti. Panašūs rezultatai buvo gauti po gydymo SB-415286, kuris stipriai slopina GSK-3β [32] (papildomas failo 1). Šie rezultatai rodo, kad GSK-3β galėtų atlikti svarbų vaidmenį HMBA sukeltos G1 arešto. Norėdami nustatyti, ar HMBA lėmė ląstelių žūtį per 24 h gydymo laikotarpiu, baltymų buvo išgauti įvertinti, ar buvo padidintas PARP skilimo ir /arba aktyvus kaspazės-3. Kaip parodė 1b paveiksle, nebuvo jokios "Partnerystės taikos labui skilimo ir aktyvaus kaspazės-3 iki 48 h padidėjimas po HMBA gydymą. Svarbus anksti renginys terminalo diferenciacijos ląstelių yra jų pasitraukimas iš ląstelės ciklo [6]. Nuo GSK-3β dokumentais vaidinti vaidmenį ląstelių ciklo areštas [33], buvo postuluojama, kad slopinimas GSK-3β gali slopinti diferenciaciją. Todėl GSK-3β inhibitorių dėl HMBA sąlygojamą skrandžio protonų siurblio raiškos indukcijos poveikis, iš skrandžio diferenciacijos žymeklis, buvo išnagrinėti. SGC7901 ląstelės iš anksto buvo gydomi LiCl (1c pav ir 1d) arba SB-415286 (1e pav ir 1f), įvairiais koncentracijos vieną valandą, o po to yra veikiamas HMBA 24 h. LiCl slopinamas HMBA sukeltai skrandžio protonų siurblio išraiška priklausomai nuo dozės priklausomu būdu. Suderinamas su šiais rezultatais, SB-415.286 užblokuotas skrandžio protonų siurblio baltymų ir iRNR išraišką, kuri buvo sukeltas HMBA. Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad GSK-3β vaidina svarbų vaidmenį HMBA sąlygojamą skrandžio ląstelių diferenciacijos. 1 pav slopinimas GSK-3β sumažina HMBA sukeltas ląstelių ciklo suėmimą ir SGC7901 ląstelių diferenciaciją. A, SGC7901 ląstelės iš anksto buvo apdorotas arba be 10 mM LiCl 30 min, po to kombinuoto gydymo su 10 mM HMBA 24 h, po su kiekybiškai DNR kiekio nustatymas tėkmės citometrijos metodą. B SGC7901 ląstelės buvo gydomi HMBA (10 mm), 24 h arba 48 h ir buvo pasirengę Imunoblotingo analizė. K & E, SGC7901 ląstelės buvo iš anksto apdorotas su arba be 10 mM LiCl arba 10 μMSB-415286 vieną valandą, po to kombinuoto gydymo su 10 mMHMBA 24 h. protonų siurblio išraiška statusas buvo nustatytas per Imunoblotingo analizė. D & M, kad bendras RNR buvo išskirta iš ląstelių ir buvo atlikta Q-RT-PGR analizė protonų siurblio mRNR išraiška. (Duomenys yra vidurkis ± SD; * = p < 0,05, lyginant su kontrole; * = p < 0,05 vs HMBA vieni.)
Akt reguliuoja skrandžio diferenciaciją sukeltas HMBA
GSK-3β yra inaktyvuotas kai ją. fosforilinamas pasroviui Akt [34]. Todėl, ji būtų galima prognozuoti, kad aktyvavimo AKT pagal PI3-kinazės inhibitorių būtų susijęs su slopinimo GSK-3β, o vėliau slopina skrandžio ląstelių diferenciacijos. Norėdami patikrinti šią hipotezę, SGC7901 ląstelės buvo užsikrėtę Ad-Akt arba valdymo vektorių. Infekcija Ad Akt padidėjo išraiška fosforilinto Akt, Akt ir fosforilinto GSK-3β baltymų (2a pav), suderinamas su ankstesniais rezultatais, įrodančiais, kad GSK-3β veikia kaip Akt substrato. Kaip parodė 2b paveiksle, infekcija SGC7901 ląstelių su Ad Akt adenoviruso vektoriaus vien neturėjo skrandžio protonų siurblio ir iRNR išraiškos poveikį. Tačiau infekcija su Ad Akt vektoriaus lėmė slopindamas skrandžio protonų siurblio iRNR išraiškos sukeltos HMBA palyginti su HMBA ir infekcijos kontrolės (β-gal) adenovirusinė, tai rodo, kad signalizacijos per PI3-kinazės /Akt kelias reguliuoja skrandžio ląstelių diferenciacija sukeltas HMBA gydymą. 2 pav Akt reguliuoja skrandžio diferenciaciją sukeltas HMBA. A citozolyje ir branduolinių baltymai buvo paimti iš ląstelių apdoroti, kaip nurodyta ir išspręstas SDS-PAGE ir Lik su anti-fosfo-Akt, -Akt, fosfo-GSK-3β ir GSK-3β, naudojant anti-alfa-tubulino ir Topo IIβ kontroliuojant citozoliniame ir branduolinių frakcijų atitinkamai. B protonų siurblio išraiška buvo matuojamas naudojant Imunoblotingo po kurių gausa kiekybinio. (Duomenys yra vidurkis ± SD; * = p < 0,05, lyginant su kontrole; † = p < 0,05 vs vien HMBA.). C Iš viso RNR (40 mikrogramų) buvo frakcionuotas, perkeltas į nitroceliuliozės membranų ir tyrinėjo su etikete protonų siurblio kDNR; dėmės buvo basas ir reprobed su GAPDH.
Gydymas HMBA padidino išraišką ir veiklą GSK-3β branduolio
Norėdami patikrinti, ar GSK-3β lėmė HMBA gydymo GSK-3β veikla buvo nustatomas matuojant fosforilinimo rekombinantinio sraigė, gerai būdingas substrato GSK-3β [35, 36]. GSK-3β yra citozoliniame ir branduolinių skyrių ląstelių, tačiau daugiausia G1 fazėje citoplazmoje. Todėl, branduolinės ir citoplazmos baltymai buvo frakcionuotas nuo kontrolės ir HMBA gydytų ląstelių ir išnagrinėjo GSK-3β veikla. HMBA gydymas lėmė branduolinės GSK-3β (3a paveikslas) aktyvumo padidėjimu ir GSK-3β slopinimas susilpnintas HMBA tarpininkaujant G1 suėmimą, nurodant vaidmenį GSK-3β į HMBA sukelta ląstelių ciklo arešto. Ser9 fosforilinimas GSK-3β mažėja GSK-3β veiklą, o Tyr216 fosforilinimo padidina GSK-3β veiklą [37]. Analizuoti mechanizmus, sukeliančius padidėjęs GSK-3β veikla sukelia HMBA gydymo, Ser9-fosforilinarai ir Tyr216-fosforilinamos GSK-3β baltymų ekspresijos buvo nustatomas taikant Imunoblotingo. HMBA gydymas išaugo branduolinių raiškos lygius viso GSK-3β ir Tyr216-fosforilinamos GSK-3β nepaveikiant jų raiška citozolyje (3b pav.) Įdomu tai, kad HMBA gydymas padidėjo Ser9-fosforilinto GSK-3β baltymo ekspresija tiek citozolinių ir branduolinių frakcijas. Panašūs rezultatai buvo gauti po gydymo su kitais HPCs, Saha, EMBA (Papildoma failo 2). Be to, HPC, padidino GSK-3β veiklą branduolį kaip parodė in vitro
kinazės tyrimai (Papildoma failų 3). Šie rezultatai rodo, kad, HPC padidina branduolinio GSK-3β veiklą nepriklausomai nuo fosforilinimo metu Ser9. 3 pav Gydymas HMBA padidino išraišką ir veiklą GSK-3β branduolio. A, SGC7901 ląstelės buvo gydomi (+) arba be (-) 10 mMHMBA 24 h, ir nuimami tuo pabaigus gydymą. Citozolyje ir branduolinių frakcijos buvo parengta ir GSK-3β veikla buvo tiriami in vitro kinazės tyrimą naudojant sraigė baltymų, kaip substrato. Fosforilinamos Sraigė baltymų signalai buvo densitometrically kiekybiškai išreikštas kartų kaita, atsižvelgiant į neapdorotų kontrolinių grupių. B, SGC7901 ląstelės buvo gydomi 10 mM HMBA dėl įvairių kartų. Citozolinių ir branduolinė baltymų frakcijos buvo paimti ir imunoblotingu buvo atliekama naudojant antikūnus GSK-3β, PHOSPHO-GSK-3β (Ser9), PHOSPHO-GSK-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-tubulino arba "Topo IIβ.
slopinimas GSK-3β viršesnis HMBA sukeltos CDK2 slopinimas
progresavimo per G1 yra priklausoma nuo CDK2 ir CDK4 [38, 39]. Siekiant nustatyti, ar GSK-3β reguliavimas HMBA medijuojamo G1 ląstelės ciklo suėmimo įvyksta per CDK2 arba CDK4 slopinimo, SGC7901 ląstelės iš anksto buvo gydomi LiCl (4a pav) arba SB-415286 (4b paveikslas) ir tada atliekami į kombinuoto gydymo su HMBA už 24 val iki imunoprecipitaciją tyrimai būtų atliekami ląstelių lizato, naudojant anti-CDK2 arba anti-CDK4 antikūnus, atitinkamai. Be to, CDK2 arba CDK4 veikla buvo nustatoma naudojant in vitro
kinazės tyrimą. Gydymas HMBA vien slopinamas CDK2 veikla (viršuje, kairiajame skydelyje), tačiau padidėjo CDK4 veikla (viršuje, dešinėje skydelio); slopinimas GSK-3β naudojant LiCl arba SB-415286 gerokai susilpnintas HMBA slopina CDK2 veikla (apačioje). Gydymas HMBA padidino išraišką ir veiklą GSK-3β branduolio. Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad GSK-3β prisideda prie HMBA sąlygojamą G1 ląstelės ciklo arešto slopindami CDK2. 4 pav slopinimas GSK-3β viršesnis HMBA sukeltas CDK2 slopinimą. SGC7901 ląstelės iš anksto buvo gydomi (+) arba be (-) 10 mM LiCl (A) arba 10 mkm SB-415286 (B) 30 min, po to kombinuoto gydymo su 10 mM HMBA 24 h. Baltymų ekstraktai immunoprecipitated su anti-CDK2 ar anti-CDK4 antikūnų. Atstojamoji imuninės kompleksai buvo analizuojami CDK2 veiklos naudojant Histonas H1 kaip substrato (viršutiniame skydelyje) arba CDK4 veikla, kurioje naudojamos Rb kaip substrato (apatiniame skydelyje). Fosforilinamos iuose H1 ar rb baltymų signalai buvo kiekybiškai densitometrically ir išreikšta kartų kaita, atsižvelgiant į neapdorotų kontrolinių grupių.
GSK-3β reguliuoja branduolinių p27Kip1protein išraiška
toliau nagrinėti mechanizmus, sukeliančius HMBA tarpininkaujant G1 suėmimą ir CDK2 slopinimą, ląstelės ciklo reguliavimo iRNR raiška buvo analizuojami naudojant RPA tyrimų. Gydymas HMBA padidėjo P27 Kip1 iRNR išraiška, bet sumažėjo p53, p57, p15 (5a pav dešinėje), cikloniniai A ir cikloniniai D1 iRNR raiška (5a pav kairėje). Tačiau gydymas LiCl padidėjo P21 Waf1 iRNR išraišką, bet neturėjo įtakos išraiška lygius kitų genų. Panašūs rezultatai buvo gauti, kai ląstelės buvo gydomi SB-415286 (Papildoma failų 4). Šie rezultatai rodo, kad GSK-3β reguliavimas HMBA sąlygojamą ląstelių ciklo arešto neapima transkripcijos reguliavimo ląstelės ciklo susijusių genų. 5 pav iRNR raiška genų susiję su ląstelės ciklo. A, RNaze apsaugos tyrimai buvo atliekami naudojant RNR iš SGC7901 ląstelių gydomi arba 10 mM HMBA, 20 mM LiCl, arba HMBA ir LiCl derinys 24 h, hibridizuoj multi-zondo už ląstelės ciklo priklauso kinazės inhibitorių (A; hCC- 2) arba ciklinų (B; hCYC-1). B, SGC7901 ląstelės iš anksto buvo gydomi (+) arba be (-) 10 mM LiCl (dešinėje) arba 10 mkm SB-415286 (iš kairės) 30 min, po to kombinuoto gydymo su 10 mM HMBA 24 h. Sveikos ląstelės baltymų ekstraktai išspręstas SDS-PAGE, perkeltas į PVDF membranos ir immunoblotted su antikūnų p27Kip1, p21Waf1, CDK2, ar beta-aktino.
Išanalizuoti mechanizmus, sukeliančius GSK-3β susijusių ląstelės ciklo suėmimą toliau, apie p21 raiška Waf1 ir P27 Kip1 baltymų SGC7901 ląstelių gydomiems HMBA į buvimą ar nebuvimą LiCl arba SB-415286 buvo nagrinėjama. Papildymas LiCl (5b pav dešinėje) arba SB-415286 (5b pav kairėje) susilpnintas, kad p27 indukcijos Kip1 bet ne P21 Waf1 baltymo ekspresija, o tai rodo, kad p27 Kip1 dalyvauja ląstelės ciklo perėjimų reglamentuoja GSK-3β. Kai P27 Kip1 kaupiasi branduolio jis jungiasi prie CDK2, slopinant jo veikla, ir galiausiai skatina ląstelių ciklo suimti. Be to, HMBA (10 mm) padidėjo P27 Kip1 baltymų ekspresiją citozolyje ir branduolio nuo 0 iki 24 val po gydymo (6a pav.) HMBA (0-5 mm) padidėjo P27 Kip1 išraišką po 24 h citozolio frakcijų ir po 48 h HMBA (5-10 mM) padidėjo P27 Kip1 išraiška branduolinių frakcijas (6b pav.) Papildymas LiCl (6c pav) arba SB-415286 (6d paveikslas) blokavo HMBA-padidėjusį P27 Kip1 branduolinę išraišką nepaveikiant P27 Kip1 išraiška citozolyje, o tai rodo specifinį reguliavimą branduolinės P27 Kip1 išraiškos GSK-3β. Siekiant įrodyti, kad GSK-3β vaidmenį branduolinės P27 Kip1 išraiška papildomas reguliavimas, ląstelės buvo pernešta su siRNA nukreipta prieš GSK-3β (6e paveikslą). RNRi tarpininkaujant slopinimas GSK-3β buvo patvirtinta munoblotingu ir silpnos branduolinės P27 Kip1 indukcijos HMBA nepaveikiant citozolinių P27 Kip1 indukcijos. Norėdami patvirtinti GSK-3β vaidmenį branduolinės P27 reglamento Kip1 išraiška, SGC7901 ląstelės buvo pernešta su vektoriumi, koduojančio aktyvuota formą GSK-3β (GSK-3β-CA) arba tuščią valdymo vektorių. Citozolyje ir branduolinių baltymai buvo išgaunamas ir imunoblotingu buvo atliktas siekiant nustatyti, P27 Kip1 išraiška. Transfekciją SGC7901 ląstelių su GSK-3βCA plazmidžių lėmė padidėjusios p27 Kip1 branduolinės frakcija (6F paveikslas) nepaveikiant P27 Kip1 lygių citozolyje. Per išraiška aktyvios formos GSK-3β buvo patvirtinta naudojant Imunoblotingo ir in vitro
kinazės tyrimuose, naudojant sraigė baltymų kaip substrato (6G pav.) Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad GSK-3β dalyvauja ląstelės ciklo reguliavimą per konkretaus reglamentavimo branduolinio P27 Kip1 baltymo ekspresija. 6 pav atominės P27 Kip1 išraiška moduliuoti GSK-3β. A & B, SGC7901 ląstelės buvo gydomi HMBA (10 mM) per laikui bėgant (A) arba su įvairių koncentracijų, 24 h. Citozolinių ir branduolinė baltymų frakcijos buvo paimti ir imunoblotingu buvo atliktas su antikūnų p27Kip1, alfa-tubulino ar Topo IIβ. K & D, SGC7901 ląstelės iš anksto buvo gydomi (+) arba be (-) 20 mM LiCl (C), arba 10 mkm SB-415286 (D) 30 min, po to kombinuoto gydymo su 10 mM HMBA 24 h. Citozolyje ir branduolinių baltymai buvo paimti analizei p27Kip1 baltymų išraiška. E SGC7901 ląstelės buvo pernešta su siRNA nukreiptas į GSK-3β ar kontroliuoti siRNA. Dvidešimt keturias valandas po transfekciją, ląstelės buvo gydomi HMBA už papildomą 24 h. Citozolyje ir branduolinių baltymai buvo paimti analizei p27Kip1 baltymų išraiška. Nokdaunas GSK-3β išraiška buvo patvirtinta Imunoblotingo naudojant anti-GSK-3β antikūnų. F SGC7901 ląstelės buvo užsikrėtę Ad-HA-GSK-3βS9A ar Ad-beta-Gal bent iš 10 pfu /ląstelę prie. Po 48 h inkubacijos citozolyje ir branduolinė baltymas buvo paimti ir imunoblotingu atliekamas naudojant anti-p27Kip1, anti-HA, ir anti-GSK-3 antikūnus, atitinkamai naudojant anti-alfa-tubulino ar Topo IIβ kaip krovinio kontrolę. GSK-3β veikla buvo tiriami in vitro kinazės tyrimą naudojant sraigė baltymų, kaip substrato (apačioje skydelyje). p27Kip1 signalai buvo kiekybiškai densitometrically ir išreikšta kartų kaita atsižvelgiant į alfa-tubulino arba TopIIβ.
GSK-3β reguliuoja p27Kip1binding į CDK2
HMBA padidėjo P27 Kip1 baltymo ekspresija, slopino CDK2 veikla ir padidėjęs CDK4 veiklos (4 paveikslas). Ištraukos iš valdymo pulto arba HMBA gydytų ląstelių buvo immunoprecipitated ištirti P27 Kip1 privalomas CDK2 ir CDK4. Kaip parodė 7a pav, HMBA gydymas padidino p27 lygis Kip1 į kompleksų immunoprecipitated su anti-CDK2 bet ne kompleksų immunoprecipitated su anti-CDK4. Re zondavimo filtrus su anti-CDK2 ir Anti-CDK4 antikūnų patvirtino, kad immunoprecipitates iš kontrolės ir HMBA gydytų ląstelių, kurių tuos pačius lygius CDK2 ir CDK4. Todėl HMBA atrodo sukelti atrankinio padidėjimą P27 Kip1 privalomas CDK2. Išanalizuoti, ar slopinimas GSK-3β įtakos P27 asociacija Kip1 su CDK2, SGC7901 ląstelės buvo iš anksto apdorotas LiCl arba SB-415286 ir pateikti kombinuoto gydymo su HMBA 24 h; Visa vienaląsčiai ekstraktai immunoprecipitated. Gydymas GSK-3β inhibitorių, LiCl (7b pav) arba SB-415.286 (7c paveikslas) blokavo P27 Kip1 privalomą į CDK2. Šie rezultatai rodo, kad GSK-3β yra būtinas HMBA sukeltas padidėjusio P27 Kip1 jungimosi prie CDK2. Norėdami patvirtinti GSK-3β vaidmenį P27 Kip1 kartu su CDK2 reglamento SGC7901 ląstelės buvo pernešta su vektoriumi, koduojančio aktyvuota formą GSK-3β ar Ad-beta-gal. Visa ląstelių baltymas išgaunamas ir immunoprecipitated. Kaip pateikti 7d paveiksle, transfekavimas SGC7901 ląstelių su GSK-3β-CA vektoriaus lėmė aukštesnio laipsnio P27 Kip1 į kompleksų immunoprecipitated su anti-CDK2 palyginti su transfekciją valdymo plazmidės. Tai rodo, kad GSK-3β nėra būtina tik HMBA-tarpininkaujant p27 Kip1 jungiasi prie CDK2, bet taip pat pakankamas, kad būtų padidinti p27 asociaciją Kip1 su CDK2 į SGC7901 ląstelių. 7 pav GSK-3β reguliavimas P27 Kip 1 kartu su CDK2. A, SGC7901 ląstelės buvo gydomi (+) arba be (-) 10 mM HMBA 24 h. Baltymų ekstraktai immunoprecipitated su anti-CDK2 ar anti-CDK4 antikūnų. Normalus triušis IgG kiekis buvo naudojamas kaip kontrolės. CDK2-ar CDK4 susijęs p27Kip1 susidariusiame imuninių kompleksų buvo analizuojami Imunoblotingo naudojant anti-p27Kip1 antikūno su anti-CDK2 ar -CDK4 antikūnų kaip krovinio kontrolę. B & C, SGC7901 ląstelės iš anksto buvo gydomi (+) arba be (-) 10 mM LiCl (B) arba 10 mkm SB-415286 (C) 30 min, po to kombinuoto gydymo su 10 mM HMBA 24 h. Baltymų ekstraktai immunoprecipitated su anti-CDK2 antikūnų. CDK2 susijęs p27Kip1 susidariusiame imuninių kompleksų buvo analizuojami panašus į A. D SGC7901 ląstelės buvo užsikrėtusios Ad-HA-GSK-3βCA ar vektoriaus kontrolė (Ad-β-GAL), esant 10 pfu /ląstelę prie. Po 48 h inkubacijos visos ląstelės baltymų buvo išgaunamas ir immunoprecipitated su anti-CDK2 antikūnas (viršutinis meniu). p27Kip1 buvo analizuojami imunoblotingu panašus į A. raiška HA-pažymėtą GSK-3CA buvo patvirtinta Imunoblotingo naudojant anti-GSK-3β antikūnas (mažesnės skydelio). GSK-3β veikla buvo tiriami in vitro pervežimas kinazės tyrimą naudojant sraigė baltymų, kaip substrato (apačioje skydelyje).
Diskusijos
PI3-kinazės /Akt /GSK-3β signalizacijos kelias buvo susijęs reglamento ląstelių augimą, apoptozės ir diferenciacijos įvairių tipų ląstelių [46]. Šioje studijoje, slopinimas GSK-3β naudojant kitą papildantys požiūriai (ty cheminės slopinimo ir constitutively aktyvus Akt per išraiška) yra silpnos protonų siurblio išraiškos, iš skrandžio-kaip diferenciacijos priemonė, skrandžio naviko kilmės SGC7901 ląstelių linija.
ląstelių proliferaciją ir diferenciaciją tradiciškai suvokiama kaip tarpusavio procesų, su ląstelių ciklo panaikinimo yra reikalingas terminalo diferenciacijos [40], ir p27 Kip1 vaidinantiems svarbų vaidmenį [41, 42]. Genetinis išbraukta P27, bet ne P21 buvo įrodyta, turi įtakos skrandžio ląstelių diferenciaciją, kadangi priverstinio P27 Kip1 išraiška sukelia diferenciacijos, o tai rodo, kad p27 Kip1 yra svarbesnis nei p21 Waf1 į skrandžio ląstelių reglamentavimo diferenciacija. Pagal susitarimą su šiomis išvadomis, slopinimas GSK-3β susilpninto HMBA tarpininkaujant skrandžio ląstelių diferenciacijos ir slopinimo GSK-3β užblokuotas HMBA tarpininkaujant branduolinę P27 Kip1 išraiška, o per išraiška aktyvios formos GSK-3β padidino branduolinės P27 Kip1 išraiška, rodo svarbų vaidmenį skrandžio ląstelių diferenciacijos reglamentą, branduolinės P27 Kip1 ekspresijos reguliavimas.
  • skrandžio straipsnis
    •   
  • skrandžio struktūra
    •   
  • Priežiūra skrandį
    •   
  • tyrimai

    • tyrimai

    tyrimai

    Other Languages

    skrandžio sveikatos © https://www.stomachillness.com/lt