| Stomach Health > mave Sundhed >  > Stomach Knowledges > undersøgelser

P27KIP1, reguleret af glycogensyntasekinase-3β resulterer i HMBA-induceret differentiering af humane gastriske cancerceller

P27 Kip1, reguleret af glycogensyntasekinase-3β, resulterer i HMBA-induceret differentiering af humane gastriske kræftceller
Abstract
Baggrund
mavekræft er den næsthyppigste årsag til global kræft dødelighed . Selvom dedifferentiering forudsiger dårlig prognose i gastrisk cancer, den molekylære mekanisme underliggende dedifferentiering, som kan give de grundlæggende indsigt i tumorudvikling og progression, er endnu ikke belyst. Endvidere den molekylære mekanisme, der ligger virkningerne af hexamethylenbisacetamid (HMBA), en nyligt opdaget differentiering inducer, kræver undersøgelse og der er ikke rapporteret undersøgelser vedrørende virkningerne af HMBA på mavekræft. Salg Metoder
Baseret på resultaterne af FACS-analyse, blev niveauerne af proteiner involveret i cellecyklus eller apoptose bestemt under anvendelse western blotting efter enkelte behandlinger og sekventielle kombinationer af HMBA og LiCI. GSK-3β og protonpumpe blev undersøgt ved western blotting efter opregulering Akt ekspression af Ad-Akt infektion. For at undersøge effekten af ​​HMBA på protein lokalisering og aktiviteterne i GSK-3β, CDK2 og CDK4, kinase assays, immunopræcipitation og western blotting blev udført. Derudover blev northern blotting og RNase beskyttelse assays udført for at bestemme den funktionelle koncentration af HMBA.
Resultater Salg HMBA forøget p27KIP1 ekspression og induceret cellecyklusstandsning forbundet med gastrisk epitelcelledifferentiering. Desuden behandler gastriske-afledte celler med HMBA induceret G0 /G1 arrest og opregulering af protonpumpen, en markør for mavekræft differentiering. Desuden behandling med HMBA øgede ekspression og aktivitet af GSK-3β i kernen, men ikke i cytosolen. HMBA faldt CDK2-aktivitet og inducerede p27KIP1 ekspression, som kunne reddes ved inhibering af GSK-3β. Endvidere HMBA øgede p27KIP1 binding til CDK2, og dette blev afskaffet ved GSK-3β-inhibering.
Konklusioner Salg Resultaterne præsenteret heri antyder, at GSK-3p funktioner ved at regulere p27KIP1 samling med CDK2, hvorved de spiller en afgørende rolle i G0 /G1 arrest forbundet med HMBA-induceret gastrisk epitelcelledifferentiering.
Nøgleord
HMBA mavekræft GSK-3β Baggrund
mavekræft er en af ​​de mest almindelige cancertyper i verden, og ofte udvikler resistens over for kemoterapi og stråling behandlinger. Derfor kombinationsbehandling er blevet foreslået, at tackle sygdommen bedre og for at reducere sandsynligheden for at udvikle resistens [1]. Hexamethylenbisacetamid (HMBA), en hybrid polær forbindelse (HPC) oprindeligt udviklet som et differentieringsinducerende middel [2-6], forårsager gastrisk cellegenvalg differentiering [7-9].
I maven, stamceller i proliferativ celle zone af isthmus region i mavens kirtler differentiere og give anledning til forskellige celletyper [10, 11]. Når den første tumorigene begivenheden finder sted, yderligere tumorudvikling afhænger af arten af ​​den initierende begivenhed og udviklingsstadium af cellen, der opretholdt det og yderligere mutationer, der kan opstå. Konstant proliferation er et vigtigt element af stamceller, og i gastrointestinale væv vil sandsynligvis resultere i udvidelse af ændrede stamceller mutationer, øger sandsynligheden for yderligere mutationer og tumorprogression [12]. Derfor målretning gastriske cancer stamceller sandsynligvis er den mest effektive måde at behandle gastrisk cancer. Ca. 50% af den vestlige befolkning udvikler metaplasi, et vigtigt skridt i udviklingen af ​​kræft [13], opmærksom på veje, der styrer spredning og dermed celledifferentiering. Blandt disse, TGF-b, myb, Wnt og Hedgehog veje er af særlig relevans, og byder på en fremtrædende plads i celle-skæbne specifikation og dannelse mønster under embryogenese og voksent væv fornyelse. Belysning af komplekse tumorsuppressor og accelerator signalveje, hvilken effekt differentiering modulation af overgangs- /progenitorceller, være afgørende for optimering af terapeutiske midler til behandling af gastrisk cancer.
For umodne gastriske celler til at differentiere, de kræver at bo i G1-fasen af ​​cellens cyklus for en vis tidsperiode. Den mammale cellecyklus reguleres af sekventiel aktivering og inaktivering af en stærkt bevaret familie af cyclinafhængige kinaser (CDK'er); progression gennem begyndelsen til midten af ​​G1 er afhængig af CDK4 og muligvis CDK6, mens progression gennem sent G1 og S-fasen kræver aktivering af CDK2. Aktiviteterne i CDK'er kan hæmmes ved binding af CDK hæmmende proteiner herunder Cip /Kip familie (p21 WAF1, p27 Kip1 og p57 Kip2) og INK4 familie (p15Ink4b, p16INK4a, p18Ink4c og p19Ink4d ). P27 Kip1 reguleres efter transkriptionelt ved proteolytisk nedbrydning. CDK2 bindes til p27 Kip1 og phosphorylerer det på threonin 187 [14], og HMBA-induceret gastrisk celledifferentiering er forbundet med opregulering af p27 Kip1 [15, 16] og G0 /G1 anholdelse. Men der er få detaljerede undersøgelser vedrørende den molekylære mekanisme HMBA og der er ikke rapporteret om studier, der undersøger effekten af ​​HMBA på mavekræft.
Som nedstrøms mål af phosphatidylinositol-3-kinase /Akt (PI3-kinase /Akt ) vej, GSK-3β regulerer celledeling og differentiering [17-20]. Akkumulerende data viser, at hypoaktiv GSK3p signalering, der fungerer i G1 til at modtage input fra flere signalering og udviklingsmæssige veje, sker i forbindelse med menneskets forskellige kræftformer [21, 22]. GSK-3β er blevet impliceret i flere biologiske processer, fordi det phosphorylerer et bredt udvalg af substrater, herunder flere differentierings- checkpoints herunder c-Myc, snegl og PI3K [23]. Tidligere inhibering af PI3-kinase pathway blev vist at forbedre HMBA-medieret gastrisk celledifferentiering [8]. I denne undersøgelse blev rollen af ​​GSK-3β under gastrisk celledifferentiering undersøgt under anvendelse af humane gastrisk cancercellelinie SGC7901, som viser en multipotente fænotype og repræsenterer en velkarakteriseret model af gastrisk differentiering. Resultaterne antyder en bidragende rolle for GSK-3β i p27 Kip1 pathway under gastrisk celledifferentiering induceret af HMBA.
Metoder
Celledyrkning
gastrisk cancercellelinie SGC7901 blev opnået fra cellen bank i det kinesiske videnskabsakademi og dyrket som tidligere beskrevet [24]. SGC7901 celler blev inficeret med et adenovirus, der koder den aktiverede form af Akt (Ad-Akt) eller den adenovirale kontrolvektoren koder β-galactosidase (β-gal) ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10 pfu /celle. Efter infektion med vektorer i en time, efterfulgt af udskiftning af medium og inkubation i yderligere 24 timer blev celler behandlet i nærvær eller fravær af HMBA, og protein og RNA blev ekstraheret efter vestlig og Northern blotting, henholdsvis.
Materialer
HMBA, TSA, SB-415.286 og LiCI blev indkøbt fra Sigma Chemical Company, USA. Adenovirusvektorer koder β-gal og myristoylerede aktive form af Akt (Ad-Akt) blev købt hos Cell Biolabs, USA. Vektoren koder for det katalytisk aktive mutant af GSK3p (HA-GSK-3βCA) blev købt fra Addgene. Ikke-targeting kontrol siRNA og SMARTpool til målretning GSK-3β blev indkøbt fra Dharmacon, USA. Alle prober blev mærket med et biotin Random Prime DNA Labeling Kit (Pierce).
Antistoffer Salg Rabbit anti-Akt, anti-phospho-Akt (Ser473) og antiphospho-GSK-3β (Ser9) blev indkøbt fra Cell Signaling , USA. Mouse anti-GSK-3β, mus anti-p27 Kip1, mus anti-Top IIb og mus anti-p21 WAF1 blev købt fra BD Biosciences, USA. Muse anti-phospho-GSK-3 (Tyr278 /Tyr216) blev opnået fra Upstate, USA. Kanin-anti-spaltet PARP-antistof blev indkøbt fra Abcam, USA. Anti-protonpumpe blev købt fra MBL International (USA). Polyklonalt anti-CDK2, anti-CDK4, anti-α-tubulin og anti-caspase-3 blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (USA).
Sub-cellulært protein ekstraktion og western blotting
kerner og cytosol fraktioner blev ekstraheret ved hjælp af en NE-PER nukleare og Cytoplasmiske Ekstraktion reagenser kit (Pierce, USA). Cytosoliske protein (80 mg) eller nuklear protein (20 mg) blev opløst på en 10% polyacrylamidgel og overført til PVDF-membraner som tidligere beskrevet [25]. Filtrene blev inkuberet i en time ved stuetemperatur i blotting opløsning. Membraner blev inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer, efterfulgt af blotting med et peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof i en time, og visualiseret under anvendelse af et ECL detektionssystem.
Northern blotting og RNase beskyttelse assays (RPA)
Total RNA blev fremstillet under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen). Prøver blev kørt på 1,2% agarose /formaldehyd-geler og overført til understøttet nitrocellulose. Membraner blev hybridiseret med et biotinmærket gastrisk protonpumpe cDNA-probe. Efter hybridisering med GAPDH probe, belastningskontrol blev membraner vasket og signaler blev påvist under anvendelse af et ECL detektionssystem. RNase beskyttelseseksperimenter blev udført ved anvendelse af RPA-III kit fra Ambion og RiboQuant Multiprobe RNase Protection Assay System blev anvendt til at detektere flere specifikke mRNA'er. 32P-mærket antisense RNA-prober blev fremstillet under anvendelse af human Apoptosis HCC-2 og hCYC-1 Template sæt og hybridiseringer blev udført ifølge producentens protokol.
Cellecyklusanalyse
mavekræft celler blev høstet under anvendelse af trypsin . Celler blev opsamlet, vasket to gange med iskold PBS og fikseret i iskold 70% ethanol. Efter at være blevet vasket to gange med iskold PBS, resuspenderet i PBS indeholdende 100 U /ml RNase A og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter blev celler farvet med PI (20 mg /ml) og analyseret under anvendelse af FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), som tidligere beskrevet [25]. Salg In vitro Salg kinaseassays Salg aktiviteter CDK2, CDK4 og GSK-3β blev målt som beskrevet tidligere [26, 27]. Kort fortalt blev CDK2, CDK4 eller GSK-3β immunopræcipiteret fra cytosolisk (100 mg protein) eller nuklear (25 mg protein) ekstrakter. Kinase aktivitet blev målt ved inkubering immunopræcipiteret CDK2, CDK4 eller GSK-3β i 40 ml kinasepuffer med 4 mg rekombinant sneglen protein (til måling GSK-3β-associeret kinaseaktivitet), 5 mg histon H1 (til måling CDK2-associeret kinase aktivitet) eller retinoblastom proteinet (til måling CDK4-associeret kinaseaktivitet) ved 30 ° C i 30 minutter. Prøverne blev behandlet som beskrevet i tidligere rapporter [28].
Resultater
Hæmning af GSK-3β dæmper HMBA-induceret cellecyklusstop og SGC7901 celledifferentiering
SGC7901 celler akkumuleret ved G0 /G1 cellecyklus checkpoint og differentieret i en enterocytterne-lignende fænotype efter behandling med HMBA [29]. GSK-3β bidrager til inhibering af cellecyklusprogression i differentierende celler [20, 30]. Derfor, om GSK-3β spiller en rolle i HMBA-induceret SGC7901 cellecyklus inhibering blev undersøgt. Som vist i figur 1a, at behandling med HMBA inducerede celler akkumuleres ved G0 /G1 cellecyklus checkpoint. Behandling med lithiumchlorid (LiCl), som inhiberer GSK-3β i en Mg 2+ kompetitiv måde [31], øget andelen af ​​celler i S-fasen. Behandling med en kombination af LiCl og HMBA omvendt HMBA-medieret G1 celle anholdelse. Lignende resultater blev opnået efter behandling med SB-415.286, en potent inhibitor af GSK-3β [32] (Supplerende fil 1). Disse resultater antyder, at GSK-3β kan spille en rolle i HMBA-induceret G1 arrest. For at bestemme om HMBA resulterede i celledød i løbet af behandlingsperioden 24 timer, blev protein udvundet at vurdere, om der blev øget PARP spaltning og /eller aktiv caspase-3. Som vist i figur 1b, var der ingen stigning i PARP-spaltning og aktiv caspase-3, indtil 48 timer efter HMBA behandling. En vigtig tidlig begivenhed i terminal differentiering af celler er deres tilbagetrækning fra cellecyklus [6]. Da GSK-3β er dokumenteret at spille en rolle i cellecyklusstop [33], blev det postuleret, at inhibering af GSK-3β kan inhibere differentiering. Derfor virkningerne af GSK-3p inhibitorer på induktionen af ​​HMBA-medieret gastrisk protonpumpe-ekspression, en markør for gastrisk differentiering, blev undersøgt. SGC7901 celler blev forbehandlet med LiCI (figur 1c og 1d) eller SB-415.286 (figur 1e og 1f) ved forskellige koncentrationer i en time og derefter behandlet med HMBA i 24 timer. LiCl inhiberede HMBA-induceret gastrisk protonpumpe ekspression i en dosis-afhængig måde. I overensstemmelse med disse resultater, SB-415.286 blokeret gastrisk protonpumpe-protein og mRNA-ekspression, der blev induceret ved HMBA. Taget sammen indikerer disse resultater, at GSK-3β spiller en vigtig rolle i HMBA-medieret gastrisk celledifferentiering. Figur 1 Inhibering af GSK-3β dæmper HMBA-induceret cellecyklusstandsning og SGC7901 celledifferentiering. A, SGC7901 celler blev forbehandlet med eller uden 10 mM LiCI i 30 minutter efterfulgt af kombinationsbehandling med 10 mM HMBA i 24 timer, efterfulgt med kvantitativ bestemmelse af DNA-indhold ved flowcytometri. B, blev SGC7901 celler behandlet med HMBA (10 mM) i 24 timer eller 48 timer og blev fremstillet til western blotting-analyse. C &E, SGC7901 celler blev forbehandlet med eller uden 10 mM LiCI eller 10 μMSB-415.286 i en time efterfulgt af kombinationsbehandling med 10 mMHMBA i 24 timer. protonpumpe udtryk status blev bestemt via western blotting analyse. D &F, totalt RNA blev ekstraheret fra celler og Q-RT-PCR-analyse for protonpumpe-mRNA-ekspression blev udført. (Data repræsenterer middelværdi ± SD; * = p < 0,05 over for kontrol; * = p < 0,05 over HMBA alene.)
Akt regulerer gastrisk differentiering induceret af HMBA
GSK-3β inaktiveres, når det. phosphoryleres nedstrøms Akt [34]. Derfor ville det forudsiges, at aktivering af Akt af PI3-kinase ville være forbundet med inhibering af GSK-3β og efterfølgende inhibering af gastrisk celledifferentiering. For at teste denne hypotese blev SGC7901 celler inficeret med Ad-Akt eller en kontrolvektor. Infektion med Ad-Akt forøget ekspression af phosphoryleret Akt, Akt og phosphoryleret GSK-3β-protein (figur 2a), i overensstemmelse med tidligere resultater, som viser, at GSK-3p virker som et substrat af Akt. Som vist i figur 2b, infektion af SGC7901 celler med Ad-Akt adenovirusvektor alene havde ingen virkning på gastrisk protonpumpe og mRNA-ekspression. Imidlertid infektion med Ad-Akt vektor resulterede i inhibering af gastrisk protonpumpe-mRNA-ekspression induceret af HMBA sammenlignet med HMBA og infektion af kontrollen (β-gal) adenovirus, hvilket antyder, at signalering via PI3-kinase /Akt pathway regulerer gastrisk celle differentiering induceret af HMBA behandling. Figur 2 Akt regulerer gastrisk differentiering induceret af HMBA. A, Cytosol og nukleare proteiner blev ekstraheret fra celler behandlet som angivet og opløst på SDS-PAGE og blottet med anti-phospho-Akt, -Akt, phospho-GSK-3β, og GSK-3β, anvendelse af anti-α-tubulin og Topo IIβ som kontrol af den cytosoliske og nukleare fraktioner henholdsvis. B, protonpumpe-ekspression blev målt ved anvendelse western blotting efterfulgt med overflod kvantificering. (Data repræsenterer middelværdi ± SD; * = p < 0,05 over for kontrol; † = p < 0,05 over HMBA alene.). C, Total RNA (40 ug) blev fraktioneret, overført til nitrocellulosemembraner og probet med et mærket protonpumpe-cDNA; blots blev strippet og testet igen med GAPDH.
Behandling med HMBA øgede ekspression og aktivitet af GSK-3β i kernen
at teste om GSK-3β var påvirket af HMBA behandling blev GSK-3β aktivitet bestemmes ved måling af phosphorylering af rekombinant Snail, en velkarakteriseret substrat af GSK-3β [35, 36]. GSK-3β er beliggende i de cytosoliske og nukleare rum i celler, men overvejende i cytoplasmaet i G1-fasen. Derfor nukleare og cytoplasmatiske proteiner fraktioneret fra kontrol og HMBA-behandlede celler og undersøgt for GSK-3β aktivitet. HMBA behandling resulterede i en stigning i aktiviteten af ​​nuklear GSK-3β (figur 3a), og GSK-3β-inhibering svækkede HMBA-medieret G1 arrest, hvilket indikerer en rolle for GSK-3β i HMBA-induceret cellecyklusstandsning. Ser9 phosphorylering af GSK-3β falder GSK-3β aktivitet, hvorimod Tyr216 fosforylering øger GSK-3β aktivitet [37]. For at analysere mekanismerne bag øget GSK-3β-aktivitet forårsaget af HMBA behandling, Ser9-phosphoryleret og Tyr216-phosphoryleret GSK-3β-proteinekspression blev bestemt under anvendelse western blotting. HMBA behandling steg nukleare ekspressionsniveauer af total GSK-3β og Tyr216-phosphoryleret GSK-3β uden at påvirke deres ekspression i cytosolen (figur 3b). Interessant HMBA behandling steg Ser9-phosphoryleret GSK-3β proteinekspression i både den cytosoliske og nukleare fraktioner. Lignende resultater blev opnået efter behandling med andre HPCs, SAHA og EMBA (Ekstra fil 2). Desuden HPC øget aktiviteten af ​​GSK-3β i kernen som det fremgår af in vitro
kinase assays (Ekstra fil 3). Disse resultater antyder, at HPC øger nuklear GSK-3β-aktivitet uanset phosphorylering på Ser9. Figur 3 Behandling med HMBA øgede ekspression og aktivitet af GSK-3β i kernen. A blev SGC7901 celler behandlet med (+) eller uden (-) 10 mMHMBA i 24 timer og høstes ved slutningen af ​​behandlingen. Cytosol og nukleare fraktioner blev fremstillet og GSK-3β-aktivitet blev analyseret ved in vitro kinase-assay ved anvendelse Snail protein som substrat. Phosphoryleret Snail protein signaler blev densitometrisk kvantificeret og udtrykt som fold-ændring i forhold til ubehandlede kontrolgrupper. B, SGC7901 celler blev behandlet med 10 mM HMBA i forskellige tidsrum. Cytosoliske og nukleare proteinfraktioner blev ekstraheret og western blotting blev udført under anvendelse af antistoffer mod GSK-3β, phospho-GSK-3β (Ser9), phospho-GSK-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-tubulin eller Topo IIβ.
inhibering af GSK-3β tilsidesætter HMBA-induceret CDK2 inhibering
Progression gennem G1 er afhængig af CDK2 og CDK4 [38, 39]. For at bestemme om GSK-3β regulering af HMBA-medieret G1 cellecyklusstandsnings sker via CDK2 eller CDK4 inhibering, SGC7901 celler blev forbehandlet med LiCI (figur 4a) eller SB-415.286 (figur 4b) og derefter underkastet kombinationsbehandling med HMBA i 24 timer før immunopræcipitationsanalyser blev udført på cellelysaterne under anvendelse af anti-CDK2 eller anti-CDK4 antistoffer hhv. Desuden blev CDK2 eller CDK4-aktivitet bestemt ved anvendelse af en in vitro
kinaseassay. Behandling med HMBA alene inhiberede CDK2-aktivitet (top, venstre panel), men steg CDK4 aktivitet (top, højre panel); inhibering af GSK-3β under anvendelse LiCl eller SB-415.286 signifikant svækket HMBA inhibering af CDK2-aktivitet (nederst). Behandling med HMBA øgede ekspression og aktivitet af GSK-3β i kernen. Taget sammen antyder disse resultater, at GSK-3β bidrager til HMBA-medieret G1 cellecyklusstandsning ved inhibering af CDK2. Figur 4 Inhibering af GSK-3β tilsidesætter HMBA-induceret CDK2 inhibering. SGC7901 celler blev forbehandlet med (+) eller uden (-) 10 mM LiCI (A) eller 10 pM SB-415.286 (B) i 30 minutter efterfulgt af kombinationsbehandling med 10 mM HMBA i 24 timer. Proteinekstrakter blev immunfældet med anti-CDK2 eller anti-CDK4 antistoffer. Resulterende immunkomplekser blev analyseret for CDK2-aktivitet ved anvendelse histon H1 som substrat (øvre panel) eller til CDK4-aktivitet ved anvendelse Rb som substrat (nederste panel). Phosphoryleret histon H1 eller Rb protein signaler blev kvantificeret densitometrisk og udtrykt som fold-ændring i forhold til ubehandlede kontrolgrupper.
GSK-3β regulerer nukleare p27Kip1protein udtryk
at undersøge mekanismerne bag HMBA medieret G1 anholdelse og CDK2 hæmning yderligere, cellecyklus-regulerende mRNA-ekspression blev analyseret under anvendelse RPA assays. Behandling med HMBA øget P27 Kip1 mRNA-ekspression, men faldt p53, p57, P15 (figur 5A til højre), cyclin A og cyclin D1-mRNA-ekspression (figur 5A til venstre). Men behandling med LiCl øget p21 WAF1 mRNA-ekspression, men påvirkede ikke ekspressionsniveauerne af andre gener. Lignende resultater blev opnået, når celler blev behandlet med SB-415.286 (Supplerende fil 4). Disse resultater antyder, at GSK-3β regulering af HMBA-medieret cellecyklusstandsning ikke involverer den transkriptionelle regulering af cellecyklus-relaterede gener. Figur 5 mRNA-ekspression af gener i forbindelse med cellecyklus. A, RNase beskyttelse assays blev udført under anvendelse af RNA fra SGC7901 celler behandlet med enten 10 mM HMBA, 20 mM LiCI, eller en kombination af HMBA og LiCI i 24 timer, hybridiseret med multi-prober for cellecyklusafhængig kinaseinhibitorer (A; hCC- 2) eller cycliner (B; hCYC-1). B, SGC7901 celler blev forbehandlet med (+) eller uden (-) 10 mM LiCI (højre) eller 10 uM SB-415.286 (venstre) i 30 minutter efterfulgt af kombinationsbehandling med 10 mM HMBA i 24 timer. Hele celle proteinekstrakter blev opløst på SDS-PAGE, overført til PVDF-membraner, og immunblottet med antistoffer mod p27KIP1, p21Waf1, CDK2, eller β-actin.
At analysere mekanismerne bag GSK-3β-associeret cellecyklusstandsning yderligere, ekspressionen af ​​p21 WAF1 og p27 Kip1 proteiner i SGC7901 celler behandlet med HMBA i nærvær eller fravær af LiCl eller SB-415.286 blev undersøgt. Tilsætning af LiCI (figur 5B højre) eller SB-415.286 (figur 5B venstre) svækkede induktionen af ​​p27 Kip1 men ikke p21 WAF1 proteinekspression, hvilket antyder, at p27 Kip1 Deltager i cellecyklus overgange reguleres af GSK-3β. Når p27 Kip1 akkumuleres i kernen det binder til CDK2, hæmme dets aktivitet, og i sidste ende inducerer cellecyklusstop. Endvidere HMBA (10 mM) øgede p27 Kip1 proteinekspression i cytosolen og kernen fra 0 til 24 timer efter behandling (figur 6a). HMBA (0-5 mM) øgede p27 Kip1 udtryk efter 24 timer i cytosoliske fraktioner og efter 48 h HMBA (5-10 mM) øgede p27 Kip1 udtryk i nukleare fraktioner (figur 6b). Tilsætning af LiCl (figur 6c) eller SB-415.286 (figur 6d) blokerede HMBA-øget p27 Kip1 nukleare udtryk uden at påvirke p27 Kip1 udtryk i cytosolen, hvilket tyder på specifik regulering af nuklear p27 Kip1 udtryk ved GSK-3β. For at demonstrere rollen som GSK-3β i reguleringen af ​​nuklear p27 Kip1 udtryk yderligere blev cellerne transficeret med siRNA rettet mod GSK-3β (figur 6e). RNAi-medieret undertrykkelse af GSK-3β blev bekræftet ved immunoblotting og svækkede nukleare p27 Kip1 induktion ved HMBA uden at påvirke cytosolisk p27 Kip1 induktion. For at bekræfte den rolle af GSK-3β i reguleringen af ​​nuklear p27 Kip1 ekspression, SGC7901 celler blev transficeret med en vektor, der koder for den aktiverede form af GSK-3β (GSK-3β-CA) eller en tom vektor kontrol. Cytosol og kerneproteiner blev ekstraheret og western blotting blev udført for at bestemme p27 Kip1 ekspression. Transfektion af SGC7901 celler med GSK-3βCA plasmid resulterede i øget p27 Kip1 på det nukleare fraktion (figur 6F) uden at påvirke p27 Kip1 niveauer i cytosolen. Over-ekspression af den aktive form af GSK-3β blev bekræftet under anvendelse western blotting og in vitro
kinase assays under anvendelse af sneglen protein som substrat (figur 6G). Tilsammen indikerer disse resultater, at GSK-3β deltager i reguleringen af ​​cellecyklus gennem den specifikke regulering af nuklear p27 Kip1 proteinekspression. Figur 6 Nuklear p27 Kip1 udtryk moduleres af GSK-3β. A & B, blev SGC7901 celler behandlet med HMBA (10 mM) over et tidsforløb (A) eller med forskellige koncentrationer i 24 timer. Cytosoliske og nukleare proteinfraktioner blev ekstraheret og western blotting blev udført med antistoffer mod p27KIP1, α-tubulin eller Topo IIβ. Lejr; D, SGC7901 celler blev forbehandlet med (+) eller uden (-) 20 mM LiCI (C) eller 10 pM SB-415.286 (D) i 30 minutter efterfulgt af kombinationsbehandling med 10 mM HMBA i 24 timer. Cytosol og nukleare proteiner blev ekstraheret til analyse af p27KIP1 proteinekspression. E, SGC7901 celler blev transficeret med siRNA rettet mod GSK-3β eller kontrol siRNA. Fireogtyve timer efter transfektion blev celler behandlet med HMBA i yderligere 24 timer. Cytosol og nukleare proteiner blev ekstraheret til analyse af p27KIP1 proteinekspression. Knockdown af GSK-3β-ekspression blev bekræftet ved Western blotting ved anvendelse af anti-GSK-3β-antistof. F, SGC7901 celler blev inficeret med Ad-HA-GSK-3βS9A eller Ad-β-gal ved en MOI på 10 pfu /celle. Efter 48 timers inkubation blev cytosol og kerneprotein ekstraheret og western blotting udført under anvendelse af anti-p27KIP1, anti-HA, og anti-GSK-3-antistoffer, henholdsvis anvendelse af anti-α-tubulin eller Topo IIβ som ladningskontrol. GSK-3p aktiviteter blev analyseret ved in vitro kinase-assay ved anvendelse Snail protein som substrat (nederste panel). p27KIP1 signaler blev kvantificeret densitometrisk og udtrykt som fold-ændring i forhold til a-tubulin eller TopIIβ.
GSK-3β regulerer p27Kip1binding til CDK2
HMBA forøget p27 Kip1 proteinekspression, inhiberet CDK2-aktivitet og forøget CDK4 aktivitet (figur 4). Uddrag af kontrol eller HMBA-behandlede celler blev immunfældet at undersøge p27 Kip1 binding til CDK2 og CDK4. Som vist i figur 7a, HMBA behandling steg niveauet af p27 Kip1 i komplekserne immunpræcipiteret med anti-CDK2, men ikke i komplekser immunpræcipiteret med anti-CDK4. Re-probing af filtrene med anti-CDK2 og anti-CDK4 antistoffer bekræftet, at immunopræcipitaterne fra kontrol- og HMBA-behandlede celler indeholdt de samme niveauer af CDK2 og CDK4. Derfor HMBA synes at forårsage en selektiv stigning i p27 Kip1 binding til CDK2. At analysere, om inhibering af GSK-3β påvirker sammenslutning af p27 Kip1 med CDK2, SGC7901 celler blev forbehandlet med LiCl eller SB-415.286 og underkastet kombinationsbehandling med HMBA i 24 timer; helcelleekstrakterne blev immunpræcipiteret. Behandling med GSK-3p-hæmmere, LiCl (figur 7b) eller SB-415.286 (figur 7c) blokerede p27 Kip1 binding til CDK2. Disse resultater antyder, at GSK-3β er afgørende for HMBA-induceret forøget p27 Kip1 binding til CDK2. For at bekræfte den rolle af GSK-3β i reguleringen af ​​p27 Kip1 association med CDK2 blev SGC7901 celler transficeret med en vektor, der koder den aktiverede form af GSK-3β eller Ad-β-gal. Whole-celleprotein blev ekstraheret og immunpræcipiteret. Som beskrevet i figur 7d, transfektion af SGC7901 celler med GSK-3β-CA vektor resulterede i et øget niveau af p27 Kip1 i komplekserne immunpræcipiteret med anti-CDK2 sammenlignet med transfektion af kontrol plasmid. Dette antyder, at GSK-3β er ikke kun nødvendig for HMBA-medieret p27 Kip1 binding til CDK2, men også tilstrækkelig til at øge sammenslutning af P27 Kip1 med CDK2 i SGC7901 celler. Figur 7 GSK-3β regulering af p27 Kip en forening med CDK2. A blev SGC7901 celler behandlet med (+) eller uden (-) 10 mM HMBA i 24 timer. Proteinekstrakter blev immunfældet med anti-CDK2 eller anti-CDK4 antistoffer. Normalt kanin IgG blev anvendt som kontrol. Den CDK2-eller CDK4-associeret p27KIP1 i de resulterende immunkomplekser blev analyseret ved western blotting under anvendelse af anti-p27KIP1 antistof med anti-CDK2 eller -CDK4 antistof som indlæsning kontroller. B &C, SGC7901 celler blev forbehandlet med (+) eller uden (-) 10 mM LiCI (B) eller 10 pM SB-415.286 (C) i 30 minutter efterfulgt af kombinationsbehandling med 10 mM HMBA i 24 timer. Proteinekstrakter blev immunpræcipiteret med et anti-CDK2 antistof. Den CDK2 associeret p27KIP1 i de resulterende immunkomplekser blev analyseret ligner A. D, blev SGC7901 celler inficeret med Ad-HA-GSK-3βCA eller vektorkontrol (Ad-β-gal) ved en MOI på 10 pfu /celle. Efter 48 timers inkubation blev hele celleprotein ekstraheret og immunpræcipiteret med anti-CDK2-antistof (øverste panel). p27KIP1 blev analyseret ved western blotting ligner A. Overekspression af HA-mærket GSK-3ca blev bekræftet ved Western-blotting ved anvendelse af anti-GSK-3β-antistof (nederste panel). GSK-3β-aktivitet blev analyseret ved et in vitro
kinaseassay hjælp Snail protein som substrat (nederste panel).
Diskussion
PI3-kinase /Akt /GSK-3β-signalvejen er blevet impliceret i reguleringen af cellevækst, apoptose og differentiering af forskellige celletyper [46]. I den foreliggende undersøgelse, inhibering af GSK-3β under anvendelse af komplementære metoder (dvs. kemisk hæmning og konstitutivt aktive Akt overekspression) svækket protonpumpe-ekspression, et mål for gastrisk-lignende differentiering, i det gastriske tumorer udledte SGC7901 cellelinie.
Cell proliferation og differentiering er traditionelt opfattet som gensidige processer, med celle-cyklus tilbagetrækning der kræves for terminal differentiering [40], og P27 Kip1 spiller en vigtig rolle [41, 42]. Genetisk sletning af p27, men ikke p21 har vist sig at påvirke gastrisk celledifferentiering, mens tvungen p27 Kip1 udtryk fører til differentiering, tyder på, at p27 Kip1 er vigtigere end p21 WAF1 i reguleringen af ​​gastrisk celle differentiering. Efter aftale med disse resultater, inhibering af GSK-3β svækket HMBA-medieret gastrisk celledifferentiering og hæmning af GSK-3β blokeret HMBA-medieret nuklear p27 Kip1 ekspression, mens overekspression af den aktive form af GSK-3β øget nuklear p27 Kip1 udtryk, hvilket tyder på en vigtig rolle i reguleringen af ​​gastrisk celledifferentiering gennem regulering af nuklear p27 Kip1 udtryk.
  • mave artikel
    •   
  • Gastric struktur
    •   
  • Pleje af mave
    •   
  • undersøgelser

    • undersøgelser

    undersøgelser

    Other Languages

    mave Sundhed © https://www.stomachillness.com/da