| Stomach Health > elodec Zdravje >  > Stomach Knowledges > raziskave

P27Kip1, ureja glikogen sintazo kinazo-3p, rezultati v HMBA-inducirane diferenciacijo človeške želodčne raka cells

P27 Kip1, ureja glikogen sintazo kinazo-3p, rezultati v HMBA-inducirane diferenciacijo človeških želodčne rakavih celic
Povzetek
Ozadje
raka želodca je drugi najpogostejši vzrok za globalno umrljivosti, povezane z rakom. Čeprav dedifferentiation napoveduje slabo prognozo pri raku želodca, molekularni mehanizem osnovni dedifferentiation, ki bi lahko zagotovil temeljne vpogled v razvoj in napredovanje tumorjev, še ni pojasnjen. Poleg tega je molekularni mehanizem, ki je podlaga učinke heksametilenovim bisacetamide (HMBA), ki je nedavno odkrito diferenciacija induktor, zahteva preiskavo in ni poročali študije o vplivu HMBA na raka želodca.
Metode primerjavo na podlagi rezultatov FACS analizi so bile ravni proteinov, ki sodelujejo v celičnem ciklu ali apoptoze določi z uporabo western blot po posameznih zdravljenja in zaporedne kombinacije HMBA in LiCl. GSK-3β in protonske črpalke so bile preiskane z western blot po up-regulacijo Akt izražanje Ad-Akt okužbe. Da bi raziskali učinke HMBA na proteinov lokalizacijo in aktivnosti GSK-3p, CDK2 in CDK4 kinaze testih, imuno in zahodni blot niso bile izvedene. Poleg tega so bili severni odtisi in testi za zaščito RNaze, ki se izvajajo za določitev funkcionalnega koncentracijo HMBA.
Rezultati
HMBA povečala p27Kip1 izražanja in povzročeno aretaciji celičnega ciklusa, povezanega z želodčno diferenciacijo epitelijskega. Poleg tega, zdravljenje celic, želodčne pridobljeni z HMBA inducirane G0 /G1 aretaciji in up-regulacije protonske črpalke, marker želodčne diferenciacije raka. Poleg tega je zdravljenje z HMBA povečala ekspresijo in aktivnost GSK-3p v jedru ne pa citosol. HMBA zmanjšala CDK2 dejavnost in povzročeno p27Kip1 izraz, ki bi jih lahko rešili z zaviranjem GSK-3P. Poleg tega HMBA povečane p27Kip1 veže na CDK2, in to je bila odpravljena z zaviranjem GSK-3P.
Sklepi
rezultatov, predstavljenih v tem dokumentu, kažejo, da GSK-3P funkcij, ki jih ureja p27Kip1 montažo z CDK2, s tem igrajo ključno vlogo pri G0 /G1 prijetje povezano s HMBA povzroča želodčne diferenciacije epitelijskega.
Ključne besede
HMBA rak želodca GSK-3β Ozadje
raka želodca, je eden od najpogostejših rakavih obolenj na svetu in se pogosto razvije odpornost na kemoterapijo in sevanje zdravljenja. Zato je bilo predlagano, kombinirana terapija za boljše reševanje bolezni in zmanjša verjetnost razvoja odpornosti [1]. Heksametilen bisacetamide (HMBA), hibridni polarna spojina (HPC), prvotno razvit kot sredstvo za razlikovanje indukcijo [2-6], povzroči želodčne celice ponovno razlikovanje [7-9].
V želodcu, matične celice v proliferacije celic cona isthmus območju želodca žlez razlikovati in privede do različnih tipov celic [10, 11]. Po prvi tumorogen dogodek poteka nadaljnje napredovanje tumorja je odvisna od narave dogodka začetnega in razvojni fazi celico, ki jo je utrpela in dodatnih mutacij, ki se lahko pojavijo. Constant orožja je bistven element matičnih celic, in v prebavilih tkivih so mutacije bi lahko povzročilo širitev spremenjenih matičnih celic, kar povečuje verjetnost dodatnih mutacij in napredovanja tumorja [12]. Zato ciljanje želodčni rak matičnih celic je verjetno najbolj učinkovit način za zdravljenje raka želodca. Približno 50% zahodne populacije razvija metaplazija, ključni korak v raka razvoj [13], ki opozori na poti, ki nadzorujejo širjenje in s tem diferenciacijo celic. Med njimi je TGF-b, myb, NT in Hedgehog poti so posebnega pomena, ki se ponaša vidno v specifikaciji celice usoda in oblikovanje vzorcev med embriogeneze in odraslih obnovo tkiv. Pojasnitev kompleksne zaviralnih in pospeševalnika signalnih poti, ki diferenciacije učinek modulacijo prehodno /matičnih celic, bo ključnega pomena za optimizacijo terapij za zdravljenje raka na želodcu.
Da bi nezrele želodčnih celic za razlikovanje, ki jih potrebujejo, da ostanejo v G1 fazo celičnega cikla za določeno časovno obdobje. Cikel sesalskih celic ureja zaporedno aktivacijo in deaktivacijo visoko ohranjenih družine ciklin odvisnih kinaz (CDK); napredovanje skozi zgodaj do sredine G1 je odvisna od CDK4 in morda CDK6, medtem ko napredovanje zaradi zamude pri G1 in fazi S zahteva aktiviranje CDK2. Dejavnosti CDK lahko zavira vezavo CDK inhibitornih proteinov, vključno z družino CIP /Kip (p21 Waf1, P27 Kip1 in p57 Kip2) in INK4 družine (p15Ink4b, p16Ink4a, p18Ink4c in p19Ink4d ). P27 Kip1 je urejen po transkripcijsko s proteolitično razgradnjo. CDK2 veže na p27 Kip1 in fosforilira na treonin 187 [14], in HMBA inducirano razlikovanje želodca celica je povezana z up-regulacijo p27 Kip1 [15, 16] in G0 /G1 prijetje. Vendar pa obstaja nekaj podrobne študije o molekularni mehanizem HMBA in ni bilo poročali proučevali vpliv HMBA na raka želodca.
Kot cilj nadaljnjega v fosfatidilinozitol 3 kinaze /Akt (Pl 3-kinaze /Akt ) pot, GSK-3β uravnava celično proliferacijo in diferenciacijo [17-20]. Kopičijo dokazi kažejo, da hipoaktivnega GSK3P signalizacijo, ki deluje v G1 na odzive več signalizacije in razvojnih poti, se pojavlja v povezavi z različnimi človeškimi raka [21, 22]. GSK-3β je bil vpleten v več bioloških procesov, saj je fosforilira širok spekter substratov vključno z več diferenciacije kontrolnih točk, vključno s c-myc, polž in PI3K [23]. Prej, se je izkazalo inhibicijo PI3-kinaze na povečanje HMBA posredovanega diferenciacijo želodčne celic [8]. V tej študiji je bila vloga GSK-3p med diferenciacijo želodca celično raziskovali uporabo človeškega želodčnega raka celične linije SGC7901, ki prikazuje na multipotentne fenotip in predstavlja dobro označen-model želodca diferenciacije. Rezultati kažejo prispevki vlogo GSK-3p v p27 Kip1 pot med diferenciacijo želodčne celice, ki jih HMBA inducirane.
Metode
celične kulture
želodčni rak celične linije SGC7901 je bila pridobljena iz celične banke v kitajske akademije znanosti in kultivirani, kot je opisano prej [24]. SGC7901 Celice smo inficirali z adenovirusom, ki kodira aktivirano obliko Akt (Ad-Akt) ali adenovirusni kontrolni vektor kodira beta-galaktozidaze (β-gal) na multipliciteto infekcij (MOI) 10 pfu /celico. Po okužbi z vektorji za eno uro, nato pa zamenjavo medija in inkubacijo za nadaljnjih 24 ur, smo celice obdelali v prisotnosti ali odsotnosti HMBA in beljakovin in RNA smo ekstrahirali v zahodni in severni blotting oz.
Materiali
HMBA, TSA, SB-415286 in LiCl bili kupljeni pri Sigma Chemical Company, ZDA. Adenovirus vektorji, ki kodirajo beta-gal in myristoylated aktivno obliko Akt (Ad-Akt) so bile kupljene od Cell BioLabs, ZDA. Vektor, ki kodira katalitsko aktivno mutant GSK3P (HA-GSK-3βCA) je bila kupljena od Addgene. Non-ciljanje kontrolno siRNA in SMARTpool za ciljanje GSK-3p so bile kupljene od Dharmacon, ZDA. Vse sonde so označeni z Biotin Random Prime DNK Označevanje Kit (Pierce).
Protitelesa
Rabbit anti-Akt, anti-fosfo-Akt (Ser473) in antiphospho-GSK-3β (Ser9) smo dobili od signalizacijo med celicami , ZDA. Mouse anti-GSK-3β, miška anti-P27 Kip1, miška anti-Top IIb in miško anti-p21 Waf1 so bile kupljene od BD Biosciences, ZDA. Miš anti-fosfo-GSK-3 (Tyr278 /Tyr216) dobimo iz podeželju, ZDA. Rabbit anti-razklan PARP protiteles je bila kupljena od Abcam, ZDA. Anti-protonske črpalke je kupil od MBL International (ZDA). Poliklonalni anti-CDK2, CDK4 anti-anti-α-tubulin in anti-kaspaze-3 smo dobili od Santa Cruz Biotechnology (ZDA).
Bili pridobljeni Sub-celični ekstrakcija beljakovine in western blot
jedrski citosolnih frakcij z uporabo NE-nA Jedrski in citoplazme Pridobivanje Reagenti komplet (Pierce, ZDA). Citosolno proteina (80 mg) ali jedrske proteina (20 mg) je bil rešen na 10% poliakrilamidni gel in prenesli na PVDF membrano, kot je prej opisano [25]. Filtre smo inkubirali eno uro pri sobni temperaturi v pivnanjem rešitev. Membrane smo inkubirali preko noči pri 4 ° C s primarnimi protitelesi, čemur sledi blotting s hrenovo peroksidazo konjugiranega sekundarnega protitelesa za eno uro, in vizualizirali z uporabo sistema za odkrivanje ECL.
Northern blotting in teste za zaščito RNaze (RPA)
Skupaj RNA smo pripravili ob uporabi TRIzola reagenta (Invitrogen). Vzorce smo deluje na 1,2% agaroznem /formaldehid geli in prenese podpira nitroceluloze. Membrane hibridiziramo z biotina označeni želodca protonske sondo cDNA črpalko. Po hibridizaciji s sondo GAPDH, kontrole nakladanje, smo membrane oprati in signali so bile ugotovljene z uporabo sistema za odkrivanje ECL. Poskusi za zaščito RNaze smo izvedli z uporabo kompleta RPA-III iz Ambion in Vsebnost sistema RiboQuant MultiProbe RNaze zaščite smo uporabili za odkrivanje več posebnih mRNK. 32P-označeno protismiselne RNA sonde smo pripravili s pomočjo Human apoptoze HCC-2 in hCYC-1 Nastavitev predlogo in so bile izvedene hibridizacija po protokolu proizvajalca. Analiza
Celični ciklus
želodca rakavih celic so bile pridelane z uporabo tripsina . Celice zberemo, izperemo dvakrat z ledeno mrzlo PBS in fiksna v ledeno mrzlo 70% etanola. Potem pa dvakrat speremo z ledeno-mrzlo PBS, resuspendiramo v PBS, ki vsebuje 100 ie /ml RNaze A in inkubiranih pri 37 ° C za 30 minut, smo celice obarvali z PI (20 mg /ml) in analizirali z FACSCAN (Becton Dickinson, San Jose, CA, ZDA), kot je opisano predhodno [25].
vitro
kinaznih testov
aktivnosti CDK2, CDK4 in GSK-3p smo izmerili kot je opisano predhodno [26, 27]. Na kratko, je bil CDK2, CDK4 ali GSK-3β imuno od citosolskih (100 mg beljakovin) ali jedrske (25 mg beljakovin) ekstraktov. Kinaza aktivnost smo merili z inkubiranje imunoprecipitirali CDK2, CDK4 ali GSK-3β v 40 ml kinaza pufra s 4 mg rekombinantnega Polž proteina (za merjenje GSK-3β-povezan kinaze), 5 mg histon H1 (meriti-CDK2 povezana kinazo aktivnost) ali retinoblastom beljakovin (za merjenje-CDK4 povezana kinaze), pri 30 ° C za 30 minut. Vzorci so bili obdelani, kot je opisano v prejšnjih poročilih [28].
Rezultati
Zaviranje GSK-3p zaduši HMBA povzročeno aretaciji celičnega ciklusa in diferenciacijo SGC7901 celic
SGC7901 celic nabrali na kontrolno točko v celičnega cikla G0 /G1 in diferencirali na enterocitov podobno fenotipa po zdravljenju z HMBA [29]. GSK-3β prispeva k inhibicijo napredovanju celičnega ciklusa pri ločevanju celic [20, 30]. Torej, ali GSK-3β igra pomembno vlogo pri SGC7901 inhibicijo-HMBA povzroča celičnega cikla je bil raziskan. Kot je prikazano na sliki 1a, zdravljenje z HMBA povzroča celice se kopičijo na kontrolno točko v celičnega cikla G0 /G1. Zdravljenje z litijev klorid (LiCl), ki zavira GSK-3p v Mg 2+ konkurenčen način [31], povečal delež celic v fazi S. Zdravljenje s kombinacijo LiCl in HMBA obrnil HMBA posredovanega G1 celic aretacijo. Podobne rezultate smo dobili po zdravljenju z SB-415286, ki je močan zaviralec GSK-3P [32] (Dodatni datotek 1). Ti rezultati kažejo, da bi GSK-3β igrajo vlogo pri-HMBA povzroča G1 aretacijo. Da se ugotovi, ali HMBA povzročil celične smrti v obdobju zdravljenja 24 h, smo protein ekstrahirali da ocenijo, ali je bil tam povečana PARP cepitev in /ali aktivne kaspaze-3. Kot je prikazano na sliki 1b, se je po zdravljenju HMBA v PARP cepitev in aktivne kaspaze-3 do 48 ur ne poveča. Pomemben zgodaj dogodek v terminalnem diferenciacijo celic je njihov umik iz celičnega cikla [6]. Ker je GSK-3β dokumentirano, da igrajo vlogo v ustavitev celičnega cikla [33], je Domnevni da bi inhibicija GSK-3p inhibira diferenciacijo. Zato označevalec želodca diferenciacije, so bili proučeni učinki zaviralcev GSK-3P na indukcijo HMBA posredovano izražanja želodca protonske črpalke. SGC7901 celice so bili predhodno zdravljeni z LiCl (slika 1c in 1d) ali SB-415286 (Slika 1e in 1f) pri različnih koncentracijah za eno uro in jo nato obdelamo s HMBA 24 h. LiCl zaviral HMBA povzročeno želodčne izraz protonske črpalke na način, ki je odvisen od odmerka. V skladu s temi rezultati, SB-415.286 blokiran želodčne protein protonske črpalke in mRNA izražanja, ki je sproženo s HMBA. Vzeta skupaj, ti rezultati kažejo, da ima GSK-3β pomembno vlogo pri HMBA posredovano diferenciacijo želodca celic. Slika 1 Zaviranje GSK-3p zaduši HMBA povzročeno aretaciji celičnega ciklusa in diferenciacijo SGC7901 celic. A SGC7901 celice so bili predhodno zdravljeni z ali brez 10 mM LiCl 30 minut, čemur sledi kombinirano zdravljenje z 10 mM HMBA 24 h, čemur sledi s kvantifikacijo vsebnosti DNA s pretočno citometrijo. B, so SGC7901 celice zdravijo z HMBA (10 mm) za 24 ur ali 48 ur in so bili pripravljeni na zahodni blot analizo. C &E, SGC7901 celice so predhodno obdelani z ali brez 10 mM LiCl ali 10 μMSB-415286 eno uro, čemur sledi kombinirano zdravljenje z 10 mMHMBA 24 h. proton stanje izraz črpalka je bila določena preko Western blot analizo. D &F, smo celotno RNA ekstrahira iz celic in je bila izvedena analiza Q-RT-PCR za protonske črpalke mRNA ekspresije. (Podatki predstavljajo povprečje ± SD; * = p < 0,05 vs. nadzorom; * = p < 0,05 vs HMBA sam.)
Akt ureja želodčne razlikovanje, ki ga HMBA povzročeno
GSK-3p je inaktiviran jo kdaj. fosforilirajo dolvodno od Akt [34]. Zato bi bilo treba predvideti, da se aktiviranje Akt s PI3-kinaza, povezane z inhibicijo GSK-3p in posledično inhibicijo diferenciacije želodca celic. Da bi to hipotezo preverili, so SGC7901 celice okužene z Ad-Akt ali kontrolni vektor. Okužba z Ad-Akt povečano izražanje fosforiliranega Akt, Akt in fosforiliranega GSK-3P beljakovin (slika 2a), v skladu s prejšnjimi rezultati dokazujejo, da GSK-3P deluje kot substrat Akt. Kot je prikazano na sliki 2b, sama ni imela učinka na želodčno protonske črpalke in ekspresijo mRNA okužba SGC7901 celic z Ad-Akt adenovirusni vektor. Vendar, okužba z Ad-Akt vektorja povzročilo inhibicijo želodca protonske črpalke mRNA izražanja HMBA inducirane primerjavi z HMBA in okužbo kontrole (β-gal) adenovirus, kar kaže, da signalizacijo preko Pl 3-kinaze /Akt pot ureja želodčne celice razlikovanje z obdelavo HMBA povzroča. Slika 2 Akt ureja želodčne razlikovanje, ki ga HMBA povzročeno. A, so citosolu in jedrske beljakovin, pridobljen iz celic, ki se obravnavajo kot navedeno in rešiti na SDS-PAGE in opral z anti-fosfo-Akt, -Akt, fosfo-GSK-3p, in GSK-3p, ki uporabljajo anti-alfa-tubulina in topo IIβ kot nadzor citosolskih in jedrskih frakcij oz. B, izraz protonske črpalke smo merili z metodo Western blot sledi s številčnostjo količinsko. (Podatki predstavljajo povprečje ± SD; * = p < 0,05 v primerjavi z nadzorom; † = p < 0,05 vs samo HMBA.). C, Total RNA (40 mikrogramov), je bila razbita, prenesli na nitrocelulozne membrane in skeniran z oznako cDNA protonske črpalke; blots so odstranili in reprobed z GAPDH.
Zdravljenje z HMBA povečano izražanje in aktivnost GSK-3p v jedru
želite preveriti, ali je bila GSK-3β vpliva zdravljenja HMBA, je bila določena GSK-3β dejavnost z merjenjem fosforilacija rekombinantnega polž, dobro opredeljenega substrat GSK-3p [35, 36]. GSK-3β se nahaja v citosolnih in jedrskih predelkov celic, ampak predvsem v citoplazmi med fazo G1. Zato so bili jedrske in citoplazemska proteini frakcionirano iz nadzora in HMBA-obdelanih celic in pregledujejo GSK-3P dejavnosti. Zdravljenje HMBA povzročilo povečanje dejavnosti jedrskega GSK-3P (slika 3a) in zaviranje GSK-3β oslabljen-HMBA posredovano G1 aretacijo, kar kaže na vlogo GSK-3p v HMBA sprožene ustavitev celičnega cikla. Ser9 fosforilacijo GSK-3p zmanjšuje GSK-3P aktivnost, medtem ko Tyr216 fosforilacija povečuje GSK-3P dejavnost [37]. Za analizo mehanizme, ki podpirajo večjo GSK-3P dejavnost z obdelavo HMBA, Ser9-fosforilirata in Tyr216-fosforilirata GSK-3P beljakovin izražanja je bila določena s pomočjo metodo Western blot povzročil. Zdravljenje HMBA povečana raven jedrske izraz skupne GSK-3p in Tyr216-fosforilirata GSK-3p, ne da bi to vplivalo na njihovo izražanje v citosolu (slika 3b). Zanimivo je, da zdravljenje HMBA povečala Ser9-fosforiliran GSK-3P izražanje proteinov v obeh citosolskih in jedrskih frakcij. Podobne rezultate smo dobili po zdravljenju z drugimi HPC, SAHA in EMBA (Dodatni datotek 2). Poleg tega je HPC povečana aktivnost GSK-3p v jedru kot je razvidno iz in vitro
kinaze teste (Dodatni datotek 3). Ti rezultati kažejo, da HPC povečuje jedrska GSK-3P dejavnost, ne glede na to fosforilacije na Ser9. Slika 3 Zdravljenje z HMBA povečano izražanje in aktivnost GSK-3p v jedru. A smo SGC7901 celice obdelali z (+) ali brez (-) 10 mMHMBA 24 ur in nato pobrane po koncu zdravljenja. Citosolu in jedrske frakcije smo pripravili in GSK-3β aktivnost smo testirali z in vitro kinaze testu uporabo Polž protein, kot substrat. Fosforilirata Polž proteinske signali so denzitometrično kvantificiramo in izražena kot kratna sprememba glede na neobdelane kontrolne skupine. B, so SGC7901 celice zdravljeni z 10 mM HMBA različnih časih. Citosolskih in jedrska proteinske frakcije so pridobljeni in western blot smo izvedli s pomočjo protiteles proti GSK-3p, fosfo-GSK-3P (Ser9), fosfo-GSK-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-tubulin ali Topo IIβ.
zaviranje GSK-3p preglasi HMBA inducirane inhibicije CDK2
napredovanje skozi G1 je odvisna od CDK2 in CDK4 [38, 39]. Da ugotovi, ali se pojavi regulacija GSK-3β od HMBA posredovano prijetje G1 celičnega ciklusa preko CDK2 ali CDK4 inhibicijo smo SGC7901 celice predhodno obdelamo z LiCI (slika 4a) ali SB-415286 (slika 4b) in nato podvržemo kombinirano zdravljenje z HMBA za smo 24 ur pred imunoprecipitacijskih testih izvedena na celičnih lizatov uporabo anti-CDK2 ali anti-CDK4 protitelesa oz. Poleg tega je bil CDK2 ali CDK4 aktivnost določimo s pomočjo in vitro
kinazne testom. Zdravljenje z HMBA sam zaviral aktivnosti CDK2 (zgoraj, levo plošče), vendar povečano CDK4 dejavnosti (zgoraj, desno plošče); zaviranje GSK-3p uporabo LiCl ali SB-415286 znatno zmanjšalo zaviranje HMBA za CDK2 dejavnosti (spodaj). Zdravljenje z HMBA povečano izražanje in aktivnost GSK-3p v jedru. Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da GSK-3β prispeva k HMBA posredovano aretacijo G1 celičnega cikla z zaviranjem CDK2. Slika 4 Zaviranje GSK-3p preglasi HMBA inducirane inhibicije CDK2. SGC7901 Celice smo predhodno obdelali z (+) ali brez (-) 10 mM LiCl (A) ali 10 pM SB-415.286 (B) za 30 minut, čemur sledi kombinirano zdravljenje z 10 mM HMBA 24 h. Proteinske ekstrakte smo imunoprecipitirali z anti-CDK2 ali anti-CDK4 protiteles. Dobljene imunskih kompleksov smo analizirali CDK2 aktivnost uporabo histona H1 kot substrata (zgornja plošča) ali za CDK4 aktivnost uporabo Rb kot substrata (spodnje plošče). Fosforilirata histon H1 ali Rb beljakovinski signali so kvantificiramo denzitometrično in izražena kot kratna sprememba glede na neobdelane kontrolne skupine.
GSK-3p ureja jedrsko p27Kip1protein izraz
Za dodatno preučiti mehanizme, ki podpirajo HMBA posredovana G1 aretacijo in zaviranje CDK2, celični cikel, regulativni mRNA izraz je bil analiziran s pomočjo RPA testov. Zdravljenje z HMBA povečala P27 Kip1 mRNA izražanja, vendar je zmanjšala p53, P57, P15 (slika 5A desno), ciklin A in ciklin D1 mRNA (slika 5A levo). Vendar pa je zdravljenje z LiCI povečala p21 Waf1 mRNA izraz, vendar ni vplivala na raven izražanja drugih genov. Podobne rezultate smo dobili, ko smo celice obdelali s SB-415286 (Dodatna datoteka 4). Ti rezultati kažejo, da je ureditev GSK-3β od HMBA posredovano ustavitev celičnega cikla ne gre za transkripcijski ureditev povezanih kroga genov celic. Slika 5 mRNA izražanje genov pri celičnem ciklusu. A, teste za zaščito RNaze so bile izvedene z uporabo RNA iz SGC7901 celic tretiranih bodisi z 10 mM HMBA, 20 mM LiCl, ali kombinacija HMBA in LiCl 24 h, hibridizirane z multi-sondami za inhibitorjev celičnega ciklusa odvisne kinaze (A; hCC- 2) ali ciklini (B; hCYC-1). B SGC7901 celice so bili predhodno zdravljeni z (+) ali brez (-) 10 mM LiCl (desno) ali 10 pM SB-415.286 (levo) za 30 minut, čemur sledi kombinirano zdravljenje z 10 mM HMBA 24 h. Cela celic beljakovinski izvlečki, so bile odpravljene na SDS-PAGE, prenese na PVDF membrane, in immunoblotted s protitelesi za p27Kip1, p21Waf1, CDK2 ali P-aktina.
Za analizo mehanizmov dodatno osnovne GSK-3β-povezan aretacijo celičnega ciklusa, izraz p21 Waf1 in P27 je bila preučena Kip1 beljakovine v SGC7901 celic, ki so se zdravili z HMBA v prisotnosti ali odsotnosti LiCl ali SB-415286. Dodajanje LiCI (slika 5B desno) ali SB-415286 (slika 5B levo) oslabljen indukcijo p27 Kip1 vendar ne p21 Waf1 protein izraz, kar kaže, da P27 Kip1 sodeluje pri prehodih med celičnega ciklusa urejeno ga GSK-3P. Ko P27 Kip1 kopiči v jedru se veže na CDK2, zavre njegovo delovanje, in sčasoma povzroči aretacijo celičnega ciklusa. Poleg tega HMBA (10 mM), povečana P27 Kip1 proteinsko ekspresijo v citosolu in jedru od 0-24 ur po zdravljenju (slika 6a). HMBA (0-5 mM) povečala P27 Kip1 izraz po 24 urah v citosolskih frakcij in po 48 h HMBA (5-10 mM) povečala P27 Kip1 izražanja v jedrskih delcev (slika 6b). Dodajanje LiCI (slika 6c) ali SB-415286 (slika 6d) blokiran HMBA-povečano P27 jedrsko izražanje Kip1 brez vpliva P27 Kip1 izraz v citosolu, kar kaže na posebno ureditev jedrske p27 Kip1 izraz, ki ga GSK-3β. Za prikaz vlogo GSK-3p v urejanje jedrske p27 Kip1 izraz nadaljnjega, so bile celice transfekciji s siRNA, usmerjenem proti GSK-3P (slika 6e). -RNAi posredovano zatiranje GSK-3p je bila potrjena z imuno in oslabljen jedrske P27 indukcijski Kip1 s HMBA brez vpliva citosolno P27 indukcijo Kip1. Za potrditev vloge GSK-3p v urejanje jedrske p27 Kip1 izraz, SGC7901 celice transfektiramo z vektorjem, ki kodira aktivirano obliko z GSK-3p (GSK-3β-CA) ali prazno kontrolno vektor. Citosolu in jedrske proteini so bili pridobljeni in western blot je bila izvedena za določitev P27 Kip1 izraz. Transfekcija SGC7901 celic z GSK-3βCA plazmida zvečala p27 Kip1 v jedrskem frakciji (slika 6F), ne da bi to vplivalo P27 nivoje Kip1 v citosolu. Prekomerno izražanje aktivne oblike GSK-3p smo potrdili z uporabo western blot in vitro
kinaz teste s pomočjo Polž protein kot substrat (slika 6G). Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da GSK-3β sodeluje pri regulaciji celičnega cikla prek posebne ureditve jedrske p27 Kip1 protein izražanja. Slika 6 Jedrska P27 Kip1 izraz, ki ga GSK-3p moduliran. A & B smo SGC7901 celice obdelamo s HMBA (10 mM) v časovnem poteku (A) ali z različnimi koncentracijami za 24 h. Citosolskih in jedrska proteinske frakcije so pridobljeni in western blot smo izvedli s protitelesi za p27Kip1, alfa-tubulina ali Topo IIβ. C & D SGC7901 celice so bili predhodno zdravljeni z (+) ali brez (-) 20 mM LiCl (C) ali 10 pM SB-415.286 (D) za 30 minut, čemur sledi kombinirano zdravljenje z 10 mM HMBA 24 h. Citosolu in jedrske proteini so bili pridobljeni za analizo p27Kip1 beljakovin izražanja. E, so SGC7901 celice transfekciji s siRNA usmerjena na GSK-3p ali nadzor siRNA. Štiriindvajset ur po transfekciji smo celice obdelali z HMBA za dodatno 24 h. Citosolu in jedrske proteini so bili pridobljeni za analizo p27Kip1 beljakovin izražanja. Rasklapanje z GSK-3P izražanja je potrdil zahodni blot uporabo anti-GSK-3P protitelesa. F, so SGC7901 celice okužene z Ad-HA-GSK-3βS9A ali Ad-beta-gal na MOI 10 pfu /celico. Po 48 h inkubacije smo citosolu in jedrske beljakovina, pridobljena in western blot izvaja z uporabo anti-p27Kip1, anti-HA in anti-GSK-3 protitelesa, oziroma s pomočjo anti-a-tubulinu ali topo IIβ so nadzor obremenitve. GSK-3p aktivnosti smo testirali z in vitro kinaze testu uporabo Polž protein, kot substrata (spodnjega panela). p27Kip1 signali so kvantificiramo denzitometrično in izražena kot kratna sprememba v zvezi z a-tubulinu ali TopIIβ.
GSK-3p ureja p27Kip1binding za CDK2
HMBA povečala P27 Kip1 protein izraz, zaviral CDK2 aktivnost in povečano CDK4 dejavnosti (Slika 4). Izvlečki iz nadzora ali HMBA-obdelanih celic je bilo imuno za preiskavo P27 Kip1 vezave na CDK2 in CDK4. Kot je prikazano na sliki 7a, zdravljenje HMBA povečala raven p27 Kip1 v kompleksov imuno z anti-CDK2 vendar ne v komplekse imuno z anti-CDK4. Re-sondiranje filtrov z anti-CDK2 in anti-CDK4 protiteles so potrdili, da so immunoprecipitates iz nadzora in HMBA-obdelanih celic vsebuje enake ravni CDK2 in CDK4. Zato se zdi, da HMBA da povzroča selektivno povečanje p27 Kip1 vezavo na CDK2. Analizirati, ali zaviranje GSK-3p vpliva pridružitvi p27 Kip1 z CDK2, SGC7901 celice so bili predhodno zdravljeni z LiCI ali SB-415286 in izpostavljen kombinaciji z HMBA 24 h; Celoten-celične ekstrakte smo imunoprecipitirali. Zdravljenje z GSK-3P inhibitorji, LiCl (slika 7b) ali SB-415286 (slika 7c) blokiran P27 Kip1 vezavo na CDK2. Ti rezultati kažejo, da je GSK-3β bistvenega pomena za-HMBA povzroča povečano p27 Kip1 vezavo na CDK2. Za potrditev vloge GSK-3p pri regulaciji p27 Kip1 pridruževanju z CDK2 smo SGC7901 celice transficirane z vektorjem, ki kodira aktivirano obliko z GSK-3p ali Ad-beta-gal. Celocelično protein smo ekstrahirali in imunoprecipitirali. Kot je prikazano na sliki 7d, transfekcija SGC7901 celic z vektorja GSK-3β-CA je povzročilo povečano stopnjo p27 Kip1 v kompleksov imuno z anti-CDK2 primerjavi z transfekciji kontrolnega plazmida. To kaže, da je GSK-3β ni potrebno le-HMBA posredovano p27 Kip1 veže na CDK2, temveč zadostuje, da poveča združenje p27 Kip1 z CDK2 v SGC7901 celicah. Slika 7 uredbe GSK-3β od P27 Kip 1 skupaj s CDK2. A smo SGC7901 celice obdelali z (+) ali brez (-) 10 mM HMBA 24 h. Proteinske ekstrakte smo imunoprecipitirali z anti-CDK2 ali anti-CDK4 protiteles. Normalna zajec IgG smo uporabili kot kontrolo. P27Kip1 CDK2-ali-CDK4 vključena v nastalih imunskih kompleksov smo analizirali s zahodni blot uporabo anti-p27Kip1 protitelesa z anti-CDK2 ali -CDK4 protitelesa kontrole, nakladanja. B &C, SGC7901 celice so bili predhodno zdravljeni z (+) ali brez (-) 10 mM LiCl (B) ali 10 pM SB-415.286 (C) za 30 minut, čemur sledi kombinirano zdravljenje z 10 mM HMBA 24 h. Proteinske ekstrakte smo imunoprecipitirali z anti-CDK2 protitelesa. P27Kip1 CDK2 vključena v nastalih imunskih kompleksov smo analizirali podobne A. D, so SGC7901 celice okužene z Ad-HA-GSK-3βCA ali nadzor vektorja (Ad-β-gal) na MOI 10 pfu /celico. Po 48 h inkubacije je bila celotna celica protein ekstrahiramo in imunoprecipitirali z anti-CDK2 protitelesa (zgornji panel). p27Kip1 smo analizirali z western blot podobna A. čezmernim HA-označili GSK-3CA je potrdil zahodni blot uporabo anti-GSK-3P protitelesa (spodnja plošča). GSK-3β aktivnost smo analizirali s vitro
kinaze testu, ki uporablja Polž beljakovin kot substrata (talne plošče).
Razprava
The Pl 3-kinaze /Akt /GSK-3β signalizacijo pot je bila vpletena v uredbi rasti celic, apoptoza in razlikovanje različnih tipov celic [46]. V tej študiji je bilo zaviranje GSK-3p uporabo komplementarna pristopa (tj kemične inhibicije in konstitutivno aktivno Akt prekomerno ekspresijo) oslabljene protonske izražanja črpalke, merilo želodca podobnega razlikovanja, v želodcu tumorjem izhaja SGC7901 celične linije.
Cell proliferacijo in diferenciacijo tradicionalno dojema kot vzajemne procese, z umikom celičnega cikla, ki je potrebna za terminalne diferenciacije [40], in P27 Kip1 igrajo pomembno vlogo [41, 42]. Genetsko izbris p27, vendar ne p21 se je izkazalo, da vplivajo na diferenciacijo želodčne celic, medtem ko prisilna p27 Kip1 izraz vodi v diferenciacijo, kar kaže, da P27 Kip1 je bolj pomembno kot p21 Waf1 pri urejanju želodčne celice diferenciacija. V dogovoru s temi ugotovitvami, zaviranje GSK-3P oslabljenim-HMBA posredovano želodca celično diferenciacijo in zaviranje GSK-3p blokiran HMBA posredovano jedrske P27 Kip1 izraz, medtem ko prekomerno izražanje aktivne oblike GSK-3p povečala jedrska P27 Kip1 izraz, kar kaže na pomembno vlogo pri regulaciji diferenciacije želodčne celice z regulacijo jedrske p27 Kip1 izražanja.
  • želodec člen
    •   
  • želodca struktura
    •   
  • Skrb za želodec
    •   
  • raziskave

    • raziskave

    raziskave

    Other Languages

    elodec Zdravje © https://www.stomachillness.com/sl