| Stomach Health > Желудок Здоровье >  > Stomach Knowledges > Исследования

P27Kip1, регулируется гликоген-синтазы-киназы-3 &beta приводит к ГММК-индуцированной дифференцировки клеток рака желудка человека

P27 Kip1, регулируется гликоген-синтазы-киназы-3 &beta приводит к ГММК-индуцированной дифференцировки клеток рака желудка человека
Аннотация
Справочная информация
Желудочный рак является второй наиболее распространенной причиной глобального рака смертности, связанной с , Хотя дедифференцировка предсказывает плохой прогноз при раке желудка, молекулярный механизм, лежащий в основе дедифференцировка, который мог бы обеспечить фундаментальные понимание развития и прогрессии опухоли, еще предстоит выяснить. Кроме того, молекулярный механизм, лежащий в основе эффектов гексаметиленгликоль- bisacetamide (ГММК), недавно обнаруженной дифференцировки индуктора, требует исследования, и нет никаких сообщений о исследования, касающиеся влияния ГММК на рак желудка.
Методы
Основываясь на результатах анализ FACS, уровни белков, участвующих в клеточном цикле или апоптоза определяли с помощью Вестерн-блоттинга после однократного лечения и последовательных комбинаций ГММК и LiCl. GSK-3β и протонного насоса были исследованы с помощью вестерн-блоттинга после повышающей регуляции экспрессии Akt с помощью Ad-Akt инфекции. Для того, чтобы исследовать влияние ГММК по локализации белка и деятельности GSK-3 &beta, CDK2 и CDK4, киназы анализов, иммунопреципитации и Вестерн-блоттинга были выполнены. Кроме того, Нозерн-блоттинг и анализы на защиту от РНКазы были проведены, чтобы определить функциональную концентрацию ГММК.
Результаты
ГММК повышенную экспрессию p27Kip1 и индуцированный остановку клеточного цикла, связанного с желудочной дифференцировки эпителиальных клеток. Кроме того, лечение желудка клеток, полученных с ГММК индуцированной G0 /G1 арест и повышающей регуляции протонного насоса, маркер желудка дифференцировки рака. Кроме того, лечение с помощью ГМБА усиливает экспрессию и активность GSK-3 &beta в ядре, но не в цитозоль. ГММК уменьшилась активность CdK2 и индуцированную экспрессию p27Kip1, которая может быть спасена путем ингибирования GSK-3 &beta. Кроме того, увеличение ГММК p27Kip1 связывание с CDK2, и это было отменено путем ингибирования GSK-3 &beta.
Выводы
результаты, представленные здесь показывают, что GSK-3 β функции, регулируя p27Kip1 сборку с CDK2, таким образом, играет критическую роль в G0 /G1 сердца при ГММК-индуцированной желудочной дифференцировки эпителиальных клеток.
Ключевые слова
ГММК рак желудка GSK-3β Предпосылки
рак желудка является одним из наиболее распространенных видов рака в мире, и часто развивается устойчивость к химиотерапии и радиации лечения. Таким образом, комбинированная терапия была предложена для борьбы с этой болезнью лучше и уменьшить вероятность развития резистентности [1]. Гексаметилен bisacetamide (ГММК), гибридное полярное соединение (ГПЦ), первоначально разработан как дифференцирование агента, индуцирующего [2-6], приводит к желудочной клеток повторной дифференцировки [7-9].
В желудке стволовых клеток в пролиферативная клеточная зона перешейка области желудочных желез дифференцировать и приводят к различным типам клеток [10, 11]. После того, как первый онкогенными событие происходит, дальнейшее прогрессирование опухоли зависит от характера инициирующего события и от стадии развития клетки, что устойчивые и его дополнительных мутаций, которые могут произойти. Постоянное распространение является жизненно важной особенностью стволовых клеток, а также в желудочно-кишечных тканей мутации могут привести к расширению измененными стволовых клеток, увеличивая вероятность дополнительных мутаций и прогрессирования опухоли [12]. Поэтому нацеливание желудочные раковые стволовые клетки, вероятно, будет наиболее эффективным способом лечения рака желудка. Около 50% западной популяции развивается метаплазия, является ключевым шагом в развитии рака [13], обращая внимание на путях, которые контролируют пролиферацию и тем самым дифференцировку клеток. Среди них, TGF-б, Myb, Wnt и Hedgehog пути имеют особое значение, видное место в спецификации судьбы клеток и формирования паттерна во время эмбриогенеза и взрослых обновления тканей. Выяснение комплекса опухолевого супрессора и ускорительных сигнальных путей, которые эффект дифференциации клеток модуляции переходная /клеток-предшественников, будет иметь решающее значение для оптимизации терапии для лечения рака желудка.
Для того, чтобы незрелые клетки желудка дифференцироваться, они требуют, чтобы остаться в G1 фазе клеточного цикла в течение определенного периода времени. Клеточного цикла у млекопитающих регулируется путем последовательной активации и инактивации высоко консервативного семейства циклинзависимых киназ (CDKS); Прогрессирование через начала до середины G1 зависит от CDK4 и, возможно, CDK6, в то время как прогрессия и до конца G1 и фазы S требует активации CDK2. Деятельность CDKs можно ингибировать связывание белков-ингибиторов CDK, включая семейства Cip /Kip (р21 Waf1, p27 Kip1 и p57 Kip2) и семейства INK4 (p15Ink4b, p16INK4A, p18Ink4c и p19Ink4d ). P27 Kip1 регулируется посттранскрипционно путем протеолитической деградации. CDK2 связывается с р27 Kip1 и фосфорилирует его на треонин 187 [14], и ГММК-индуцированной дифференцировки клеток желудка связана с регуляцию р27 Kip1 [15, 16] и G0 /G1 арест. Тем не менее, есть несколько детальных исследований, касающиеся молекулярного механизма ГММК и не было никаких сообщений о исследования, изучающие влияние ГММК на рак желудка.
Как вниз по течению мишени фосфатидилинозитол-3-киназы /Akt (PI3-киназы /Akt ) путь, GSK-3β регулирует пролиферацию и дифференцировку [17-20] клеток. Накопленные данные показывают, что гипоактивное сигнализации GSK3β, который функционирует в G1, чтобы принимать входной сигнал от нескольких сигналов и путей развития, возникает в связи с различными злокачественных опухолей человека [21, 22]. GSK-3β участвует в многочисленных биологических процессах, поскольку она фосфорилирует широкий спектр подложек, включая несколько контрольных точек дифференциации в том числе с-Мус, улитка и PI3K [23]. Ранее ингибирование PI3-киназы было показано, что повышение ГММК-опосредованной клеточной дифференцировки желудка [8]. В этом исследовании роль GSK-3 &beta во время дифференцировки клеток желудка исследовали с помощью желудка человека линии клеток рака SGC7901, который отображает мультипотентных фенотип и представляет собой хорошо охарактеризованный модель дифференциации желудка. Результаты указывают на накопительную роль для GSK-3 &beta в р27 Kip1 путь во время дифференцировки клеток желудка, индуцированного ГММК.
Методы
Клеточные культуры
желудочном линии клеток рака SGC7901 была получена из банка клеток в китайской академии наук и культивировали, как описано ранее [24]. SGC7901 клетки инфицировали аденовирусом, кодирующим активированную форму Akt (Ad-Akt) или аденовирусной управления вектором, кодирующим бета-галактозидазы (β-гал) при множественности инфекции (MOI) 10 КОЕ /клетку. После инфицирования векторами в течение одного часа с последующей заменой среды и инкубирование в течение еще 24 ч, клетки обрабатывали в присутствии или в отсутствие ГММК, и белка и РНК были извлечены для западной и нозерн-блоттинга, соответственно.
Материалы
ГММК, TSA, SB-415286 и LiCl были приобретены у Sigma Chemical Company, США. Аденовируса векторы, кодирующие бета-гал и myristoylated активную форму Akt (Ad-Akt) были приобретены у сотовых BioLabs, США. Вектор, кодирующий каталитически активный мутант GSK3β (HA-GSK-3βCA) был приобретен у Addgene. Ненацеливании управления миРНК и SMARTpool для таргетинга GSK-3 &beta были приобретены у Dharmacon, США. Все зонды метили Prime ДНК Биотин Случайные Labeling Kit (Pierce).
Антитела
Кролик анти-Akt, анти-фосфо-Akt (Ser473) и antiphospho-GSK-3β (Ser9) были приобретены у Cell Signaling , США. Мышь анти-GSK-3β, мышь анти-р27 Kip1, мышь анти-Top IIb и мышь анти-р21 Waf1 были приобретены у BD Biosciences, США. Мышиное анти-фосфо-ГСК-3 (Tyr278 /Tyr216) получали из Upstate, США. Кролик анти-расщепленного PARP антитело было приобретено у Abcam, США. Анти-протонный насос был куплен у MBL International (США). Поликлональные анти-CDK2, анти-CDK4, анти-α-тубулина и анти-каспазы-3 были получены из Santa Cruz Biotechnology (США).
Экстракция субклеточном белка и вестерн-блоттинга
Ядерная и цитозольной фракции экстрагировали с использованием NE-PER ядра и цитоплазмы экстракции Реагенты набора (Pierce, США). Цитозольного белка (80 мг) или ядерный белок (20 мг) разделяли на полиакриламидном геле, 10% и переносили на мембраны ПВДФ, как описано ранее [25]. Фильтры инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре в промокательной раствор. Мембраны инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами с последующей блоттинга с конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела в течение одного часа, и визуализируют с использованием системы обнаружения ECL.
Нозерн-блоттинга и анализы на защиту от РНКазы (РПА)
Всего РНК получали с использованием реагента TRIzol (Invitrogen). Образцы прогоняли на 1,2% агарозном /формальдегид геле и переносили на поддерживаемом нитроцеллюлозы. Мембраны гибридизировали с биотин маркированы желудка протонного насоса кДНК зонда. После гибридизации с зондом, GAPDH управления загрузкой, мембраны промывали и сигналы были обнаружены с помощью системы обнаружения ECL. Эксперименты на защиту от РНКазы проводили с использованием набора RPA-III от Ambion и систему анализа RiboQuant многопробниковый защиты от РНКазы был использован для обнаружения нескольких специфических мРНК. 32P-меченого антисмысловые РНК-зонды были получены с использованием человеческого Апоптоз HCC-2 и hCYC-1 Наборы шаблонов и гибридизация были выполнены в соответствии с протоколом производителя. Анализ
клеточного цикла
Клетки рака желудка собирали с помощью трипсина , Клетки собирали, дважды промывали охлажденным льдом PBS и фиксировали в охлажденном льдом 70% этанола. После того, как дважды промывают охлажденным на льду PBS, ресуспендировали в PBS, содержащем 100 Ед /мл РНКазы А и инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин, клетки окрашивали PI (20 мг /мл) и анализировали с помощью FACScan (Becton Dickinson, San Хосе, штат Калифорния, США), как описано ранее [25].
В пробирке измеряли
киназы анализы
деятельности CDK2, CDK4 и GSK-3 &beta, как описано ранее [26, 27]. В кратком изложении, CDK2, CDK4 или GSK-3β был иммунопреципитации из цитозольного (100 мг белка) или ядерных (25 мг белка) экстрактов. Киназа активность измеряли путем инкубирования иммуноосажденного CDK2, CDK4 или GSK-3β в 40 мл киназного буфера с 4 мг рекомбинантного белка Snail (для измерения GSK-3β-связанную активность киназы), 5 мг гистона H1 (для измерения CdK2-ассоциированной киназы активность) или белок ретинобластомы (для измерения CDK4-ассоциированной киназы) при 30 ° с в течение 30 мин. Образцы были обработаны, как описано в предыдущих докладах [28].

Результаты Ингибирование GSK-3 &beta затухает ГММК-индуцированный остановку клеточного цикла и дифференцировки клеток SGC7901
SGC7901 клеток, накопленных в контрольной точке клеточного цикла G0 /G1 и дифференцируются в энтероцитов подобный фенотип после лечения с ГММК [29]. GSK-3β способствует ингибированию клеточного цикла при дифференцировке клеток [20, 30]. Поэтому, играет ли GSK-3β роль в ингибировании клеточного цикла SGC7901 ГММК-индуцированное исследовалась. Как показано на рисунке 1а, лечение с помощью ГММК индуцированных клеток аккумулировать в контрольной точке клеточного цикла G0 /G1. Лечение с помощью хлорида лития (LiCl), который ингибирует GSK-3 β в Mg 2+ конкурентным способом [31], привело к увеличению доли клеток в фазе S. Лечение с комбинацией LiCl и ГММК обратной ГММК-опосредованную G1 остановке клеточного. Аналогичные результаты были получены после обработки с SB-415286, мощного ингибитора GSK-3 &beta [32] (дополнительный файл 1). Эти результаты свидетельствуют о том, что GSK-3β может играть определенную роль в ГММК-индуцированной G1 арестом. Для того, чтобы определить, приводит ли ГММК к гибели клеток в течение периода лечения 24 ч, белок экстрагировали с целью оценки был ли увеличен PARP расщепление и /или активной каспазы-3. Как показано на рисунке 1b, не было никакого увеличения PARP расщепления и активной каспазы-3 до 48 ч после обработки ГММК. Важным ранним событием в терминальной дифференцировки клеток является их выход из клеточного цикла [6]. Так как GSK-3β документирована, чтобы играть роль в остановке клеточного цикла [33], было высказано предположение, что ингибирование GSK-3 &beta может ингибировать дифференцировку. Поэтому эффекты ингибиторов GSK-3 β на индукцию ГММК-опосредованного экспрессии желудочного протонного насоса, маркера дифференцировки желудка, были исследованы. SGC7901 клетки были предварительно обработаны с LiCl (рис 1c и 1d) или SB-415286 (рис 1e и 1f) при различных концентрациях в течение одного часа, а затем обрабатывали ГММК в течение 24 ч. LiCl ингибирует ГММК-индуцированную экспрессию желудочного протонного насоса в зависимости от дозы образом. В соответствии с этими результатами, SB-415286 блокировали желудочный белок протонного насоса и экспрессию мРНК, которая индуцируется ГММК. В совокупности эти результаты указывают на то, что GSK-3β, играет важную роль в ГММК-опосредованного желудка дифференцировки клеток. Рисунок 1 Ингибирование GSK-3 &beta затухает ГММК-индуцированную остановку клеточного цикла и дифференцировки клеток SGC7901. А, SGC7901 клетки были предварительно обработаны с использованием или без 10 мМ LiCl в течение 30 мин с последующим комбинированное лечение с помощью 10 мМ ГММК в течение 24 ч, а затем при определении количества содержания ДНК с помощью проточной цитометрии. В, SGC7901 клетки обрабатывали ГММК (10 мМ) в течение 24 ч или 48 ч и были подготовлены для вестерн-блоттинга анализа. С &Amp; E, SGC7901 клетки, предварительно обработанные с или без 10 мМ LiCl или 10 μMSB-415286 в течение одного часа с последующей комбинированной терапии с 10 mMHMBA в течение 24 ч. протонного статус экспрессии насоса определяли с помощью Вестерн-блоттинга анализа. D &Amp; F, Суммарную РНК экстрагировали из клеток и анализ Q-RT-PCR для экспрессии мРНК протонного насоса проводили. (Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение; * = р &лт; 0,05 по сравнению с контролем; * = р &лт; 0,05 по сравнению с ГММК в одиночку.)
Akt регулирует желудочную дифференциацию, вызванную ГММК
GSK-3 &beta инактивируется при его. фосфорилирования Akt вниз по течению [34]. Таким образом, можно было бы предсказать, что активация Akt с помощью PI3-киназы будет связан с ингибированием GSK-3 &beta и, как следствие, ингибирование желудочной дифференцировки клеток. Чтобы проверить эту гипотезу, SGC7901 клетки были инфицированы Ad-Akt или контрольного вектора. Заражение Ad-Akt повышенной экспрессии фосфорилированного Akt, Akt и фосфорилированного GSK-3 β белок (рис 2а), что согласуется с ранее полученными результатами, демонстрирующих, что GSK-3 β выступает в качестве субстрата Akt. Как показано на рисунке 2b, инфекция SGC7901 клеток с Ad-Akt аденовирусного вектора в одиночку не имел никакого влияния на желудочную протонного насоса и экспрессии мРНК. Тем не менее, инфекция с Ad-Akt вектором приводило к ингибированию желудочной экспрессии мРНК протонной помпы, индуцированной ГММК по сравнению с ГММК и инфекцией контроля (β-гал) аденовируса, предполагая, что передача сигналов через PI3-киназы /Akt путь регулирует желудочную клетки дифференциация индуцированных обработкой ГММК. Рисунок 2 Akt регулирует желудочную дифференциацию, вызванную ГММК. А, Цитозоль и ядерные белки экстрагировали из клеток, обработанных как указано, и разделяли на SDS-PAGE и смыл с анти-фосфо-Akt, -Akt, фосфо-GSK-3 &beta и GSK-3 &beta, с использованием анти-альфа-тубулина и Topo IIβ как контроль цитозольного и ядерных фракций соответственно. B, экспрессия протонного насоса была измерена с помощью Вестерн-блоттинга с последующим изобилием количественной оценки. (Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение; * = р &лт; 0,05 по сравнению с контролем; † = р &лт; 0,05 по сравнению с только ГММК.). С Общую РНК (40 мкг) фракционировали, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и зондируют меченым кДНК протонного насоса; Блот был лишен и повторно зондировали GAPDH.
Лечение с помощью ГМБА усиливает экспрессию и активность GSK-3 &beta в ядре
Чтобы проверить, был ли под влиянием лечения ГММК GSK-3β, GSK-3β активность определяли путем измерения фосфорилирования рекомбинантного улитка, хорошо характеризуется субстратом GSK-3 &beta [35, 36]. GSK-3β расположен в цитозольных и ядерных отсеках клеток, но преимущественно в цитоплазме в фазе G1. Таким образом, ядерные и цитоплазматические белки были фракционированный из-под контроля и ГММК-обработанных клеток и исследовали на ГСК-3 β активности. Лечение ГММК привело к увеличению активности ядерного GSK-3 &beta (фиг.3А), и ингибирование GSK-3β ослабляется ГММК-опосредованного G1 арест, указывает на роль GSK-3 &beta в ГММК-индуцированной остановки клеточного цикла. Ser9 фосфорилирования GSK-3 &beta уменьшается GSK-3 β активность, в то время как Tyr216 фосфорилирования увеличивает GSK-3 β активность [37]. Чтобы проанализировать механизмы, лежащие в основе повышение активности GSK-3 β, вызванного лечением ГММК, Ser9-фосфорилированных и Tyr216-фосфорилированных GSK-3 β экспрессии белка определяли с помощью вестерн-блоттинга. Лечение ГММК повышенные уровни экспрессии ядерного общего GSK-3 &beta и Tyr216-фосфорилируется GSK-3 &beta без воздействия на их экспрессию в цитоплазме (рис 3b). Интересно отметить, что лечение ГММК повышенную экспрессию GSK-3 &beta белка Ser9-фосфорилированный в обоих цитозольного и ядерных фракций. Аналогичные результаты были получены после обработки с другими HPCS, SAHA и EMBA (дополнительный файл 2). Кроме того, ГПЦ увеличена активность GSK-3 &beta в ядре, как продемонстрировано в пробирке
киназ анализа (дополнительный файл 3). Эти результаты свидетельствуют о том, что ГПЦ увеличивает ядерный GSK-3 β активность независимо от фосфорилирования на Ser9. Рисунок 3 Лечение с помощью ГМБА усиливает экспрессию и активность GSK-3 &beta в ядре. А, SGC7901 клетки обрабатывали (+) или без (-) 10 mMHMBA в течение 24 ч, и собирают в конце лечения. Цитозоль и ядерные фракции были подготовлены и GSK-3β активность определяли с помощью экстракорпорального киназы с использованием улитка белка в качестве субстрата. белковые сигналы фосфорилированные Snail были денситометрии количественному и выражали в виде сгиба изменения относительно необработанных контрольных групп. В, SGC7901 клетки обрабатывали 10 мМ ГММК течение различных промежутков времени. Цитозольные и ядерные белковые фракции были извлечены и Вестерн-блоттинг проводили с использованием антител к GSK-3 &beta, фосфо-GSK-3 β (Ser9), фосфо-ГСК-3α /β (Tyr278 /Tyr216), α-тубулина или Topo IIβ.
ингибирование GSK-3 &beta переопределяет ГММК-индуцированное ингибирование CDK2
Прогрессирование через G1 зависит от CDK2 и CDK4 [38, 39]. Для того, чтобы определить, происходит ли GSK-3β регулирование ГММК-опосредованного задержания G1 клеточного цикла, с помощью ингибирования CDK2 или CDK4, SGC7901 клетки предварительно обрабатывали LiCl (рис 4а) или SB-415286 (4б) и затем подвергают обработке комбинации с ГММК в течение 24 ч до начала иммунопреципитации проводили на клеточных лизатов с использованием анти-CdK2 или анти-CDK4 антител, соответственно. Кроме того, CDK2 или CDK4, активность определяли с помощью экстракорпорального
киназы в. Лечение с ГММК в одиночку тормозится CDK2 активности (вверху, левая панель), но повышенной активности CDK4 (вверху, правая панель); ингибирование GSK-3 &beta использованием LiCl или SB-415286 значительно ослабляется ГММК ингибирование активности CDK2 (внизу). Лечение с помощью ГМБА усиливает экспрессию и активность GSK-3 &beta в ядре. Взятые вместе, эти результаты свидетельствуют о том, что GSK-3β способствует ГММК-опосредованного ареста G1 клеточного цикла путем ингибирования CDK2. Рисунок 4 Ингибирование GSK-3 &beta переопределяет ГММК-индуцированное ингибирование CdK2. SGC7901 клетки были предварительно обработаны (+) или без (-) 10 мМ LiCl (А) или 10 мкМ SB-415286 (В) в течение 30 мин с последующей комбинированной терапии с 10 мМ ГММК в течение 24 ч. Белковые экстракты подвергали иммунопреципитации с анти-CDK2 или анти-CDK4 антител. Образующиеся иммунные комплексы были проанализированы на CDK2 активности с использованием гистона H1 в качестве субстрата (верхняя панель) или для CDK4 активности с использованием в качестве субстрата Rb (нижняя панель). Фосфорилированные гистона H1 или Rb белка сигналы количественному денситометрии и выражали в виде сгиба изменения в отношении необработанных контрольных групп.
GSK-3 β регулирует ядерный p27Kip1protein выражение
Чтобы исследовать механизмы, лежащие ГММК опосредованной G1 арест и ингибирование CdK2 дальше, экспрессия мРНК цикла-регуляторных клеток анализировали с использованием анализов РПА. Лечение с ГММК увеличилась Р27 экспрессии мРНК Kip1, но снизился p53, p57, P15 (рис 5A справа), экспрессия циклин А и циклин D1 мРНК (рис 5А слева). Тем не менее, лечение с LiCl увеличилась p21 выражение Waf1 мРНК, но не влияет на уровни экспрессии других генов. Аналогичные результаты были получены, когда клетки обрабатывали SB-415286 (дополнительный файл 4). Эти результаты свидетельствуют о том, что GSK-3β регулирование ГММК-опосредованного остановки клеточного цикла не предполагает регуляции транскрипции генов клеточного цикла, связанных с. Выражение Рисунок 5 мРНК генов в отношении клеточного цикла. A, анализы на защиту от РНКазы проводили с использованием РНК из SGC7901 клеток, обработанных либо 10 мМ ГММК, 20 мМ LiCl, или сочетание ГММК и LiCl в течение 24 ч, гибридизуют с многоканальным зондов для ингибиторов клеточного цикла зависимой киназы (A, hCC- 2) или циклины (В; hCYC-1). В, SGC7901 клетки были предварительно обработаны (+) или без (-) 10 мМ LiCl (справа) или 10 мкМ SB-415286 (слева) в течение 30 мин с последующим комбинированное лечение с помощью 10 мМ ГММК в течение 24 ч. Цельные клеточные экстракты белка разделяли на SDS-PAGE, переносили на мембраны ПВДФ, и иммуноблоттинг с антителами к p27Kip1, p21Waf1, CDK2, или бета-актина.
Анализировать механизмы, лежащие в основе GSK-3β-ассоциированный остановку клеточного цикла в дальнейшем, выражение p21 Waf1 и р27 Kip1 белки в SGC7901 клетках, обработанных ГММК в присутствии или в отсутствии LiCl или SB-415286 был рассмотрен. Добавление LiCl (Рисунок 5B справа) или SB-415286 (рис 5B слева) уменьшал индукцию р27 Kip1, но не p21 экспрессии белка Waf1, предполагая, что p27 Kip1 участвует в переходах клеточного цикла регулируется ГСК-3 &beta. Когда р27 Kip1 накапливается в ядре он связывается с CDK2, подавляя его активность, и в конечном счете вызывает остановку клеточного цикла. Кроме того, ГММК (10 мМ) увеличилась экспрессии белка p27 Kip1 в цитозоле и ядра от 0 до 24 ч после обработки (фиг.6а). ГММК (0-5 мМ) увеличилась выражение Kip1 p27 через 24 ч в цитозольных фракций и через 48 ч ГММК (5-10 мм) увеличилась р27 экспрессии Kip1 в ядерных фракций (рис 6б). Добавление LiCl (Рисунок 6в) или SB-415286 (рис 6d) заблокирован ГММК-увеличение p27 Kip1 ядерное выражение, не затрагивая p27 выражение Kip1 в цитозоле, предлагая конкретное регулирование ядерной р27 выражения Kip1 с помощью GSK-3β. Чтобы продемонстрировать роль GSK-3 &beta в регулировании ядерной р27 выражение Kip1, далее, клетки трансфицировали siРНК, направленной против GSK-3 β (рисунок 6е). RNAi-опосредованной подавление GSK-3 &beta было подтверждено с помощью иммуноблоттинга и ослабляется ядерный p27 Kip1 индукция ГММК, не затрагивая цитозольного p27 Kip1 индукции. Чтобы подтвердить роль GSK-3 &beta в регулировании ядерной р27 выражение Kip1, SGC7901 клетки трансфицировали вектором, кодирующим активированную форму GSK-3 &beta (GSK-3β-CA) или пустым вектором управления. Цитозоль и ядерные белки были извлечены и Вестерн-блоттинг проводили для определения p27 выражение Kip1. Трансфекция SGC7901 клеток с плазмиды GSK-3βCA привело к увеличению р27 Kip1 в ядерной фракции (рис 6F), не затрагивая p27 уровни Kip1 в цитозоле. Избыточная экспрессия активной формы GSK-3 &beta была подтверждена с помощью Вестерн-блоттинга и в пробирке
киназы анализов с использованием улитка белка в качестве субстрата (рис 6G). В совокупности эти результаты указывают на то, что GSK-3β участвует в регуляции клеточного цикла посредством специфического регулирования ядерной р27 экспрессии белка Kip1. Рисунок выражение Kip1 6 Nuclear p27 модулируется GSK-3 &beta. &Amp; В, SGC7901 клетки обрабатывали ГММК (10 мМ) в течение временного хода (A) или с различными концентрациями в течение 24 ч. Цитозольные и ядерные белковые фракции были извлечены и Вестерн-блоттинг проводили с антителами к p27Kip1, альфа-тубулина или Topo IIβ. Лагерь; D, SGC7901 клетки были предварительно обработаны (+) или без (-) 20 мМ LiCl, (С) или 10 мкМ SB-415286 (D), в течение 30 мин с последующей комбинированной терапии с 10 мМ ГММК в течение 24 ч. Цитозоль и ядерные белки экстрагировали для анализа экспрессии белка p27Kip1. Е, SGC7901 клетки трансфицировали siРНК, направленной на GSK-3 &beta или контроля миРНК. Через двадцать четыре часа после трансфекции клетки обрабатывали ГММК в течение еще 24 ч. Цитозоль и ядерные белки экстрагировали для анализа экспрессии белка p27Kip1. Нокдаун экспрессии GSK-3 β была подтверждена вестерн-блоттинга с использованием анти-ГСК-3 β антитела. F, SGC7901 клетки были инфицированы Ad-HA-GSK-3βS9A или Ad-бета-гал при MOI 10 КОЕ /клетку. Через 48 ч инкубации, цитозоль и ядерный белок экстрагировали и Вестерн-блоттинг проводили с использованием анти-p27Kip1, анти-Ха и анти-GSK-3 антител, соответственно, с использованием анти-альфа-тубулина или Topo IIβ в качестве нагрузочного контроля. GSK-3 β мероприятия анализировали с помощью экстракорпорального киназы с использованием улитка белка в качестве субстрата (нижняя панель). p27Kip1 сигналы количественному денситометрии и выражали в виде сгиба изменения по отношению к альфа-тубулина или TopIIβ.
GSK-3 β регулирует p27Kip1binding к CdK2
ГММК увеличилась р27 экспрессия белка Kip1, тормозится CDK2 активность и повышение активности CDK4 (Рисунок 4). Выдержки из управления или ГММК-обработанных клеток подвергали иммунопреципитации для исследования p27 Kip1 связывание с CDK2 и CDK4. Как показано на фиг.7а, лечение ГММК повышал уровень p27 Kip1 в комплексах иммунопреципитации с использованием анти-CDK2, но не в виде комплексов иммунопреципитации с использованием анти-CDK4. Повторно зондировании фильтры с анти-CDK2 и анти-CDK4 антител подтвердил, что иммунопреципитаты из-под контроля и ГММК-обработанных клеток содержали те же уровни CDK2 и CDK4. Поэтому ГММК, кажется, вызывает селективное увеличение р27 Kip1, связывание с CDK2. Для того, чтобы проанализировать, влияет ли ингибирование GSK-3 &beta ассоциацию р27 Kip1 с CDK2, SGC7901 клетки были предварительно обработаны LiCl или SB-415286 и подвергали обработке комбинации с ГММК в течение 24 ч; Экстракты целых клеток подвергают иммунопреципитации. Лечение с помощью GSK-3 β ингибиторы, LiCl (рис 7б) или SB-415286 (рис 7в) заблокирован p27 Kip1 связывание CDK2. Эти результаты свидетельствуют о том, что GSK-3β имеет важное значение для ГММК-индуцированной повышенной р27 Kip1 связывание с CDK2. Чтобы подтвердить роль GSK-3 &beta в регуляции р27 Kip1 об ассоциации с CDK2, SGC7901 клетки трансфицировали вектором, кодирующим активированную форму GSK-3 &beta или Ad-бета-гал. белок цельноклеточная экстрагировали и иммунопреципитации. Как показано на рисунке 7d, трансфекция SGC7901 клеток с вектором GSK-3β-СА привело к увеличению уровня р27 Kip1 в комплексах иммунопреципитации с использованием анти-CDK2 по сравнению с трансфекцией плазмиды управления. Это говорит о том, что GSK-3β не является необходимым только для ГММК-опосредованного р27 Kip1, связывание с CDK2, но и достаточно, чтобы увеличить ассоциацию р27 Kip1 с CDK2 в SGC7901 клетках. Рисунок 7 GSK-3β регуляция p27 Кип 1 совместно с CDK2. А, SGC7901 клетки обрабатывали (+) или без (-) 10 мМ ГММК в течение 24 ч. Белковые экстракты подвергали иммунопреципитации с анти-CDK2 или анти-CDK4 антител. Нормальный кролика IgG, использовали в качестве контроля. CDK2-или CDK4, ассоциированных с p27Kip1 в результирующих иммунных комплексов анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием анти-p27Kip1 антитела с анти-CDK2 или -CDK4 антител в качестве контрольной нагрузки. B &Amp; С, SGC7901 клетки предварительно обрабатывали (+) или без (-) 10 мМ LiCl, (В) или 10 мкМ SB-415286 (С) в течение 30 мин с последующим комбинированное лечение с помощью 10 мМ ГММК в течение 24 ч. Белковые экстракты подвергали иммунопреципитации с анти-CDK2 антителом. CDK2 связанный p27Kip1 в результирующих иммунных комплексов анализировалась подобных A. D, SGC7901 клетки инфицировали Ad-HA-GSK-3βCA или векторного управления (Ad-β-гал) при MOI 10 КОЕ /клетку. После 48 часов инкубации, весь белок клеток экстрагируют и иммунопреципитации с использованием анти-CDK2 антителом (верхняя панель). p27Kip1 анализировали с помощью вестерн-блоттинга, подобных A. сверхэкспрессии HA-меченый GSK-3са была подтверждена с помощью Вестерн-блоттинга с использованием анти-ГСК-3 β антитела (нижняя панель). GSK-3β активность определяли с помощью экстракорпорального
киназы с использованием в улитка белка в качестве субстрата (нижняя панель).
Обсуждение
The PI3-киназы /Akt /GSK-3β сигнальный путь вовлечен в регуляцию клеточного роста, апоптоза и дифференцировки различных типов клеток [46]. В настоящем исследовании, ингибирование GSK-3 &beta с использованием дополнительных подхода (то есть химическое ингибирование и конститутивно активный Akt сверхэкспрессии) выражение ослабленный протонного насоса, мера желудка-подобной дифференциации, в желудочном SGC7901 линии клеток опухоли происхождения.
пролиферации и дифференцировки клеток традиционно воспринимаются как взаимные процессы, с выводом клеточного цикла время, необходимое для терминальной дифференцировки [40], и Р27 Kip1 играет важную роль [41, 42]. Генетическое удаление p27, но не p21 было показано, что влияет на желудочную дифференцировки клеток, в то время как принудительный р27 выражение Kip1 приводит к дифференциации, предполагая, что p27 Kip1 является более важным, чем p21 Waf1 в регуляции желудочной клетки дифференциация. В соответствии с этими выводами, ингибирование GSK-3 β ослабленного ГММК-опосредованного желудочной дифференцировки клеток и ингибирование GSK-3 &beta заблокирован ГММК-опосредованного ядерный Р27 выражение Kip1, в то время как избыточная экспрессия активной формы GSK-3 &beta увеличилось ядерной р27 выражение Kip1, что указывает на важную роль в регуляции клеточной дифференцировки желудка через регулирование ядерной р27 выражения Kip1.
  • Желудок Статья
    •   
  • Желудочный структура
    •   
  • Уход за Желудок
    •   
  • Исследования

    • Исследования

    Исследования

    Other Languages

    Желудок Здоровье © https://www.stomachillness.com/ru