Avvikande uppreglering av 14-3-3ơ uttryck fungerar som en sämre prognostisk biomarkör för magcancer

Avvikande uppreglering av 14-3-3ơ uttryck fungerar som en sämre prognostisk biomarkör för magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
14-3-3ơ är en intracellulär, fosfoserin bindande protein och föreslog att delta i tumörbildning. Uttrycket dynamik 14-3-3ơ och dess klinisk-patologisk /prognostisk betydelse i humana tumörer är fortfarande kontroversiell.
Metoder
Metoden för immunohistokemi (IHC) och Western blot användes för att undersöka proteinuttryck av 14 -3-3ơ i magcancer och parade normala intilliggande gastric slemhinnevävnader. Får drift karakteristiska (ROC) kurvan analys användes för att bestämma en cutoff betyget för 14-3-3ơ uttryck i en träningsuppsättning (n = 66). För validering, var ROC-härledda cutoff poäng utsattes för analys av en sammanslutning av 14-3-3ơ uttryck med patientresultat och kliniska egenskaper i en testuppsättning (n = 86) och totala patienter (n = 152).
resultat
Uttrycket frekvens och uttrycksnivåer av 14-3-3ơ var signifikant högre i magcancer än i normala magslemhinnan vävnader. Korrelationsanalys visade att högt uttryck av 14-3-3ơ i magcancer var signifikant korrelerad med kliniskt stadium och tumörinvasion. Vidare i testuppsättning och övergripande patienter, visade Kaplan-Meier-analys som förhöjd 14-3-3ơ uttryck förutspådde sämre total överlevnad (OS) och progressionsfri överlevnad (PFS). Viktigt var hög 14-3-3ơ uttryck också i samband med förkortad överlevnadstiden i steg III och cancerpatienter gastric stadium IV. Multivariat analyser visade att 14-3-3ơ uttryck var en oberoende prognostisk parameter i magcancer.
Slutsatser
Dessa resultat ger belägg för att högt uttryck av 14-3-3ơ kan vara viktig i tumörprogression och servrar som en oberoende molekylär markör för dålig prognos för magcancer. Således överuttryck av 14-3-3ơ identifierar patienter med hög risk och är en ny terapeutisk målmolekyl för denna tumör.
Bakgrund
Gastric cancer är en av de vanligaste orsakerna till cancerrelaterad död i världen [1] , särskilt i östasiatiska länder som Kina, Japan [2]. År 2005 fanns det ca 0,4 miljoner nya fall och 0,3 miljoner dödsfall i magcancer i Kina [3]. Trots den senaste tidens framsteg inom kirurgiska tekniker och medicinsk behandling, förblir den totala 5-års överlevnad för magcancer i Kina låg vid ca 40%. Många studier har visat att flera genetiska förändringar, inklusive tumörsuppressorgener, onkogener, celladhesionsmolekyler, cellcykelregulatorer, och tillväxtfaktorer, är ansvariga för utveckling och progression av magcancer [4]. Studier har unraveled många avvikande uttryckta gener i magcancer inklusive BMI1
[5], COX-2 Review [6], HER3
[7], RKIP Mössor och STAT3
[8], SPARC
[9] och HER2
[10, 11], som gör riskbedömning av gastric cancerpatienter mer exakt. Men lovande molekyler som har klinisk-patologisk /prognostisk betydelse i magsäckscancer förblir väsentligen begränsad. Det är nödvändigt att ytterligare förstå de molekylära mekanismer som är inblandade i magcancer och att identifiera mer värdefulla prognostiska markörer för att inte bara förbättra sämre prognos men också ge nya lovande terapi mål.
14-3-3 proteiner är en familj av ca 30 kD dimer högt konserverade proteiner och allmänt utbrett uttryckt i alla eukaryota organismer [12]. Det finns sju närbesläktade gener (β, γ, ε, η, ζ, O, t) i 14-3-3 familjeproteiner. Dessa gener bildar ofta heterodimerer eller homodimerer och binder till över 100 olika proteinligander [13, 14]. Sålunda är 14-3-3 proteiner involverade i många olika cellulära signalprocesser inklusive cellproliferation, cellcykelkontroll, apoptos och malign transformation [14, 15]. Bland de sju isotyperna var 14-3-3ơ ursprungligen karakteriseras som en mänsklig bröst epitel markör 1 (hme1) och identifierades som en tumör trycka gen [12, 16]. Växande bevis visade att 14-3-3ơ var signifikant minskad eller förlorad på grund av tysta av genen via hypermetylering i flera solida tumörer [17-22]. Tidigare rapporter konstaterat att minskat uttryck av 14-3-3ơ förutspådde en dålig överlevnad i bröstcancer och nasofarynxcancer [23, 24]. Men motsägelsefullt med tumörhämmande roll 14-3-3σ, överuttryck av 14-3-3ơ i pancreatic cancer cell ledde till läkemedelsresistens, cellmigration och invasion [25]. Dessutom högt uttryck av 14-3-3σ var en oberoende prognostisk faktor för dålig överlevnad i bukspottskörteln och kolorektal cancer [26, 27]. Således, den biologiska rollen för 14-3-3ơ i tumorigenes och progression av olika typer av humana cancerformer varierar beroende på specifik tumörtyp. Här valde vi magcancer exemplar med strikt protokoll för att upptäcka 14-3-3ơ uttryck dynamik och analysera deras kliniskt patologiska /prognostiska betydelser.
Metoder
Patienter Review, en totalt 216 primära patienter magcancer från arkivet av avdelningen för patologi i det tredje och andra Anslutna sjukhuset i Sun Yat-Sen universitetet (Guangzhou, Kina) ursprungligen rekryterades i vår studie. Samtliga patienter genomgick initial kirurgisk resektion från mars 2001 till januari 2006. Vi vidare screenade patienter som använder en sträng urvalskriterierna protokollet enligt följande: mikroskopiskt bekräftade adenocarcinom i magen; utan några metastatiska sjukdomar; ingen tidigare kemoterapi eller strålningsterapi historia; mottagande enad regim som första linjens behandling efter resektion av primärtumörer (vi enade som FOLFOX regim: fluorouracil, leukovorin och oxaliplatin), och ingen strålning behandling som ges till någon av patienterna; med över 5 års uppföljningsperiod. I slutändan var 52 patienter med förlust av uppföljning och 12 patienter med brist på kliniska egenskaper undantas från denna studie, vilket leder till 152 gastric cancerpatienter utsätter ytterligare klinisk och överlevnadsanalys. I detaljer bestod den totala kohort av 105 manliga och 47 kvinnliga med medianålder på 58,0 år (intervall 27-81 år). 103 patienter censused som döden under 5 års uppföljningstid, inklusive 5 fall dog av postoperativa komplikationer och 98 fall dog av tumörprogression. Av den totala patienterna fick 66 patienter randomiserades av dator (SPSS 17,0 programvara) till träningsmängden, och resterande 86 patienter randomiserades till testuppsättning. Kliniskt patologiska variabler för de två kohorterna, såsom ålder, kön, kliniskt stadium, tumörinvasion, nod skede och histologi differentiering, ingick i studien. Alla tumörer klassificerades och iscensatt enligt de reviderade riktlinjerna förespråkas av International Union mot cancer. Vi fick tidigare patienternas samtycke och godkännande från Institutet forskningsetiska kommittén för Sun Yat-Sen universitetet för användning av kliniska material som beskrivs i den aktuella studien.
Tissue microarray konstruktion
Vävnads microarrays (TMAS) konstruerades som en metod som tidigare beskrivits av Xie et al [28]. I korthet framställdes de paraffininbäddade vävnadsblock och motsvarande histologisk hematoxylin och eosin-färgade objektglas överlagras för TMA provtagning. Intresserade kärn vävnadsbiopsier (0,6-mm i diameter) stansades från representativa tumörområden och från intilliggande magslemhinnan vävnad från block av individuella donatorvävnad med användning av en trefin (tredubbla cylindrar från karcinom vävnad och en cylinder från normal intilliggande magslemhinna vävnad). Vävnads cylindrarna överfördes sedan till en mottagare paraffin block vid definierade positioner med hjälp av en vävnadsgrupperingsinstrument (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA).
Immunohistokemisk analys och utvärdering sälja The TMA Glasen avparaffinerades i xylen , rehydratiserades genom graderad alkohol, nedsänktes i 3% väteperoxid under 10 min för att blockera endogen peroxidasaktivitet, och antigen hämtas av tryckkokning under 3 min i Tris /EDTA (pH = 8,0). Därefter glasen inkuberades med den primära antikroppen av 14-3-3σ (monoklonal mus; 1:50; Santa Cruz, SC-100638) under 1 timme vid rumstemperatur. Efter att ha inkuberats med den sekundära antikroppen under 30 minuter, fick prover färgades med DAB (3, 3-diaminobensidin). Slutligen tillsattes sektionerna motfärgades med hematoxylin, dehydrerades och monterades. En negativ kontroll erhölls genom att ersätta den primära antikroppen med en normal mus-IgG. Kända immunfärgning-positiv kolorektalcancer glas användes som positiva kontroller som tidigare rapporterats [27]. Sälja The bruna granulat i cytoplasman hos 14-3-3σ ansågs som positiv färgning. Vi gjorde färgningsintensitet enligt följande: 0, ingen färgning; 1+, mild färgning; 2+, måttlig färgning; 3+, intensiv färgning. Området färgning bedömdes enligt följande: 0, ingen färgning av celler i eventuella mikroskopiska fält; 1+, < 30% av vävnad färgad positivt; 2+, mellan 30% och 60% färgas positivt; 3+ > 60% färgas positiva. 14-3-3σ uttryck utvärderades genom kombinerad bedömning av färgningsintensitet och förlängning. Den minsta poäng när summeras (intensitet + förlängning) var 0, och den maximala var 6. De kriterier som används i denna studie har varit allmänt accepterat tidigare [24]. Uttryck av 14-3-3σ bedömdes och poängsätts av två oberoende patologer (Drs. F Tang och ZY Feng) som var blind för kliniskt patologiska data. Överenskommelsen av dessa två patologer på IHC poäng nått 84% (128 identiska poäng i totalt 152 fall), vilket tyder på vårt poängsystem var mycket fast och reproducerbar. Om resultaten som rapporterats av de två patologer var konsekvent, var värdet väljs. Var dock interobserver meningsskiljaktigheter (cirka 6% av den totala fall) granskas för en andra gång, följt av en avgörande dom båda patologer. Sälja Western blot-analys
magcancer och parade normala intilliggande gastric slemhinnevävnader maldes och lyserades med RIPA-buffert på is innan det utsätts för Western blot-analys. Proteinkoncentrationen detekteras av Bradford-metoden med BSA (Sigma-Aldrich) som standard. Lika stora mängder av cell- och vävnadsextrakt (40

• Förhållandet mellan tarmhormoner och glukoshomeostas efter bariatric surgery
• P27Kip1, regleras av glykogensyntaskinas-3β, resulterar i HMBA-inducerad differentiering av humana gastriska cancerceller