Genetiska polymorfismer i osteopontin promotorn ökar risken för distansmetastaser och död i kinesiska patienter med magcancer

Genetiska polymorfismer i osteopontin promotorn ökar risken för distansmetastaser och död i kinesiska patienter med magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
In vitro Köpa och in vivo
studier har antytt att osteopontin (OPN) förknippas med många typer av cancer. Emellertid har inga studier rapporterade incidensen av OPN polymorfismer och risken för magcancer. Syftet med denna studie var att undersöka sambandet mellan OPN polymorphisms och magcancer i en kinesisk patientpopulation.
Metoder
Tre genetiska varianter i OPN promotorn genotypas med hjälp av direkt sekvensering i 200 gastric cancerpatienter och 200 köns och åldersmatchade cancerfria kontroller. Det 4-åriga överlevnadskurva beräknades med användning av Kaplan-Meier-metoden och jämfördes med användning av log-rank test för varje enskild nukleotidpolymorfism (SNP) -ställe. Vi mätte promotoraktivitet av -443 T → C polymorfism med användning av en dubbel luciferas reporteranalys.
Resultat
För varianten vid nt -443 (CC), fanns det en signifikant skillnad mellan antalet patienter med stadium IV och de med steg i magcancer (IA + IB; P =
0,014) och mellan dem med stadium IV och alla andra stadier av magcancer (IA + IB + II + III, P =
0,02). För varianten vid nt -443 (CT), var det en signifikant skillnad mellan antalet gastric patienter med stadium IV cancer och de med steg II (P =
0,013). Överlevnaden för patienter med C /C genotyp var betydligt lägre än för patienter med de två andra genotyper (C /T, T /T). Dessutom var signifikant högre luciferasaktiviteter observerats i pGL3-C-konstruktionen jämfört med pGL3-T-konstruktion.
Slutsatser
Denna studie ger det första beviset att variation på nt -443 i OPN promotorn ökar potentialen för gastric cancermetastas och efterföljande död i den kinesiska befolkningen.
Nyckelord
Osteopontin Magcancer Polymorphisms genetiska varianter metastas bakgrund
Gastric adenocarcinom fortfarande den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall i världen och står för 738,000 dödsfall årligen [1] . Gastric cancer är den tredje vanligaste cancerformen i Kina. Utvecklingen av magcancer förknippas främst med Helicobacter pylori
infektion [2], men andra riskfaktorer inkluderar en kost rik på salt, rökning, konsumtion av inlagda livsmedel, och specifika genetiska bakgrunder [3]. Det har visats att H. pylori
infektion är en oberoende riskfaktor som leder till ihållande kolonisering och kronisk inflammation i magslemhinnan, vilket ökar risken för att utveckla peptiska sår och magcancer [2, 4-6]. Det finns dock markerade interindividuella skillnader i graden av inflammation hos personer med H. pylori
infektion och kliniska konsekvenser bara utvecklas i ett litet antal gastric cancerfall. Multifaktoriella modeller tyder på att den genetiska mottaglighet på grund av specifika variant alleler i polymorfismer kan påverka resultaten av miljöexponering [7] Osteopontin (OPN).
Är ett utsöndrat vidhäftande phosphoglycoprotein som innehåller en funktionell Gly-Arg-Gly-Asp-Ser cellbindande sekvens [8]. The butik genen OPN har kartlagts till kromosom 4q24-Q25, och det har visat sig att OPN spelar en viktig roll i tumörmetastas [9]. OPN har visat sig uttryckas i tumörceller och i det omgivande stroma av många humana cancerformer, såsom kolon, bröst, lunga, magsäck, livmoderslemhinnan, och sköldkörtel, vilket ger en länk med malign invasion [10-13]. Tidigare studier visade att OPN ofta är överuttryckt i human gastric cancer [14], och att uttryck av OPN-mRNA var signifikant högre i gastriska cancervävnader jämfört med icke-tumörvävnader.
Flera polymorfier har beskrivits för OPN
genen, varav en del är associerade med oligoarticular (eller pauciarticular) juvenil idiopatisk artrit, njursten, och kronisk hepatit C [15-18]. En nyligen genomförd studie [19] rapporterade att patienter med G /G genotyp vid nt -156 i OPN promotorn oftare diagnosen framskridet stadium (IIIB-IV) icke-småcellig lungcancer (NSCLC) än de med andra genotyper, medan en annan rapport föreslog att OPN polymorfism kan vara genetisk faktor för hepatit B virus clearance och hepatocellulär cancer förekomst [20].
det finns för närvarande inga publicerade studier som bedömer förhållandet mellan OPN
genetisk polymorfism och risken för magsäcks cancerutveckling. Därför är syftet med denna studie var att avgöra om en association föreligger mellan OPN polymorphisms och risken för magcancer i den kinesiska befolkningen.
Metoder
ämnen från 2005 till 2008, 310 obesläktade patienter med magcancer (GC grupp), rekryterades vid första Anslutna sjukhuset i Nanjing Medical University. Samtliga patienter var etniska hankineser invånare som hade histologiskt bekräftade magcancer. Kontrollgruppen (icke-GC-gruppen) bestod av ett slumpmässigt urval av 591 etniska hankineser från Jiangsu-provinsen. Efter skriftligt informerat samtycke, var alla deltagare uppmanas att lämna ett blodprov. Studien godkändes av den etiska kommittén i första Anslutna Nanjing Medical University (É0-SR-073).
Innan sekvensering av genotyper i OPN
promotorn använde vi SPSS v10.0 (SPSS, Inc ., Chicago, IL, USA) programvara för att slumpmässigt välja 200 GC patienter och kön och ålder matcha dem till 200 slumpmässigt utvalda kontroller av icke-GC gruppen. Vi utvärderade alla patienter och kontroller för H. pylori
med hjälp av en indirekt fast fas immunokromatografisk (ICM) analys för att undersöka förekomsten av IgG-antikroppar mot H. pylori
(Genelabs Diagnostics, Singapore). Denna testmetod har tidigare validerats i vårt labb med en noggrannhet på 92,3% [21].
Genomisk DNA från kontroller och gastric cancerpatienter extraherades från etylendiamintetraättiksyra (EDTA) -anticoagulated perifert blod enligt den traditionella proteinas K och fenol kloroformaddukt metod, och sälja lagrades vid -70 ° C. Analys av polymorfismer i den regulatoriska regionen OPN
OPN-66, -156 (rs17524488) och -443 (rs11730582) varianter genotypades genom direkt sekvensering av den sens- och antisenssträngar följande polymeraskedjereaktionen (PCR) amplifiering av promotorregulatorregionen -473 till -3 (framåtriktad primer 5 '- CAA GCT ACT GCA TAC TCG AAA TCA CA-3 '; omvänd primer 5 '- ACA ACC AAG CCC TCC CAG AAT TTA-3 '), såsom tidigare beskrivits [19]. PCR utfördes med användning 50 ng DNA som mall under följande betingelser: 95 ° C under 10 min, därefter 36 cykler av 94 ° C under 30 s, en glödgningstemperatur under 60 s och 72 ° C under 60 s, med en slutlig förlängning vid 72 ° C under 15 min. Efter affinitetsmembranrening med användning av QIAquick Gel Extraction-kit (Qiagen, Carlsbad, CA, USA), var PCR-produkterna utsattes för cykelsekvensering med respektive framåt och bakåt primer med användning av en automatiserad ABI 3100 DNA-sekvenserare genom GeneCore Bio Technologies (Shanghai) .
Luciferasanalys med SNP vid nukleotid (nt) -443 i OPN promotorn sälja The 250 bp fragment av OPN promotorn (från -590 till -340) bär antingen T eller C-allelen syntetiserades genom Invitrogen och in uppströms av eldflugeluciferasgenen i pGL3-Enhancer plasmidvektor (Promega, USA) i separata förfaranden. Varje konstruktion bekräftades genom sekvensering. En serie av OPN-promotor-luciferas reporterkonstruktioner transfekterades transient in i de gastriska cancercellinjer MKN28 (Shanghai Institute of Digestive Disease) och SGC-7901 (Shanghai Cancer Institute), och transfektion genomfördes med Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) i enlighet med tillverkarens protokoll. De MKN28 och SGC-7901 cellinjer odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum. Aktiviteten hos de olika genotyp promotorer mättes med användning av Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA). Alla experiment upprepades i triplikat.
Statistisk analys
Statistisk analys utfördes med användning av SPSS 10,0 programvara. Kvantitativa variabler avgår från normalfördelningen, inklusive ålder, sammanfattades som medelvärde och standardavvikelse (SD). Jämförelse av ålder mellan fall och kontroller bedömdes med hjälp av en oberoende Student t
-test. Jämförelse av extra-gastriska tumörer, H. pylori
infektion, och genotyp frekvenser mellan fall och kontroller bedömdes med hjälp av en chitvåtest och Fishers exakta test. Överlevnad beräknades med Kaplan-Meier-metoden. All sannolikhet (P
) värden tvåsidiga och statistisk signifikans indikerades som P Hotel < 0.05.
Resultat
demografiska och kliniska egenskaperna hos patienterna
magcancer (GC) bestod av 200 personer (64% manliga), med en medelålder på 56.29 ± 3,46 år. Kontrollen (icke-GC) bestod av 200 personer, varav 64% var män, med en medelålder på 55,67 ± 4,21 år (tabell 1). Det fanns inga signifikanta skillnader i fråga om fördelningen av ålder och kön samt H. pylori
seropositivitet. Clinicopathologic egenskaper hos patienter och kontroller visas i tabell 1.Table 1 clinicopathologic egenskaper hos patienter med magcancer cancer och friska kontroller
Karakteristiskt
Nej av patienter eller kontroller
P
Cases (n)
Kontroll (n)
nr
200
200
Ålder, år Hotel > 0,05
Mean
56,29
55,67
Standardavvikelse
3,46
4,21
Range
63 65
Kön Hotel > 0,05
Man
130
130
Kvinna
70
70
Helicobacter pylori
infektion
0,12
Seronegativa
62
77
seropositiva
138
123
vaskulär invasion
Frånvaro
155 -
Presence
45 -
Lymfkörtel metastaser
frånvaro
80 -
Presence
120 -
levermetastaser
frånvaro
182 -
Presence
18 Omdömen -
Peritoneal spridnings
Frånvaro
172 -
Presence
28 -
TNM stadium -
IA
39 Omdömen -
IB
40 -
II
33 -
III
45 -
IV
43
-
SNP i promotorregionen av humant OPN-genen
Direkt sekvensering av DNA-fragment mellan nt -473 och nt -3 i patienter och ålders- och könsmatchade kontroller avslöjade 3 SNP i OPN promotorn, som ligger vid nt -156 [ ,,,0],GG /GG homozygoter, GG /G- (text utgår) heterozygoter, G- /G- homozygoter], nt -443 [CC homozygoter, CT heterozygoter, TT homozygoter] och nt -66 (Figur 1), som visas i tabell 2 . det fanns ingen signifikant skillnad i fördelningen av dessa SNP (nt -66, -156, -443) mellan GC patienter och kontroller. Fördelningen av genotyper för TNM stadier i magcancer visas i tabell 3. Fig 1 schematiskt diagram och sekvenseringsdata av den OPN-promotorn. Representativt värde för sekvenseringsanalys på promotorn. SNP nt -443 har följande alleler: CC, CT, och TT. Det finns en liten insättning på nt-156, som har tre alleler: G /G, G /GG, GG /GG. SNP nt -66 har endast en allel.
TT Tabell 2 Jämförelse av OPN promotor mellan gastric cancerpatienter och friska kontroller
Controls
Patienter

Magcancer
genotyper
n
n
P
LN (+)
LN (-)
P


-66
TT
200
200
1.00
124
76
1.00
-156
G/G
86
67
1.00
41
25
1.00
G/GG
78
92
0.064
57
36
0.92
GG/GG
36
41
0.18
25
16
0.91
-443
CC
22
15
1.00
8
8
1.00
CT
93
94
0.28
63
33
0.23
TT
85
91
0.22
53
35
0.45
Tabell 3 Fördelningen av genotyper för TNM steg i magcancer
TNMs av gastric cancer

Genotypes

IA

IB

II

III

IV

-66
TT
38
44
26
52
40
-156
G/G
16
16
13
20
19
G/GG
16
15
15
16
18
GG/GG
7
9
5
9
6
-443
CC
1
2
1
4
14
CT
17
19
19
19
19
TT
14
18
5
19
29
Men när det gäller tumör nod-metastaser TNM steg, fann vi att för SNP vid nt -443, bland patienter med CT genotypen fanns en signifikant skillnad mellan patienter med stegen II och IV (P Hotel < 0,01) och mellan steg IV och alla andra stadier (IA + IB + II + III, P =
0,04; tabell 4). På samma sätt, bland patienter med CC-genotypen vid nt -443 fanns en signifikant skillnad mellan patienter med stegen IV och steg I (IA + IB; P =
0,011) och mellan steg IV och alla andra stadier (IA + IB + II + III, P
= 0,012; tabell 4). Det fanns inga signifikanta skillnader mellan TNM stegen och de andra två SNP (nt -66 och nt -156) av OPN promotorn. Vi fann också något samband mellan SNP i OPN promotorn och lymfkörtel metastasis.Table 4 genotyp fördelningen av nt -443 i OPN promotorn genom magcancer TNM stadium
TNM stadier av magcancer

Genotyper
IA + IB
IV
P
II
IV
P
III
IV
P
IA + IB + II + III
IV
vid P


-443
TT
32
29
1.00
5
29
1.00
19
29
1.00
56
29
1.00
CT
36
19
0.16
19
19
< 0.01*
19
19
0.33
74
19
0.04*
CC
3
14
0.011*
1
14
0.98
4
14
0.18
8
14
0.012*
* Indikerar signifikant skillnad (P < 0,05).
Samband mellan genotyper i OPN promotorregionen och överlevnad
Kaplan-Meier beräkningar av olika genotyper vid nt -443 i OPN
promotorn visas i figur 2 . överlevnaden för patienter med C /C genotyp var betydligt lägre än överlevnaden för patienter med de två andra genotyper (C /T, T /T). Det fanns inga signifikanta samband mellan överlevnad och genotyper på andra platser (nt -156 och nt -66). Figur 2 Kaplan-Meier överlevnad är betydligt lägre i gastric patienter med C /C genotyp jämfört med de två andra genotyper vid nt -443 i OPN promotor cancer.
Effekt av -443 T → C polymorfism på promotoraktivitet
För att undersöka effekten av -443 T → C-promotorregionen polymorfism på transkription av OPN
genen, mätte vi promotoraktivitet med en Dual Luciferase reporter assay System och jämförde verksamhet -443C och -443 T alleler med hjälp av en övergående transfektion analys med MKN28 och SGC-7901 cellinjer. Såsom visas i figur 3, var signifikant högre luciferasaktiviteter genereras med pGL3-C-konstruktionen jämfört med pGL3-T-konstruktionen (P
= 0,001 för MKN28; P
= 0,021 för SGC-7901). Figur 3 Effekt av -443 T → C polymorfism på promotoraktivitet. Betydligt högre luciferasaktiviteter genererades av pGL3-C-konstruktionen jämfört med pGL3-T-konstruktion (P
= 0,001 för MKN28, P
= 0,021 för SGC-7901) katalog Diskussion
Montering. tyder på att OPN spelar en roll i regleringen av tumörmetastaser och att OPN uttryck är särskilt hög i metastaserande tumörer [22]. OPN överuttrycks i cancer som har en hög benägenhet för bildande av skelettmetastaser. I benmetastaser är OPN i allmänhet förknippas med gränssnittet mellan cancer och benytan, och detta verkar vara relaterat till en ökad ben resorptiv aktivitet av osteoklaster [23]. Dessutom är hög OPN uttryck i primärtumör i samband med tidig metastas och dåligt kliniskt utfall i human magsäckscancer och andra cancerformer [24-27]. Review, en ny studie föreslog att OPN promotorn i samband med icke-småcellig lungcancer [19]. I den aktuella studien har vi fokuserat på associering av dessa SNP med GC, och även fördelningen av genotyper i OPN
promotorn var ingen signifikant skillnad mellan GC patienter och friska kontroller, fanns det betydande skillnader i fördelningen av genotyper ( CC) vid nt -443 mellan patienter med stadium IV och steg i magcancer (IA + IB) och mellan steg IV och de kombinerade andra tre stadier av magcancer (IA + IB + II + III, tabell 4). Överlevnaden för patienter med C /C genotyp var betydligt lägre än överlevnaden för de två andra genotyper (C /T, T /T, Figur 3). Dessutom har signifikant högre luciferasaktiviteter genereras med pGL3-C-konstruktionen jämfört med pGL3-T-konstruktion. Reportergen analys har visat att den haplotypen -443C /-156 G /-66 T förknippas med betydligt bättre promotoraktivitet jämfört med fem andra allelvarianter testade [28]. En nyligen genomförd studie på melanommetastaser fann att de homozygota för -443C allelen uttryckte betydligt högre halter av OPN-mRNA jämfört med dem som var antingen heterozygot (CT) eller homozygot för -443 T-allelen [29]. Transkriptionsfaktor c-MYB binder till den region av OPN-promotorn i en allel-specifikt sätt och inducerar förhöjd aktivitet av -443C jämfört med -443 T OPN
promotor [30]. Sammantaget antyder dessa data att variationen på nt -443 i OPN promotorn spelar en roll i GC progression och metastasering, särskilt för CC genotyp vid nt -443 i OPN
promotorn. Huruvida polymorfism av OPN är relaterad till uttryck av OPN i cancer patienter förblir okänd trots. Överuttryck av OPN hittades i gastriska cancerprover i en tidigare studie [14]. Därför krävs ytterligare studier för att ytterligare belysa denna slutsats.
I den aktuella studien fann vi att CT genotyp vid nt -443 i OPN promotorn visade signifikanta skillnader mellan steg IV och steg II magcancer, och även mellan scen IV och andra stadier av magcancer (IA + IB + II + III), men inte mellan steg IV och stadium III eller steg I. den främsta orsaken till detta kan bero på det begränsade antalet patienter i varje undergrupp. Det är också möjligt att transkriptionsfaktorn c-MYB kan ha förstärkt aktiviteten av den region av OPN
promotor som innehöll CC eller CT-genotyper, men inte den andra genotyp (dvs TT) [29]. Dessa hypoteser kräver ytterligare utredning i större studier.
De nuvarande iska fynd i friska kontroller inte var identiska med tidigare fynd bland japanska och italienska kontrollpersoner [30, 31]. Även tidigare rapporter tyder på att höga OPN uttrycks på höga nivåer i GC [17], fann vi inget samband mellan de genotyper av OPN
promotorn med risk för GC. Emellertid har vi funnit etniska skillnader i SNP flera värdgener i GC patienter [30, 31]. Därför kan föreliggande fynd inte gälla för alla populationer. Ändå, trots att det inte fanns något samband mellan OPN SNP och GC magcancer mottaglighet eller svårighetsgrad i kinesiska patienter, gör våra resultat tyder på att det finns ett samband med metastaser i GC.
Slutsats
Sammanfattningsvis är detta den första studien av OPN genetiska polymorfismer och risken för GC i en kinesisk befolkning. Vi har visat att genetiska polymorfismer vid -443 i OPN-promotorn är associerade med metastas och efterföljande död av GC. Därför kan dessa fynd erbjuda en metod för att förutsäga det kliniska resultatet av GC patienter. Dock ytterligare studier för att använda en större kohort av patienter för att bekräfta dessa fynd.
Notes
Fujun Zhao, Xiaoyi Chen bidragit lika för detta arbete.
Förklaringar
Tack
Detta arbete stöddes av Naturvetenskap fonder i Kina (nr 81.072.032 och 30.770.992). Författarna tackar Medjaden Bioscience Limited för korrekturläsning manuskriptet.
Författarnas ursprungliga inlämnade handlingarna Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 12885_2012_3447_MOESM1_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 1 12885_2012_3447_MOESM2_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 2 12885_2012_3447_MOESM3_ESM.tiff Författaroriginalfilen för figur 3 konkurrerande intressen
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Författarnas bidrag
ZF deltog i utformningen av studien och utförde den statistiska analysen, CX utförde Luciferasanalys, MT, HB tänkt av studien, och particpated i sin design och samordning, ZZ, ZG deltog i utformningen av studien. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Transkriptionsfaktom FOXO4 nedregleras och hämmar tumörtillväxt och metastaser i gastric cancer
• Fas I-studie av imatinib, cisplatin och 5-fluorouracil eller capecitabin i avancerad matstrupen och magsäcken adenocarcinoma