Los polimorfismos genéticos en el promotor de la osteopontina aumenta el riesgo de metástasis a distancia y la muerte en pacientes chinos con polimorfismos genéticos cancer

gástrica en el promotor de la osteopontina aumenta el riesgo de metástasis a distancia y la muerte en pacientes chinos con cáncer gástrico
Resumen Antecedentes

In vitro e in vivo

estudios han sugerido que la osteopontina (OPN) se asocia con muchos tipos de cáncer. Sin embargo, no hay estudios han informado de la incidencia de los polimorfismos de OPN y el riesgo de cáncer gástrico. El objetivo de este estudio fue investigar la asociación entre polimorfismos de OPN y cáncer gástrico en una población de pacientes chinos.
Métodos
Tres variantes genéticas en el promotor de OPN se genotipo mediante secuenciación directa en 200 pacientes con cáncer gástrico y 200 de género y emparejados por edad controles sin cáncer. La curva de supervivencia de 4 años se calculó utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank para cada sitio de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). Se midió la actividad del promotor de la -443 T → C polimorfismo usando un ensayo de indicador de luciferasa dual.
Resultado
Para la variante en el nt -443 (CC), había una diferencia significativa entre el número de pacientes con estadio IV y aquellos con estadio I cáncer gástrico (IA + IB; P = 0,014
) y entre aquellos en estadio IV y todas las demás etapas del cáncer gástrico (IA + IB + II + III, p = 0,02
). Para la variante en el nt -443 (CT), no hubo una diferencia significativa entre el número de pacientes con cáncer gástrico en estadio IV y aquellos con la etapa II (P = 0,013
). Las tasas de supervivencia para los pacientes con el genotipo C /C fueron significativamente inferiores a los de los pacientes con los otros dos genotipos (C /T, T /T). Por otra parte, se observaron actividades de luciferasa significativamente más altos en la construcción pGL3-C en comparación con el constructo de pGL3-T.
Conclusiones
Este estudio proporciona la primera evidencia de que la variación en el nt -443 en el promotor de OPN aumenta el potencial de gástrico metástasis del cáncer y la posterior muerte en la población china.
Palabras clave
osteopontina cáncer gástrico polimorfismos genéticos variantes metástasis Antecedentes
adenocarcinoma gástrico sigue siendo la segunda causa de muerte por cáncer en todo el mundo, lo que representa 738.000 muertes al año [1] . El cáncer gástrico es el tercer cáncer más común en China. El desarrollo de cáncer gástrico se asocia predominantemente con la infección por Helicobacter pylori
[2], pero otros factores de riesgo incluyen una dieta alta en sal, el tabaquismo, el consumo de alimentos en vinagre, y las bases genéticas específicas [3]. Se ha mostrado que H. pylori
infección es un factor de riesgo independiente que conduce a la colonización persistente y la inflamación crónica de la mucosa gástrica, lo que aumenta el riesgo de desarrollar úlcera péptica y cáncer gástrico [2, 4-6]. Sin embargo, existen marcadas diferencias interindividuales en el grado de inflamación entre las personas con infección por H. pylori
, y las consecuencias clínicas sólo se desarrollan en un pequeño número de casos de cáncer gástrico. modelos multifactoriales sugieren que la susceptibilidad genética debido a alelos variantes específicas de polimorfismos puede afectar a los resultados de la exposición del medio ambiente [7].
La osteopontina (OPN) es una phosphoglycoprotein adhesiva secretada que contiene un funcional Gly-Arg-Gly-Asp-Ser de células de unión a secuencia [8]. El Sitio gen OPN se ha mapeado en el cromosoma 4q24-q25, y se ha demostrado que la OPN juega un papel importante en la metástasis tumoral [9]. OPN se ha demostrado que se expresa dentro de las células tumorales y en el estroma circundante de numerosos cánceres humanos, como de colon, de mama, pulmón, estómago, endometrio, y la tiroides, proporcionando un enlace con la invasión maligna [10-13]. Estudios anteriores demostraron que OPN está frecuentemente sobreexpresado en el cáncer gástrico humano [14], y que la expresión de OPN mRNA fue significativamente mayor en los tejidos de cáncer gástrico en comparación con los tejidos no tumorales.
Varios polimorfismos se han descrito para la OPN
genes, algunos de los cuales están asociados con oligoarticular (o pauciarticular) artritis idiopática juvenil, nefrolitiasis, y la hepatitis C crónica [15-18]. Un estudio reciente [19] informó de que los pacientes con un genotipo G /G en el nucleótido -156 en el promotor de OPN fueron más frecuentemente diagnosticados en estadios avanzados (IIIB-IV) no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) que aquellos con otros genotipos, mientras que otro informe sugiere que el polimorfismo de OPN podría ser el factor genético para la eliminación del virus de la hepatitis B y el carcinoma hepatocelular ocurrencia [20].
Actualmente no hay estudios publicados que evalúan la relación entre OPN
polimorfismos genéticos y el riesgo de cáncer gástrico el desarrollo del cáncer. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue determinar si existe una asociación entre polimorfismos de OPN y el riesgo de cáncer gástrico en la población china.
Métodos Sujetos
De 2005 a 2008, 310 pacientes no relacionados con el cáncer gástrico (CG grupo), se inscribieron en el primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Nanjing. Todos los pacientes eran étnicos residentes chinos Han que habían confirmado histológicamente de adenocarcinoma gástrico. El grupo de control (el grupo de no-GC) consistió en una muestra aleatoria de 591 étnicos chinos Han de la provincia de Jiangsu. Después de dar su consentimiento informado por escrito, se pidió a todos los participantes para proporcionar una muestra de sangre. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Primera Afiliado de la Universidad Médica de Nanjing (É0-SR-073).
Antes de la secuenciación de los genotipos en el OPN
promotor, se utilizó el programa SPSS v10.0 (SPSS, Inc. ., Chicago, IL, EE.UU.) de software para seleccionar al azar a 200 pacientes con cáncer gástrico y el género y la edad de ellos-que coincida con 200 controles seleccionados al azar del grupo sin fines de GC. Se evaluaron todos los pacientes y controles para H. pylori
usando un ensayo indirecto inmunocromatográfico en fase sólida (ICM) para investigar la presencia de anticuerpos IgG contra H. pylori gratis (Genelabs Diagnostics, Singapur). Este método de ensayo fue validado previamente en nuestro laboratorio con una precisión de 92,3% [21].
ADN genómico de los controles y los pacientes con cáncer gástrico se extrajo a partir de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) -anticoagulated sangre periférica de acuerdo con la proteinasa K y fenol tradicional -cloroformo método, y se almacena a -70 ° C.
Análisis de polimorfismos en la región reguladora de OPN Francia el OPN-66, -156 (rs17524488), y -443 (rs11730582) variantes se genotipo por secuenciación directa de la amplificación cadenas sentido y antisentido siguientes reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de la región reguladora del promotor -473 a -3 (cebador directo 5 '- CAA GCT ACT ACG TAC TCG AAA TCA CA-3 '; cebador inverso 5 '- ACA CAC AAG CCC TCC CAG AAT TTA-3 '), tal como se describe anteriormente [19]. PCR se realizó utilizando ADN 50 ng como molde en las siguientes condiciones: 95 ° C durante 10 min, luego 36 ciclos de 94 ° C durante 30 s, una temperatura de recocido durante 60 s, y 72 ° C durante 60 s, con una extensión final a 72 ° C durante 15 min. Después de la purificación membrana de afinidad utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen, Carlsbad, CA, EE.UU.), los productos de PCR se sometieron a secuenciación de ciclo con la respectiva hacia adelante y el cebador inverso utilizando un ABI 3100 secuenciador de ADN automatizado por GeneCore Bio Technologies (Shanghai China) .
ensayo de la luciferasa con SNP en el nucleótido (nt) -443 en el promotor de OPN
los 250 bp fragmentos del promotor de OPN (-590 a -340) que llevan ya sea el alelo T o C fueron sintetizados por Invitrogen y insertado corriente arriba del gen de luciferasa de luciérnaga en el plásmido vector pGL3-Enhancer (Promega, EE.UU.) en procedimientos separados. Cada construcción se confirmó por secuenciación. Una serie de OPN promotor-luciferase reportero construcciones se transfectaron transitoriamente en las líneas celulares de cáncer gástrico MKN28 (Instituto de Shanghai de Enfermedades Digestivas) y SGC 7901-(Instituto de Cáncer de Shanghai), y transfección se realizó con Lipofectamine 2000 reactivo (Invitrogen) de acuerdo con la protocolo del fabricante. Las líneas de células MKN28 y SGC-7901 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor 10%. La actividad de los diferentes promotores genotipo se midió usando el sistema de ensayo de luciferasa reportero (Promega, EE.UU.). Todos los experimentos se repitieron por triplicado.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 10.0. Las variables cuantitativas que salen de la distribución normal, incluyendo la edad, se resumen como media y desviación estándar (SD). La comparación de la edad entre los casos y controles se evaluó mediante t-test
de un estudiante independiente. La comparación de los tumores extra-gástricas, H. pylori
infección y genotipo frecuencias entre casos y controles se evaluó mediante una prueba de chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher. La supervivencia se calculó mediante el método de Kaplan-Meier. Todos los valores de probabilidad (P)
fueron de dos colas y significación estadística se indican como P Hotel < 0.05.
Resultados
demográfica y las características clínicas de los pacientes Francia El cáncer gástrico (CG) grupo estaba formado por 200 individuos (64% varones), con una edad media de 56.29 ± 3,46 años. El grupo de control (no-GC) consistió en 200 individuos, de los cuales el 64% eran hombres, con una edad media de 55.67 ± 4,21 años (Tabla 1). No hubo diferencias significativas en cuanto a la distribución de la edad y el género, así como H. pylori
seropositividad. características clínico-patológicas de los pacientes y los controles se muestran en la Tabla 1 1.Table características clínico-patológicas de los pacientes con carcinoma de cáncer gástrico y controles sanos
Característica Nº
de los pacientes o los controles
P
casos (n) guía empresas de control (n)
Nº
200 200

Edad, años Hotel > 0.05
significan
56.29 55.67

desviación estándar
3,46 4,21

Rango
63
65
Género Hotel > 0.05
Hombre
130 130

Mujer
70
70
Helicobacter pylori infección

0,12
seronegativa
62 77

Seropositivo
138 123

invasión vascular
Ausencia
155
- Presencia
45 -
metástasis de ganglios linfáticos
ausencia
80
- Presencia
120 -
hígado metástasis
ausencia
182
- Presencia
18 CD -
peritoneal difusión
Ausencia
172
- Presencia
28 -
estadio TNM -
IA
39 CD -
IB
40 -
II
33 -
III
45 -
IV
43 CD -
SNP en la región promotora del gen de OPN humana
la secuenciación directa de fragmentos de ADN entre -473 y nt nt -3 en pacientes y controles por edad y sexo revelaron 3 SNP en el promotor de OPN, que se encuentra en el nt -156 [ ,,,0],GG /homocigotos GG, GG /G- (supresión), heterocigotos G /G- homocigotos], [nt -443 homocigotos CC, CT heterocigotos, homocigotos TT], y nt -66 (Figura 1), como se muestra en la Tabla 2 . no hubo diferencia significativa en la distribución de estos SNPs (nt -66, -156, -443) entre los pacientes y los controles de GC. La distribución de los genotipos para estadios TNM en el cáncer gástrico se muestra en la Tabla 3. La Figura 1 Diagrama de los datos de secuenciación y esquemáticos del promotor de OPN. cifra representativa del análisis de la secuencia del promotor. El SNP nt -443 tiene las siguientes alelos: CC, CT y TT. Hay una pequeña inserción en el nt-156, que tiene tres alelos: G /G, G /GG, GG /GG. El SNP nt -66 tiene un solo alelo:. TT
Tabla 2 Comparación de OPN promotor entre los pacientes con cáncer gástrico y controles sanos
Controles
pacientes

El cáncer gástrico
genotipos
n
n
P
LN (+) guía empresas LN (-)
P


-66
TT
200
200
1.00
124
76
1.00
-156
G/G
86
67
1.00
41
25
1.00
G/GG
78
92
0.064
57
36
0.92
GG/GG
36
41
0.18
25
16
0.91
-443
CC
22
15
1.00
8
8
1.00
CT
93
94
0.28
63
33
0.23
TT
85
91
0.22
53
35
0.45
Tabla 3 La distribución de los genotipos para los estadios TNM en el cáncer gástrico Estados Unidos La TNMS de gástrica cancer

Genotypes

IA

IB

II

III

IV

-66
TT
38
44
26
52
40
-156
G/G
16
16
13
20
19
G/GG
16
15
15
16
18
GG/GG
7
9
5
9
6
-443
CC
1
2
1
4
14
CT
17
19
19
19
19
TT
14
18
5
19
29
Sin embargo, con respecto a estadios TNM tumor de nodo de metástasis, se encontró que para el SNP en el nt -443, entre los pacientes con el genotipo CT, había una diferencia significativa entre los pacientes con las etapas II y IV (P
< 0,01) y entre el estadio IV y todas las demás etapas (IA + IB + II + III, p = 0,04
; Tabla 4). Del mismo modo, entre los pacientes con el genotipo CC en el nt -443, había una diferencia significativa entre los pacientes con las etapas IV y de la etapa I (IA + IB; P =
0,011) y entre la etapa IV y todas las demás etapas (IA + IB + II + III; P = 0,012
; Tabla 4). No hubo diferencias significativas entre los estadios TNM y los otros dos SNPs (nt -66 y nt -156) del promotor de OPN. También se encontró ninguna asociación entre los SNPs en el promotor y los ganglios linfáticos de OPN metastasis.Table 4 La distribución de los genotipos de nt -443 en el promotor de OPN por gástrica TNM cáncer en etapa
Los estadios TNM de cáncer gástrico
Los genotipos

IA + IB
IV
P
II
IV
P
III
IV
P
IA + IB + II + III
IV

P


-443
TT
32
29
1.00
5
29
1.00
19
29
1.00
56
29
1.00
CT
36
19
0.16
19
19
< 0.01*
19
19
0.33
74
19
0.04*
CC
3
14
0.011*
1
14
0.98
4
14
0.18
8
14
0.012*
* Indica una diferencia significativa (P < 0,05).
Las asociaciones entre los genotipos en la región promotora de OPN y la supervivencia
estimaciones de Kaplan-Meier de diferentes genotipos en el nt -443 en el promotor de OPN
se muestran en la Figura 2 . las tasas de supervivencia para los pacientes con el genotipo C /C fueron significativamente menores que las tasas de supervivencia para los pacientes con los otros dos genotipos (C /T, T /T). No se encontraron asociaciones significativas entre la supervivencia y genotipos en los otros sitios (nt -156 y -66 nt). Figura 2 Kaplan-Meier de supervivencia es significativamente menor en pacientes con cáncer gástrico con el genotipo C /C en comparación con los otros dos genotipos en nt -443 en el promotor de OPN.
Efecto del polimorfismo -443 T → C en la actividad del promotor
Para examinar el efecto de la -443 T → C polimorfismo región promotora de la transcripción de la OPN
génica, se midió la actividad de promotor con una luciferasa Dual Reporter sistema de ensayo y se compararon las actividades de la -443C y -443 T alelos utilizando un ensayo de transfección transitoria con la líneas de células SGC-7901 MKN28 y. Como se muestra en la Figura 3, las actividades de luciferasa significativamente más altos se han generado con el constructo de pGL3-C en comparación con el constructo de pGL3-T (P = 0,001 para
MKN28; P = 0,021 para
SGC-7901). Figura 3 Efecto de la -443 T → C polimorfismo en la actividad del promotor. Significativamente más altas actividades de luciferasa se generaron por la construcción pGL3-C en comparación con el constructo de pGL3-T (P = 0,001 para
MKN28; P = 0,021 para
SGC-7901)
Discusión
de montaje. la evidencia sugiere que OPN juega un papel en la regulación de la metástasis de tumores y que la expresión de OPN es particularmente alta en tumores metastásicos [22]. OPN se sobreexpresa en los cánceres que tienen una alta propensión a la formación de las metástasis óseas. En las metástasis óseas, OPN se asocia generalmente con la interfaz entre el carcinoma y la superficie del hueso, y esto parece estar relacionado a una mayor actividad de resorción ósea por los osteoclastos [23]. Por otra parte, la alta expresión de OPN en el tumor primario se asocia con metástasis temprana y pobre resultado clínico en cáncer gástrico humano y otros tipos de cáncer [24-27].
Un estudio reciente sugiere que el promotor de OPN se asoció con NSCLC [19]. En el presente estudio, se centró en la asociación de estos SNPs con GC, y aunque la distribución de genotipos en el OPN
promotor no fue significativamente diferente entre los pacientes con cáncer gástrico y controles sanos, se observaron diferencias significativas en la distribución de los genotipos ( CC) en el nt -443 entre los pacientes con estadio IV y cáncer gástrico en estadio I (IA + IB) y entre en estadio IV y los combinados otras tres etapas de cáncer gástrico (IA + IB + II + III, Tabla 4). Las tasas de supervivencia para los pacientes con el genotipo C /C fueron significativamente menores que las tasas de supervivencia de los otros dos genotipos (C /T, T /T; Figura 3). Además, las actividades de luciferasa significativamente más altos se han generado con el constructo de pGL3-C en comparación con el constructo de pGL3-T. análisis del gen reportero ha demostrado que el haplotipo -443C /-156 G /T -66 está asociada con la actividad del promotor mejorado significativamente en comparación con otros cinco variantes alélicas probados [28]. Un estudio reciente sobre metástasis de melanoma encontró que los homocigotos para el alelo -443C expresaron niveles significativamente más elevados de mRNA de OPN en comparación con los que fueron ya sea heterocigoto (CT) o homocigotos para el alelo T -443 [29]. Factor de transcripción c-Myb se une a la región del promotor de OPN de una manera específica de alelo e induce una mayor actividad de la -443C en comparación con el T -443 OPN
promotor [30]. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la variación en el nt -443 en el promotor de OPN juega un papel en la progresión de la GC y la metástasis, especialmente para el genotipo CC en el nt -443 en el OPN
promotor. Si la polimorfismos de OPN está relacionado con la expresión de OPN en pacientes con cáncer siguen siendo desconocidos, aunque. La sobreexpresión de la OPN se encontró en las muestras de cáncer gástrico en un estudio anterior [14]. Por lo tanto, se necesitan estudios adicionales para aclarar aún más este hallazgo.
En el presente estudio, se encontró que el genotipo CT en el nt -443 en el promotor de OPN mostró diferencias significativas entre el estadio IV y la etapa II del cáncer gástrico, y también entre la etapa IV y otras etapas de cáncer gástrico (IA + IB + II + III), pero no entre en estadio IV y estadio III o I. la principal razón para esto puede ser debido al número limitado de pacientes en cada subgrupo. También es posible que el factor de transcripción c-Myb podría haber mejorado la actividad de la región de la OPN
promotor que contenía la CC o genotipos CT, pero no el otro genotipo (es decir, TT) [29]. Sin embargo, estas hipótesis requieren una mayor investigación en estudios más amplios. Empresas El presente hallazgos genómicos en los controles sanos no eran idénticos a los resultados anteriores entre los sujetos de control japoneses e italianos [30, 31]. Aunque los informes anteriores sugieren que la alta OPN se expresa en altos niveles en GC [17], no encontramos ninguna asociación entre los genotipos de la OPN promotor
con el riesgo de GC. Sin embargo, se han encontrado diferencias étnicas en los SNP de varios genes del huésped en pacientes con cáncer gástrico [30, 31]. Por lo tanto, los presentes hallazgos pueden no ser aplicables a todas las poblaciones. No obstante, aunque no hubo asociación entre los SNPs de OPN y GC susceptibilidad al cáncer gástrico o la gravedad de los pacientes chinos, nuestros hallazgos sugieren que existe una asociación con metástasis de GC.
Conclusión
En conclusión, este es el primer estudio de los polimorfismos genéticos de OPN y el riesgo de GC en una población china. Hemos demostrado que los polimorfismos genéticos en -443 en el promotor de OPN están asociados con la metástasis y la posterior muerte de GC. Por lo tanto, estos resultados pueden ofrecer un enfoque para predecir el resultado clínico de los pacientes con cáncer gástrico. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales utilizando una cohorte más grande de pacientes con el fin de confirmar estos hallazgos.
Notas
Fujun Zhao, Chen Xiaoyi contribuido igualmente a esta labor.
Declaraciones
Agradecimientos Este trabajo
recibió el apoyo de los Fondos Naturales Ciencias de china (Nº 81072032 y 30770992). Los autores agradecen a Medjaden Bioscience Limited para la corrección del manuscrito.
Los autores originales presentados archivos de imágenes
A continuación se presentan los enlaces a los archivos de los autores presentados original para imágenes. 'archivo original para la figura 1 12885_2012_3447_MOESM2_ESM.tiff autores 12885_2012_3447_MOESM1_ESM.pdf Autores archivo original para la figura 2 12885_2012_3447_MOESM3_ESM.tiff autores archivo original para la figura 3 Conflicto de intereses Los autores declaran
intereses en competencia.
Autores de las contribuciones
ZF participado en el diseño del estudio y realizó el análisis estadístico, CX llevó a cabo el ensayo de luciferasa, MT, HB concebido del estudio, y particpated en su diseño y coordinación, ZZ, ZG participó en el diseño del estudio. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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