Genetski polimorfizmi v promotorja osteopontinom povečuje tveganje za metastaze na daljavo in smrti pri kitajskih bolnikih z želodca cancer

genskih polimorfizmov v promotorja osteopontinom povečuje tveganje za metastaze na daljavo in smrti v kitajskih bolnikih z rakom želodca
Abstract
Ozadje
in vitro
in vivo
študije so pokazale, da je osteopontinom (OPN), povezane s številnimi vrstami raka. Vendar pa nobene študije poročali pojavnost OPN polimorfizmov in tveganje za raka želodca. Cilj te raziskave je bil ugotoviti povezavo med OPN polimorfizmov in rakom želodca v kitajski populaciji bolnikov.
Metod
tri genetske variante v promotor OPN so genotipizacijo z neposrednim zaporedja v 200 želodčnih bolnikih z rakom in 200 spola in starosti usklajene kontrole rakave bolezni. 4-letna krivulja preživetja je bila izračunana po metodi Kaplan-Meier, in v primerjavi s testom log-rang za vsako polimorfizma posameznih nukleotidov (SNP) strani. Merili smo aktivnost promotorja -443 T → C polimorfizma z uporabo dvojne luciferazno reporter testom.
Rezultat
Za varianto na nt -443 (CC), je bila velika razlika med številom bolnikov s stopnjo IV in tiste, ki imajo I. stopnjo raka želodca (IA + IB; P =
0,014) in med tistimi, ki z odpovedjo IV in vseh drugih fazah raka želodca (IA + IB + II + III; P =
0,02). Za varianto na nt -443 (CT), je bila velika razlika med številom bolnikov želodca z rakom, pri stadiju IV in tiste z faza II (P =
0,013). Stopnje preživetja pri bolnikih z genotipom C /C so bile bistveno manjše kot pri bolnikih z drugih dveh genotipov (C /T, T /T). Poleg tega so v konstrukta pGL3-C opazili bistveno višje luciferazne aktivnosti v primerjavi z konstrukta pGL3-T.
Sklepe
Ta študija zagotavlja prvi dokaz, da je sprememba na nt -443 v promotorja OPN poveča možnosti za želodca metastaza raka in posledično smrt kitajskega prebivalstva.
Ključne besede
osteopontinom rak želodca polimorfizmi Genetic variante metastasis Ozadje
adenokarcinomom želodca ostaja drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka po vsem svetu, kar predstavlja 738,000 smrti letno [1] . Rak želodca je tretji najpogostejši rak na Kitajskem. Razvoj raka želodca je povezana predvsem s Helicobacter pylori
okužbe [2], ampak tudi drugi dejavniki tveganja vključujejo prehrana z veliko soli, kajenje, uživanje kisle hrane, in posebne genetske ozadja [3]. Dokazano je, da je H. pylori
infekcija neodvisen dejavnik tveganja, ki vodi do trdovratne kolonizacijo in kronično vnetje želodčne sluznice, s čimer se poveča tveganje za razvoj peptične razjede in raka želodca [2, 4-6]. Vendar pa obstajajo označene inter-individualne razlike v obsegu vnetja med osebami s H. pylori
okužbe in klinične posledice razvijati le v majhnem številu primerov raka želodca. Multifaktorska modeli kažejo, da lahko genska odpornost zaradi posebnih variante alelov v polimorfizmov vpliva na rezultate izpostavljenosti okolja [7].
Osteopontinom (OPN) je secernirana lepilo phosphoglycoprotein, ki vsebuje funkcionalne Gly-Arg-Gly-Asp-Ser celica za vezavo sekvenca [8]. OPN
gen je preslikan v kromosomu 4q24-Q25, in izkazalo se je, da ima OPN pomembno vlogo pri tumorja metastaz [9]. OPN Dokazano je, da se izrazi v tumorskih celicah in v okoliški strome številnih človeških rakavih obolenj, kot so debelega črevesa, dojk, pljuč, želodca, endometrija, in ščitnice, ki zagotavlja povezavo z malignim invazije [10-13]. Prejšnje študije so pokazale, da je OPN pogosto izraženi pri človeškega raka želodca [14], in da je izraz OPN mRNA je bila bistveno višja v želodčnih tkivih raka v primerjavi z ne-tumorskih tkivih.
Na več polimorfizmov so opisani za OPN
gen, od katerih so nekateri povezana z oligoartikularni (ali pauciarticular) juvenilni idiopatski artritis, ledvičnimi kamni in kroničnega hepatitisa C [15-18]. Nedavna študija [19], so poročali, da so bolniki z G /G genotip na nt -156 v promotorja OPN pogosteje diagnosticirali faza (IIIB-IV) nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC), kot tiste z drugimi genotipov, medtem ko drugi poročilu predlagal, da bi bilo OPN polimorfizem genetski dejavnik za hepatitis B virusa min in jetrnih celic karcinoma pojavu [20].
trenutno ni objavljenih študij, ki ocenjujejo razmerje med OPN
genetskih polimorfizmov in nevarnost želodca razvoj raka. Zato je bil namen te raziskave ugotoviti, ali obstaja povezava med OPN polimorfizmov in tveganje za raka želodca v kitajskega prebivalstva.
Metode
Predmeti Od leta 2005 do leta 2008, 310 nepovezanih bolniki z rakom želodca (GC skupina), je bilo vpisanih v prvi odvisnimi bolnišnici Nanjing Medical University. Vsi bolniki so bili etnični Han kitajski prebivalci, ki so histološko potrjeni adenokarcinomom želodca. Kontrolna skupina (brez GC skupina) sestavljena iz naključnega vzorca 591 etničnih Han Kitajcev iz province Jiangsu. Po tem pisno privolitev, so bili vsi udeleženci zahteva, da predloži vzorec krvi. Ta študija je odobril Odbor za etiko prve pridružen Nanjing Medical University (É0-SR-073).
Pred zaporedja genotipe v OPN
promotor, smo uporabili SPSS v10.0 (SPSS, Inc ., Chicago, IL, ZDA) programsko opremo za naključno izbrali 200 bolnikov GC in na spol in njihovo starost ujemajo 200 naključno izbranih kontrol ne-GC skupine. ocenili smo vsi bolniki in kontrole za H. pylori
z uporabo posredne trdna faza imunokromatografski (ICM) metodo za preiskavo na prisotnost protiteles IgG na H. pylori
(Genelabs Diagnostics, Singapur). Ta metoda je bila predhodno potrjena v našem laboratoriju z natančnostjo 92,3% [21].
Genomske DNK iz nadzora in bolnikov z rakom želodca je bila vzeta iz etilendiamintetraocetna kislina (EDTA) -anticoagulated periferne krvi po tradicionalnem proteinaze K in fenola -chloroform način, in shranili pri -70 ° C.
Analiza polimorfizmov v ureditvenem območju OPN
OPN-66, -156 (rs17524488) in -443 (rs11730582) variante so genotipizacijo z neposrednim zaporedja občutek in anti-občutek niti naslednje verižne reakcije s polimerazo (PCR) ojačanje promotorja regulatorno regijo -473 do -3 (naprej primer 5 '- CAA GCT ACT GCA TAC TCG AAA TCA CA-3 '; reverse primer 5 '- ACA ACC AAG CCC TCC CAG AAT TTA-3 "), kot je opisano zgoraj [19]. PCR smo izvedli z uporabo 50 ng DNA kot šablono pod naslednjimi pogoji: 95 ° C za 10 minut, nato 36 ciklov 94 ° C za 30 sekund, pri temperaturi žarjenja za 60 sekund in 72 ° C za 60 sekund, pri čemer končna razširitev pri 72 ° C 15 min. Po afinitetno čiščenje membrane s pomočjo QIAquick Gel ekstrakcijo kit (Qiagen, Carlsbad, CA, ZDA), ki so bili PCR produkti podvrženi sekvenciranje cikla z zadevnimi naprej in nazaj premaz z uporabo avtomatskega ABI 3100 DNA sekvencer z GeneCore Bio Technologies (Shanghai Kitajska) .
luciferazni test s SNP na nukleotida (nt) -443 v promotor OPN
so med 250 bp fragmenti promotorja OPN (od -590 do -340), ki izvajajo bodisi alel T ali C sintetizirajo Invitrogen in vstavi gorvodno od kresničkino luciferazno gena v pGL3-Enhancer plazmida vektor (Promega, ZDA) v ločenih postopkih. Vsak konstrukt je potrdil sekvenciranje. Niz OPN promotor-luciferaza novinar konstrukti so bili začasno transfektirali v želodčni rak celičnih linij MKN28 (Shanghai Institute prebavnih bolezni) in SGC-7901 (Shanghai Cancer Institute), in transfekciji smo izvedli z Lipofectamine 2000 reagentom (Invitrogen) glede na proizvajalca protokol. Celične linije MKN28 in GSS-7901 smo kultivirali v mediju Dulbeccovem modificiranem Eagle je (DMEM), dopolnjenem z 10% toplotno inaktiviran govejega seruma fetusa. Aktivnost različnih promotorjev genotipov smo merili z uporabo luciferazno reporterskega testa sistem (Promega, ZDA). Vse poskuse smo ponovili v treh izvodih.
Statistična analiza
Statistična analiza je bila opravljena s pomočjo SPSS 10.0 programske opreme. Kvantitativne spremenljivke, ki odstopajo od normalne porazdelitve, vključno s starostjo, so povzeti kot povprečje in standardni odklon (SD). Primerjava starosti od primerov in kontrol, je bila ocenjena s pomočjo neodvisnega Studentov t
-test. Primerjava zunaj želodčnih tumorjev, H. pylori
okužbe, in genotipov med primerov in kontrol, je bila ocenjena s pomočjo hi-kvadrat test ter Fisherjev test. Preživetje je bila izračunana po metodi Kaplan-Meier. Vse vrednosti verjetnosti (P ​​
) sta bila dva-repa in statistična značilnost je bila navedena kot P
< 0,05.
Rezultati
demografskih in kliničnih značilnosti bolnikov
rakom želodca (GC), skupina je bila sestavljena iz 200 posameznikov (64% moških), s povprečno starostjo 56.29 ± 3,46 let. (Ne-GC) Kontrolno skupino je sestavljalo 200 posameznikov, od tega je bilo 64% moških, s povprečno starostjo 55.67 ± 4,21 let (tabela 1). Ni bilo bistvenih razlik v smislu porazdelitve starosti in spola, kot tudi H. pylori
seropozitivnosti. Clinicopathologic značilnosti bolnikov in kontrol, so prikazani v tabeli 1.Table 1 Clinicopathologic značilnosti bolnikov z želodčnega raka raka in zdravih kontrolah
karakterističen
No. bolnikov ali nadzora
P

primerov (n)
Control (n)
No.
200
200
starost, leta
> 0.05
Povprečna
56.29
55.67
Standardni odklon
3.46
4.21
Območje
63
65
Spol
> 0.05
Male
130
130
Moški
70
70
Helicobacter pylori
okužba
0,12
Seronegativni
62
77
Seropozitivni
138
123
vaskularna invazija
odsotnosti
155 -
prisotnosti
45 -
limfnega vozla metastaze
odsotnost
80 -
prisotnosti
120 -
jetrne metastaze
odsotnost
182 -
prisotnosti
18
-
Peritonealna razširjanje
Odsotnost
172 -
prisotnosti
28 -
fazi TNM -
IA
39
-
IB
40 -
II
33 -
III
45 -
IV
43
-
SNP v promotorski regiji človeškega OPN gena
Neposredna zaporedja fragmentov DNK med nt -473 in nt -3 pri bolnikih in po starosti in spolu kontrol je pokazala 3 SNP v promotor OPN, ki se nahaja na nt -156 [ ,,,0],GG /GG homozigoti, GG /g- (črtano) heterozigoti, G /g- homozigoti] nt -443 [CC homozigoti, CT heterozigoti, TT homozigoti], in nt -66 (slika 1), kot je prikazano v tabeli 2 . ni bilo bistvene razlike v distribuciji teh SNP (nt -66, -156, -443) med GC bolnikov in kontrol. Porazdelitev genotipov za TNM fazah raka želodca, je prikazana v tabeli 3. Slika 1: Shematski prikaz in zaporedja podatkov promotor OPN. Predstavnik podatek za analizo zaporedja na promotor. SNP nt -443 ima naslednje alelov: CC, CT in TT. Obstaja majhna vstavljanje na nt-156, ki ima tri alele: G /G, G /GG, GG /GG. SNP nt -66 ima samo en alel. TT
Tabela 2 Primerjava OPN promotorja med bolniki želodca z rakom in zdravih kontrolah
Controls
Bolniki

rak želodca
genotipov Poslovni
n
n
P
LN (+)
LN (-)
P


-66
TT
200
200
1.00
124
76
1.00
-156
G/G
86
67
1.00
41
25
1.00
G/GG
78
92
0.064
57
36
0.92
GG/GG
36
41
0.18
25
16
0.91
-443
CC
22
15
1.00
8
8
1.00
CT
93
94
0.28
63
33
0.23
TT
85
91
0.22
53
35
0.45
Tabela 3 Porazdelitev genotipov za TNM faze pri bolnikih z rakom želodca
TNMs iz želodca cancer

Genotypes

IA

IB

II

III

IV

-66
TT
38
44
26
52
40
-156
G/G
16
16
13
20
19
G/GG
16
15
15
16
18
GG/GG
7
9
5
9
6
-443
CC
1
2
1
4
14
CT
17
19
19
19
19
TT
14
18
5
19
29
Vendar pa glede tumor-node-metastaze stopnje TNM, smo ugotovili, da je med bolniki s CT genotipa, se je za SNP na nt -443 velika razlika med bolniki s stopnjami II in IV (P
< 0,01) ter med stadiju IV in vseh drugih fazah (IA + IB + II + III; P =
0,04; tabela 4). Prav tako so med bolniki z genotipom CC na nt -443, je bila velika razlika med bolniki z stopnjah IV in fazi I (IA + IB; P =
0,011) ter med stadijem IV in vseh drugih fazah (IA + IB + II + III; P
= 0,012; tabela 4). Ni bilo bistvenih razlik med fazami TNM in druga dva SNP (nt -66 in nt -156) promotorja OPN. Prav tako ugotovila nobene povezave med SNP v OPN promotorja in bezgavk metastasis.Table 4. Porazdelitev genotip nt -443 v promotorja OPN z želodčno rak TNM fazi
TNM fazah želodčnega raka

genotipi
IA + IB
IV
P
II
IV
P
III
IV
P
IA + IB + II + III
IV

P


-443
TT
32
29
1.00
5
29
1.00
19
29
1.00
56
29
1.00
CT
36
19
0.16
19
19
< 0.01*
19
19
0.33
74
19
0.04*
CC
3
14
0.011*
1
14
0.98
4
14
0.18
8
14
0.012*
* Označuje značilno razliko (p < 0,05). Združenja
med genotipi v OPN promotorja regiji in preživetje
ocen Kaplan-Meier različnih genotipov na nt -443 v OPN
promotorja so prikazani na sliki 2 . stopnje preživetja pri bolnikih z genotipom C /C so bile znatno nižje od stopnje preživetja bolnikov z drugih dveh genotipov (C /T, T /T). na drugih mestih (nt -156 in nt -66) ni bilo pomembnih vezi med preživetjem in genotipov. Slika 2 Kaplan-Meier preživetje je bistveno nižja pri bolnikih želodčne rakom z genotipom C /C v primerjavi z drugima dvema genotipov na nt -443 v OPN promotorja.
Vpliv polimorfizma -443 T → C na promotorja dejavnosti
da preuči učinek T → C promotor regije polimorfizma na transkripcijo OPN
gena -443, smo izmerili promotor dejavnost z Dual Luciferaze Reporter Analiza sistema in glede dejavnosti -443C in -443 T alelov, ki uporabljajo prehodno transfekcije testa z MKN28 in SGC-7901 celičnih linijah. Kot je prikazano na sliki 3, so bile precej višje luciferazne aktivnosti ustvarjene s konstrukta pGL3-C v primerjavi s konstrukta pGL3-T (P
= 0.001 za MKN28; P
= 0,021 za SGC-7901). Slika 3 Vpliv -443 T → C polimorfizma na promotorsko aktivnostjo. Znatno so bile višje luciferazne aktivnosti ustvari konstrukta pGL3-C v primerjavi s konstrukta pGL3-T (P
= 0.001 za MKN28; P
= 0,021 za SGC-7901)
Pogovor
vgradnjo. podatki kažejo, da ima OPN vlogo pri regulaciji tumorske metastaze in da OPN izraz je še posebej visoka v metastatskih tumorjev [22]. OPN je prekomerno v rakih, ki imajo visoko nagnjenost za oblikovanje kostnih metastaz. V kostnih metastaz, je OPN na splošno povezana z vmesnikom med rakom in površino kosti, in se zdi, da so povezani s povečano Resorbcijsko dejavnosti kosti, ki jih osteoklastov [23]. Poleg tega je visoka OPN izraz primarnega tumorja povezana z zgodnjim metastaz in slabe kliničnim izidom v človeškega raka želodca in druge oblike raka [24-27].
Nedavna študija je nakazala, da je promotor OPN povezana z nedrobnoceličnim pljučnim rakom [19]. V tej študiji smo se osredotočili na pridružitvi teh SNP z GC, in čeprav porazdelitev genotipov v OPN
promotor ni pomembno razlikovala med GC bolnikih in zdravih kontrol, so bile razlike v porazdelitvi genotipov ( CC) pri nt -443 med bolniki z odpovedjo IV in I. stopnjo raka želodca (IA + IB) ter med stadijem IV in kombiniranih drugih treh fazah raka želodca (IA + IB + II + III, tabela 4). Stopnje preživetja pri bolnikih z genotipom C /C so bile znatno nižje od stopnje preživetja drugih dveh genotipov (C /T, T /T, slika 3). Poleg tega so bile bistveno višje luciferazne aktivnosti ustvarjene s konstrukta pGL3-C v primerjavi z konstrukta pGL3-T. Reporterski gen analiza je pokazala, da je haplotip -443C /-156 G /-66 T je povezana z bistveno izboljšano promotorja dejavnosti v primerjavi z drugimi petimi alelne variante testiranih [28]. Nedavna študija na melanoma metastaz ugotovila, da tisti homozigotna za alel -443C izrazil bistveno višje ravni OPN mRNA v primerjavi s tistimi, ki so bili bodisi heterozigotno (CT) ali homozigotna za alel -443 T [29]. Transkripcijski faktor c-myb veže na regijo promotorja OPN v alel-specifični način in inducira okrepljeno aktivnost -443C primerjavi s T OPN
-443 promotorja [30]. Če povzamemo, ti podatki kažejo, da ima sprememba na nt -443 v promotor OPN vlogo pri napredovanju GC in metastaz, še posebej za genotip CC na nt -443 v OPN
promotorja. Ali je polimorfizmi o OPN, povezane z izražanjem OPN pri bolnikih z rakom ostajajo neznani, čeprav. Prekomerno izražanje OPN je bilo v vzorcih z rakom želodca v prejšnji raziskavi [14]. Zato so potrebne dodatne študije za nadaljnjo pojasnitev te ugotovitve.
V tej raziskavi smo ugotovili, da CT genotip na nt -443 v promotor OPN je pokazala pomembne razlike med stadiju IV in fazo II raka želodca, in tudi med fazo IV in druge faze raka želodca (IA + IB + II + III), vendar ne med stadiju IV in faze III ali faze I. glavni razlog za to je lahko posledica omejenega števila bolnikov v vsaki podskupini. Možno je tudi, da bi se transkripcijskega faktorja c-myb izboljšano aktivnost regije OPN
promotor, ki ga vsebuje CC ali CT genotipov, ne pa tudi drugi genotip (tj TT) [29]. Vendar pa te hipoteze zahtevajo nadaljnje preiskave v večjih študij.
Obravnavanem genomske ugotovitve pri zdravih kontrolah ni bilo enake prejšnje ugotovitve med japonskimi in italijanske kontrolnimi osebami [30, 31]. Čeprav je prejšnja poročila kažejo, da je visoka OPN izražena v visokih koncentracijah pri GC [17], smo našli nobene povezave med genotipi OPN
promotor s tveganjem za GC. Vendar pa smo ugotovili, etnične razlike v SNP številnih gostiteljskih genov pri bolnikih GC [30, 31]. Zato so te ugotovitve ne veljajo za vse prebivalstvo. Kljub temu, čeprav ni bilo povezave med OPN SNP in GC želodca dovzetnosti za raka ali resnosti pri kitajskih bolnikih, se naše ugotovitve kažejo, da je zveza z metastazami GC.
Zaključek
Skratka, to je prva študija o OPN genetskih polimorfizmov in tveganjem GC v kitajskega prebivalstva. Pokazali smo, da so genski polimorfizem na -443 v promotorja OPN povezan z metastazami in kasnejše smrti GC. Zato lahko te ugotovitve ponujajo pristop za napovedovanje kliničnega izida bolnikov GC. Vendar pa so potrebne dodatne študije z uporabo večjega kohorte bolnikov, da bi potrdili te ugotovitve.
Opombe
Fujun Zhao, Xiaoyi Chen prav tako prispevali k temu delu.
Deklaracij
Potrditve
to delo je bila podprta z naravoslovja skladov Kitajske (št 81072032 in 30770992). Avtorji hvala Medjaden Bioscience Limited za lektoriranje rokopis.
Avtorjev originalnih predloženi datoteke za slike
Spodaj so povezave do avtorjev prvotna predloženih spisov za slike. "Izvirno datoteko na sliki 1 12885_2012_3447_MOESM2_ESM.tiff avtorjev 12885_2012_3447_MOESM1_ESM.pdf avtorjev prvotni datoteki Slika 2 12885_2012_3447_MOESM3_ESM.tiff avtorjev prvotni datoteki slika 3 Konkurenca interesov
Avtorji izjavi nima konkurenčnih interesov.
Avtorjev prispevkov
ZF sodeloval pri oblikovanju študije in izvedli statistično analizo, CX izvedli luciferazni test, MT, HB zasnovana študije in particpated v svoji zasnovi in ​​usklajevanju, ZZ, ZG sodeloval pri izdelavi študije. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• transkripcijski faktor FOXO4 IS navzdol urejen in zavira tumorskih in metastaz pri raku želodca
• Faza I imatinib, cisplatina in 5-fluorouracil ali kapecitabinom v naprednih požiralnika in želodca adenokarcinom