Genetické polymorfizmy v promótorom osteopontínu zvyšuje riziko vzdialenosť metastázy a úmrtia u čínskych pacientov s rakovinou žalúdka

Genetické polymorfizmy v promótorom osteopontínu zvyšuje riziko vzdialenosť metastázy a úmrtia u čínskych pacientov s rakovinou žalúdka
abstraktné
pozadia
in vitro a in vivo
štúdie naznačujú, že osteopontínu (OPN) je spojená s mnohých typov rakoviny. Avšak, žiadne štúdie preukázali výskyt OPN polymorfizmy a riziko vzniku rakoviny žalúdka. Cieľom tejto štúdie bolo zistiť vzťah medzi OPN polymorfizmy a rakovinou žalúdka v čínskej populácii pacientov.
Metódy
tri genetické varianty v promótor OPN boli zisťované genotypom pomocou priameho sekvenovania 200 pacientov s rakovinou žalúdka a 200 vo vzťahu k pohlavia a vek-uzavreté s rakovinou bez kontroly. Krivka prežitia 4-rok bola vypočítaná za použitia metódy Kaplan-Meierovej a porovnané pomocou log-rank testu pre každý jednotlivým polymorfizmom (SNP) mieste. Merali sme promotorovou aktivitu T → C polymorfizmu -443 použitie duálneho luciferázového reporterového testu.
Výsledok
U prevedenia na nt -443 (CC), bol významný rozdiel medzi počtom pacientov s štádiu IV a tie sa fáza aj rakovina žalúdka (IA + IB; P = 0,014
), a medzi tými, s štádiu IV a všetkých ostatných fáz rakoviny žalúdka (IA + IB + II + III, P =
0,02). Pre prevedenie na nt -443 (CT), bol významný rozdiel medzi počtom pacientov s karcinómom žalúdka s štádiu IV a tie sa fáza II (P = 0,013)
. Miera prežitia pre pacientov s genotypom C /C boli výrazne nižšie ako u pacientov s ostatnými dvoma genotypmi (C /T, T /T). Okrem toho, významne vyšší Luciferase aktivity boli pozorované v pGL3-C konštrukt v porovnaní s pGL3-T konštruktu.
Závery
Táto štúdia poskytuje prvý dôkaz o tom, že zmena v nt -443 v promótorom OPN zvyšuje potenciál pre žalúdočných rakovina metastázy a následnú smrť v čínskej populácie.
Kľúčové
osteopontínu karcinóm žalúdka polymorfizmy genetických variantov metastázy pozadí
adenokarcinómom žalúdka zostáva druhou najčastejšou príčinou úmrtí súvisiacich s rakovinou po celom svete, čo predstavuje 738,000 úmrtí ročne [1] , Žalúdočné rakovina je treťou najčastejšou rakovinou v Číne. Rozvoj rakoviny žalúdka je spojený prevažne s Helicobacter pylori
infekcia [2], ale aj ďalšie rizikové faktory patrí strava s vysokým obsahom soli, fajčenie, konzumácia nakladaných potravín a špecifických genetických pozadí [3]. Bolo preukázané, že H. pylori
infekcie je nezávislý rizikový faktor, ktorý vedie k trvalej kolonizáciu a chronický zápal žalúdočnej sliznice, čím sa zvyšuje riziko vzniku peptických vredov a rakoviny žalúdka [2, 4-6]. Avšak, tam sú označené inter-individuálne rozdiely v rozsahu zápalu medzi osobami H. pylori
infekcie, a klinické dôsledky rozvíjať len v malom počte prípadov rakoviny žalúdka. Multifaktoriálne modely ukazujú, že genetická náchylnosť v dôsledku špecifických variantné alely v polymorfizmu môže mať vplyv na výsledky vystavenia vplyvom životného prostredia [7].
Osteopontínu (OPN) je secernovaný lepidlo phosphoglycoprotein, ktorý obsahuje funkčné Gly-Arg-Gly-Asp-Ser bunka-väzbové sekvencie [8]. The
gén OPN bol mapovaný na chromozóme 4q24-Q25, a bolo preukázané, že OPN hrá dôležitú úlohu v nádorovej metastázy [9]. OPN bolo preukázané, ktorý má byť exprimovaný v nádorových bunkách a v okolitom stromálnych radu ľudských rakovín, ako je napríklad hrubého čreva, prsníka, pľúc, žalúdka, endometria, štítnej žľazy a, zaisťujúce spojenie s malígnym inváziu [10-13]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že OPN je často nadmerne exprimovaný v ľudskej rakoviny žalúdka [14], a že expresia mRNA OPN bola významne vyššia u karcinómu žalúdka v porovnaní s tkanivom nenádorových tkanív.
Niekoľko polymorfizmy boli popísané pre OPN
gén, z ktorých niektoré sú spojené s oligoarticular (alebo pauciarticular) juvenilnej idiopatickej artritídy, obličkových a chronickej hepatitídy C [15-18]. Nedávna štúdia [19] uvádzajú, že u pacientov s G /G genotypu u nt -156 v promótorom OPN boli častejšie diagnostikuje v pokročilom štádiu (IIIB-IV) nemalobunkového karcinómu pľúc (NSCLC), než tie, ktoré s ostatnými genotypmi, zatiaľ čo ďalšie správy naznačujú, že polymorfizmus OPN môže byť genetický faktor pre vírusové hepatitídy B odbavenie a hepatocelulárneho výskytu karcinómu [20].
momentálne nie sú žiadne publikovanej štúdie hodnotiace vzťah medzi OPN
genetické polymorfizmy a riziko žalúdočných rozvoj rakoviny. Preto je cieľom tejto štúdie bolo zistiť, či existuje súvislosť medzi OPN polymorfizmy a rizikom rakoviny žalúdka v čínskej populácie.
Metódy
Predmety Od roku 2005 do roku 2008, 310 nepríbuzných pacientov s rakovinou žalúdka (GC skupina), bolo zapísané na pričlenené nemocnice Nanjing lekárskej univerzity. Všetci pacienti boli etnickí Han čínskej obyvatelia, ktorí mali histologicky potvrdených adenokarcinómom žalúdka. Kontrolná skupina (non-GC skupina) sa skladala z náhodnej vzorky 591 etnických Číňanov z provincie Ťiang-su. Potom, čo písomný informovaný súhlas, všetci účastníci boli požiadaní o poskytnutie vzorky krvi. Táto štúdia bola schválená etickou komisiou prvého pridružená Nanjing lekárskej univerzity (É0-SR-073).
Pred sekvenovania genotypov v OPN
promótor, použili sme SPSS v10.0 (SPSS, Inc. ., Chicago, IL, USA) softvér náhodne vyberať 200 pacientov GC a rodovo a vekovo zápas je až 200 náhodne vybraných ovládacích prvkov skupiny non-GC. Hodnotili sme všetci pacienti a ovládacie prvky pre H. pylori for S nepriamu pevnej fázy immunochromatografický (ICM) Obsah zistiť prítomnosť IgG protilátok proti H. pylori
(Genelabs Diagnostics, Singapur). Táto skúšobná metóda bola overená skôr v našom laboratóriu s presnosťou 92,3% [21].
Genómovej DNA kontrolami a pacientmi s rakovinou žalúdka bola extrahovaná z je etyléndiaminotetraoctová kyselina (EDTA) -anticoagulated periférnej krvi v súlade s tradičnou proteinázy K a fenolu -chloroform metódy, a skladované pri -70 ° C.
Analýza polymorfizmov v regulačnej oblasti OPN
OPN-66, -156 (rs17524488) a -443 (rs11730582) varianty boli genotyp priamym sekvenovaním zmysel a anti-sense vlákna po PCR (PCR) v promotorové regulačnej oblasti -473 až -3 (dopredný primer 5 '- CAA GCT GCA ACT TAC TCG AAA TCA CA-3 '; reverznej primer 5 '- ACA ACC AAG CCC TCC CAG AAT TTA-3 '), ako bolo opísané skôr [19]. PCR bola vykonaná za použitia 50 ng DNA ako templátu za nasledujúcich podmienok: 95 ° C počas 10 minút, potom 36 cyklov 94 ° C počas 30 s, s teplotou žíhanie po dobu 60 s a 72 ° C počas 60 s, s záverečná extenzie pri 72 ° C počas 15 min. Po čistení afinitnej membránové použitím QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Carlsbad, CA, USA), PCR produkty boli podrobené sekvenovania cyklu s príslušnou prednou a reverznej primer za použitia automatizovaného ABI 3100 DNA sekvenátoru od GeneCore Bio Technologies (Shanghai Čína) .
Luciferase assay s SNP v nukleotidu (nt) -443 v promótorom OPN
250 bp fragmenty promótorom OPN (od -590 až -340), nesúci buď T alebo C alely boli syntetizované Invitrogen a vložená v protismere od génu luciferázy svetlušky v pGL3-Enhancer plasmidového vektora (Promega, USA) v oddelených postupoch. Každý konštrukt bola potvrdená sekvenovaním. Séria OPN promótor-Luciferase reportérových konštruktov boli prechodne transfekovány do žalúdka bunkových línií karcinómu MKN28 (Shanghai Institute of Digestive Disease) a SGC-7901 (Shanghai Cancer Institute), a transfekcia bola vykonaná s Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) podľa protokol výrobcu. Bunkové línie MKN28 a SGC-7901 boli kultivované v Dulbeccova modifikovanom Eaglovho média (DMEM) doplnenom 10% tepelne inaktivovaným fetálnym hovädzím sérom. Aktivita rôznych promotorov genotypu bola meraná s použitím luciferázového Reporter Assay System (Promega, USA). Všetky experimenty boli opakované trikrát.
Štatistická analýza
Štatistická analýza bola vykonaná pomocou softwaru SPSS 10.0. Kvantitatívne premenné odchýlenie od normálneho rozdelenia, vrátane veku, boli zhrnuté ako priemer a štandardná odchýlka (SD). Porovnanie veku medzi prípadov a kontrol bol vykonaný s využitím nezávislého Studentov-test
. Porovnanie extra nádorov žalúdka, H. pylori infekcie stroje a genotypových frekvenciách medzi prípadmi a kontrolami bola hodnotená pomocou testu chí-námestie a Fisherovho exaktného testu. Prežitie bolo vypočítané pomocou metódy Kaplan-Meier. Všetky (P
) hodnoty pravdepodobnosti boli dvojchvostý a štatistická významnosť bola označená ako P Hotel < 0,05.
Výsledky
demografických a klinických rysov pacientov
rakovinou žalúdka (GC), skupina sa skladala zo 200 jedincov (64% mužov), s priemerným vekom 56,29 ± 3,46 rokov. Kontrolnej skupine (non-GC) sa skladala z 200 osôb, z ktorých 64% boli muži, s priemerným vekom 55,67 ± 4,21 rokov (tabuľka 1). Neboli zistené žiadne významné rozdiely, pokiaľ ide o rozdelenie podľa veku a pohlavia, ako aj H. pylori
séropozitivity. Patologickým charakteristiky pacientov a kontrol sú uvedené v tabuľke 1 1.Table patologickým charakteristiky pacientov s karcinómom žalúdka rakoviny a zdravých kontrol
Charakteristika
No. chorých alebo ovládacích prvkov
P

prípadov (n)
Control (n)
Nie.
200
200
vek, roky Hotel > 0,05
Stredná
56,29
55,67
Smerodajná odchýlka
3,46
4,21
Rozsah
63
65
Pohlavie Hotel > 0.05
Male
130
130
Žena
70
70
Helicobacter pylori
infekcie
0,12
séronegativita
62
77
Séropozitívna
138
123
vaskulárnej invázie
Absencia
155 -
prítomnosť
45 -
metastáz do lymfatických uzlín
absencia
80 -
prítomnosť
120 -
pečeňových metastáz
absencia
182 -
prítomnosť
18
-
peritoneálnej šírenie
Absencia
172 -
prítomnosť
28 -
TNM štádia -
IA
39
-
IB
40 -
II
33 -
III
45 -
IV
43
-
SNP v promotorové oblasti génu ľudského OPN
priamym sekvenovaním fragmentov DNA medzi nt -473 a nt -3 u pacientov, a veku a pohlavia uzavreté ovládacie odhalila 3 SNP v promótorom OPN, ktorý sa nachádza v nt -156 [ ,,,0],GG /GG homozygoti, GG /G- (vypustenie) svojich potomkov, G /G- homozygoti], NT -443 [CC homozygoti, CT heterozygoti, homozygotná TT] a nt -66 (obrázok 1), ako je uvedené v tabuľke 2 . nebol žiadny významný rozdiel v distribúcii týchto SNP (nt -66, -156, -443), medzi pacientmi GC a ovládacie prvky. Distribúcia genotypov pre TNM fázou karcinómu žalúdka je uvedený v tabuľke 3. Obrázok 1 znázorňuje schematický diagram a sekvenovanie dáta promótorom OPN. Reprezentatívny údaj pre sekvenčné analýzou na promótor. SNP nt -443 má nasledujúce alely: CC, CT, a TT. Tam je malý vloženie na nt-156, ktorý má tri alely: G /G, G /GG, GG /GG. SNP nt -66 má len jednej alely :. TT
Tabuľka 2 Porovnanie OPN promótor medzi pacientmi s rakovinou žalúdka a zdravých kontrol
Controls
Pacienti

karcinóm žalúdka
genotypov
n
n
P
LN (+)
LN (-)
P


-66
TT
200
200
1.00
124
76
1.00
-156
G/G
86
67
1.00
41
25
1.00
G/GG
78
92
0.064
57
36
0.92
GG/GG
36
41
0.18
25
16
0.91
-443
CC
22
15
1.00
8
8
1.00
CT
93
94
0.28
63
33
0.23
TT
85
91
0.22
53
35
0.45
Tabuľka 3 Distribúcia genotypov pre TNM štádiách rakoviny žalúdka
The TNMs žalúdočné cancer

Genotypes

IA

IB

II

III

IV

-66
TT
38
44
26
52
40
-156
G/G
16
16
13
20
19
G/GG
16
15
15
16
18
GG/GG
7
9
5
9
6
-443
CC
1
2
1
4
14
CT
17
19
19
19
19
TT
14
18
5
19
29
Avšak, pokiaľ ide o tumor-node-metastáza TNM fázy, sme zistili, že pre SNP v nt -443, u pacientov s genotypom CT, existuje významný rozdiel medzi pacientmi s fázou II a IV (P Hotel &0,01) a medzi štádiu IV a všetkých ostatných fázach (IA + IB + II + III; P = 0,04
, Tabuľka 4). Rovnako tak u pacientov s genotypom CC v nt -443, existuje významný rozdiel medzi pacientmi s etapy IV a fázy I (IA + IB; P = 0,011
) a medzi štádiu IV a vo všetkých ďalších častiach (IA + IB + II + III; P = 0,012
, Tabuľka 4). Neboli zistené žiadne významné rozdiely medzi fázou TNM a ďalšie dva SNP (NT -66 nt a -156) promótorom OPN. Tiež sme zistili, žiadny vzťah medzi SNP v promotorové OPN a lymfatických uzlín metastasis.Table 4 distribúciu genotyp nt -443 v promótorom OPN žalúdočné rakovina TNM štádiu priemysel
TNM štádií rakoviny žalúdka

genotypy
IA + IB
IV
P
II
IV
P
III
IV
P
IA + IB + II + III
IV

P


-443
TT
32
29
1.00
5
29
1.00
19
29
1.00
56
29
1.00
CT
36
19
0.16
19
19
< 0.01*
19
19
0.33
74
19
0.04*
CC
3
14
0.011*
1
14
0.98
4
14
0.18
8
14
0.012*
* Označuje podstatný rozdiel (p menšie ako 0,05).
Asociácie medzi genotypy v oblasti promotora OPN a prežitie
odhady Kaplan-Meiera z rôznych genotypov v nt -443 v OPN
promótorom sú znázornené na obrázku 2 . Miera prežitia u pacientov s genotypom C /C boli výrazne nižšie ako prežitia u pacientov s ostatnými dvoma genotypmi (C /T, T /T). Neboli zistené žiadne významné spojenie medzi prežitím a genotypov na iných miestach (nt -156 a nt -66). Obrázok 2 prežitie Kaplan-Meier u pacientov s rakovinou je žalúdka s genotypom C /C v porovnaní s ostatnými dvoma genotypov v nt -443 v OPN promótorom výrazne nižšia.
Vplyv polymorfizmu -443 T → C na promotorovou aktivitu
skúmať vplyv T → C promotorové oblasti polymorfizmus o prepis OPN
génu -443 sme merali promotorovou aktivitu s Dual Luciferase reporter Assay System Prihlásiť činnosť -443C a -443 T alely pomocou prechodné transfekcia testu s MKN28 a SGC-7901 bunkových línií. Ako je znázornené na obrázku 3, podstatne vyššie aktivity luciferázy boli vytvorené s pGL3-C konštrukt v porovnaní s pGL3-T konštruktu (P = 0,001 pre
MKN28; P = 0,021 pre
SGC-7901). Obrázok 3 Vplyv T → C polymorfizmu na aktivitu promótorom -443. Výrazne vyššia luciferázové aktivity boli generované pGL3-C konštrukt v porovnaní s pGL3-T konštruktu (P = 0,001 pre
MKN28; P = 0,021 pre
SGC-7901)
Diskusia
montáže. dôkazy naznačujú, že OPN hrá úlohu v regulácii nádorových metastáz, a že OPN expresia je obzvlášť vysoké pri metastatických nádorov [22]. OPN je nadmerne exprimovaný u nádorov, ktoré majú vysoký sklon k vytváraniu kostné metastázy. V kostnými metastázami, OPN je zvyčajne spojená s rozhraním medzi karcinómu a povrchu kosti, čo zrejme súvisí so zvýšenou kostnej resorpčnú aktivitu osteoklastov [23]. Okrem toho, vysoká expresia v OPN primárneho nádoru je spojený s včasnou metastázy a zlým klinickým výsledkom v ľudskom žalúdku rakoviny a iných nádorových ochorení [24-27].
Nedávna štúdia naznačujú, že promótor bol spojený s OPN NSCLC [19]. V tejto štúdii sme sa zamerali na združenie týchto SNP s GC, a hoci distribúcia genotypov vo OPN
promótor výrazne nelíšila medzi pacientmi GC a zdravých kontrol, tam boli významné rozdiely v distribúcii genotypov ( CC) pri teplote -443 nt u pacientov s štádiu IV a fázy aj rakovina žalúdka (IA + IB) a medzi štádiu IV a spojené ďalších troch fáz rakoviny žalúdka (IA + IB + II + III, tabuľka 4). Miera prežitia pre pacientov s genotypom C /C boli výrazne nižšie ako prežitie ostatných dvoch genotypov (C /T, T /T; Obrázok 3). Okrem toho, významne vyšší Luciferase aktivity boli generované s pGL3-C konštrukt v porovnaní s pGL3-T konštruktu. Reportéri gén analýza ukázala, že haplotypu -443C /-156 G /-66 T je spojené s výrazne zvýšenou aktivitou promótorom v porovnaní s testovanými piatimi ďalších alelických variantov [28]. Nedávna štúdia na melanómu metastáz zistené, že tí, homozygotná pre alelu -443C vyjadrené podstatne vyššie hladiny OPN mRNA v porovnaní s tými, ktoré boli buď heterozygotná (CT) alebo homozygotnou pre alely -443 T [29]. Transkripčný faktor c-Myb sa viaže na oblasť promotora OPN spôsobom v alelově špecifické a indukuje zvýšenú aktivitu v porovnaní s -443C -443 T siete OPN
promótor [30]. Vzaté dohromady, tieto údaje naznačujú, že zmena v nt -443 v promótorom OPN hrá úlohu v progresii GC a metastáz, najmä pre genotypom CC v nt -443 v OPN
promótorom. Či polymorfizmy z OPN sa vzťahuje na vyjadrenie OPN v pacientov s nádorovým ochorením zostávajú neznáme, hoci. Nadmerná expresia OPN boli nájdené vo vzorkách s karcinómom žalúdka v predchádzajúcej štúdii [14]. Z tohto dôvodu sú potrebné ďalšie štúdie k ďalšiemu objasneniu tohto zistenia.
V tejto štúdii sme zistili, že CT genotyp u nt -443 v promótorom OPN ukázali významné rozdiely medzi štádiu IV a etapu II rakoviny žalúdka, ako aj medzi stupňami IV a ďalšie štádia rakoviny žalúdka (IA + IB + II + III), ale nie medzi štádiu IV a fázy III alebo fázy I. Hlavným dôvodom pre to môže byť z dôvodu obmedzeného počtu pacientov v každej podskupine. Je tiež možné, že transkripčný faktor c-Myb môže majú zvýšenú aktivitu regióne OPN
promótorom, ktorý obsahoval CC alebo CT genotypov, ale nie druhý genotyp (tj., TT) [29]. Avšak, tieto hypotézy vyžadujú ďalšie vyšetrovanie väčších štúdiách.
Prejednávaných genomických nálezy u zdravých kontrol neboli zhodné s predchádzajúcimi zisteniami medzi japonských a talianskych kontrolnými orgánmi [30, 31]. Hoci predchádzajúce správy naznačujú, že vysoká OPN je vyjadrená vo vysokej miere GC [17], zistili sme žiadnu súvislosť medzi genotypov OPN
promótor s rizikom GC. Avšak sme zistili, etnické rozdiely v SNP niekoľkých hostiteľských génov v GC pacientov [30, 31]. Preto sa predmetný nález nemusí vzťahovať na celej populácii. Avšak, aj keď nebol zistený žiadny vzťah medzi OPN SNP a GC žalúdočné citlivosťou rakoviny alebo závažnosti čínskych pacientov, naše nálezy naznačujú, že existuje súvislosť s metastázami GC.
Záver
Záverom možno povedať, toto je prvá štúdia z OPN genetických polymorfizmov a rizikom GC v čínskej populácie. Ukázali sme, že genetické polymorfizmy v -443 v promótorom OPN sú spojené s metastázami a následného úmrtia GC. Preto tieto nálezy môžu ponúknuť prístup k predpovedať klinický výsledok u pacientov GC. Je však potrebné ďalšie štúdie s použitím väčšiu skupinu pacientov, k potvrdenie týchto zistení.
Notes
Fujun Zhao, Xiaoyi Chen prispeli rovnakou mierou k tejto práci.
Deklarácia
Poďakovanie
práce bola podporená prírodovedy fondov Číny (č 81072032 a 30770992). Autori ďakujú Medjaden Bioscience Limited pre korektúry rukopisu.
Autorov pôvodné predloženej súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy na autorov pôvodnej predložených súborov pre obrázky. "Pôvodný súbor na obrázku 1 12885_2012_3447_MOESM2_ESM.tiff autorského 12885_2012_3447_MOESM1_ESM.pdf autorov pôvodného súboru na obrázku 2 12885_2012_3447_MOESM3_ESM.tiff autorského pôvodného súboru pre obrázok 3 protichodnými záujmami
Autori prehlasujú žiadny konkurenčný záujmy.
Autorov príspevkov
ZF podieľal na návrhu štúdie a vykonaná štatistická analýza, CX vykonala Luciferase Assay, MT, HB koncipovaný štúdie, a particpated v jeho konštrukcii a koordináciu, ZZ, ZG podieľal na návrhu štúdie. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Transkripčný faktor FOXO4 je down-regulovaná a inhibuje proliferáciu nádoru a metastázy do žalúdka cancer
• Štúdia I. fázy imatinib, cisplatinou a 5-fluóruracilu sú alebo kapecitabínom v pokročilom pažeráka a žalúdka adenocarcinoma