polimorfismos genéticos no promotor osteopontina aumenta o risco de metástase à distância e morte em pacientes chineses com cancer

gástrica polimorfismos genéticos no promotor osteopontina aumenta o risco de metástase à distância e morte em pacientes chineses com cancro gástrico da arte abstracta
Fundo

in vitro e in vivo
estudos têm sugerido que a osteopontina (OPN) é associado com muitos tipos de cancros. No entanto, não há estudos têm relatado a incidência de polimorfismos do OPN eo risco de câncer gástrico. O objetivo deste estudo foi investigar a associação entre os polimorfismos do OPN e câncer gástrico em uma população chinesa paciente.
Métodos
Três variantes genéticas no promotor OPN foram genotipados utilizando sequenciamento direto em 200 pacientes com câncer gástrico e 200 género e idade-correspondida controles sem câncer. A curva de sobrevida de 4 anos foi calculada pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank para cada site polimorfismo de nucleotídeo único (SNP). Nós medimos a atividade do promotor do T → C polimorfismo -443 utilizando um ensaio de repórter luciferase dupla.
Resultado
Para a variante em nt -443 (CC), houve uma diferença significativa entre o número de pacientes com estágio IV e aqueles com estágio I câncer gástrico (IA + IB; P =
0,014) e entre aqueles com estágio IV e todas as outras fases do câncer gástrico (IA + IB + II + III; P =
0,02). Para a variante em nt -443 (CT), houve uma diferença significativa entre o número de pacientes com câncer gástrico em estágio IV e aqueles com estádio II (P =
0,013). As taxas de sobrevivência para pacientes com o genótipo C /C foram significativamente menores do que para os pacientes com os outros dois genótipos (C /T, T /T). Além disso, as actividades da luciferase significativamente mais elevados foram observados no construto pGL3-C em comparação com a construção de pGL3-T.

Conclusões Este estudo fornece a primeira evidência de que a variação no nt -443 no promotor do OPN aumenta o potencial para gástrica metástase do câncer e posterior morte na população chinesa.
Palavras-chave
osteopontina gástrica câncer de polimorfismos genéticos variantes metástase fundo
gástrica adenocarcinoma continua a ser a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, sendo responsável por 738,000 mortes por ano [1] . O câncer gástrico é o terceiro câncer mais comum na China. O desenvolvimento de câncer gástrico está associada predominantemente com a infecção por Helicobacter pylori
[2], mas outros fatores de risco incluem uma dieta rica em sal, tabagismo, consumo de alimentos em conserva, e origens genéticas específicas [3]. Tem sido demonstrado que a infecção por H. pylori
é um factor de risco independente, que conduz à colonização persistente e inflamação crónica da mucosa gástrica, aumentando assim o risco de desenvolvimento de ulceração péptica e cancro gástrico [2, 4-6]. No entanto, existem diferenças marcantes inter-individuais na extensão da inflamação entre pessoas com infecção por H. pylori
e consequências clínicas só desenvolver em um pequeno número de casos de câncer gástrico. modelos multifactoriais sugerir que a susceptibilidade genética, devido à alelos variantes específicas em polimorfismos podem afectar os resultados de exposição ambiental [7].
A osteopontina (OPN) é uma fosfoglicoprote�a adesiva segregada que contém um funcional Gly-Arg-Gly-Asp-Ser -sequência de ligação celular [8]. O
gene OPN foi mapeado no cromossoma 4q24-q25, e tem sido demonstrado que a OPN desempenha um papel importante na metástase tumoral [9]. OPN tem sido mostrado para ser expressa nas células de tumor e no estroma circundante de numerosos cancros humanos, tais como cólon, da mama, do pulmão, do estômago, do endométrio, e tiróide, proporcionando uma ligação com invasão maligna [10-13]. Estudos anteriores mostraram que o OPN é frequentemente sobre-expressa em cancro gástrico humano [14], e que a expressão de ARNm de OPN foi significativamente mais elevada em tecidos de cancro gástrico em comparação com tecidos não tumorais.
Vários polimorfismos foram descritas para a OPN
de genes, alguns dos quais estão associados com oligoarticular (ou pauciarticular) artrite juvenil idiopática, nefrolitíase, e hepatite C crónica [15-18]. Um estudo recente [19] relataram que pacientes com o genótipo G /G no nt -156 no promotor OPN foram mais frequentemente diagnosticado com estágio avançado (IIIB-IV) não-pequenas de câncer de pulmão de células (NSCLC) do que aqueles com outros genótipos, enquanto outro relatório sugeriu que o polimorfismo OPN pode ser o fator genético para a liberação viral da hepatite B ea ocorrência de carcinoma hepatocelular [20].
Atualmente não há estudos publicados que avaliaram a relação entre OPN
polimorfismos genéticos e o risco de gástrico desenvolvimento de câncer. Portanto, o objetivo deste estudo foi determinar se existe uma associação entre os polimorfismos do OPN e o risco de câncer gástrico na população chinesa.
Métodos
Assuntos De 2005 a 2008, 310 pacientes não relacionados com cancro gástrico (CG grupo), foram inscritos no primeiro Hospital Afiliado da Universidade médica de Nanjing. Todos os pacientes eram de etnia Han residentes chineses que haviam confirmado histologicamente adenocarcinoma gástrico. O grupo de controlo (grupo não-GC) consistiu de uma amostra aleatória de 591 pessoas de etnia chinesa han da província de Jiangsu. Depois de dar consentimento informado por escrito, todos os participantes foram solicitados a fornecer uma amostra de sangue. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Primeira Affiliated da Universidade Médica de Nanjing (É0-SR-073).
Antes de sequenciar os genótipos na OPN
promotor, foi utilizado SPSS v10.0 (SPSS, Inc ., Chicago, IL, EUA), software para selecionar aleatoriamente 200 pacientes GC e no género e idade-match-los para 200 controles selecionados aleatoriamente do grupo não-GC. Foram avaliados todos os pacientes e controles para H. pylori
usando um ensaio indirecto imunocromatográfico em fase sólida (ICM) para investigar a presença de anticorpos IgG para H. pylori
(Genelabs Diagnostics, Singapura). Este método de teste foi validado anteriormente no nosso laboratório, com uma precisão de 92,3% [21].
O ADN genómico a partir de controlos e doentes com cancro gástrico foi extraído a partir de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) -anticoagulated sangue periférico de acordo com a proteinase K e fenol tradicional método -clorof�mio, e armazenadas a -70 ° C.
Análise de polimorfismos na região reguladora do OPN
a OPN-66, -156 (rs17524488) e -443 (rs11730582) variantes foram genotipados por sequenciação directa de a amplificação sentido e anti-sentido vertentes seguintes reação em cadeia da polimerase (PCR) do promotor região reguladora -473 a -3 (iniciador directo 5 '- CAA GCT ACT GCA TAC TCG AAA TCA CA-3 '; iniciador inverso 5 '- ACA ACC AAG CCC TCC CAG AAT TTA-3 '), como descrito anteriormente [19]. A PCR foi efectuada utilizando ADN 50 ng como molde nas seguintes condições: 95 ° C durante 10 min, depois 36 ciclos de 94 ° C durante 30 s, uma temperatura de recozimento de 60 s, e 72 ° C durante 60 s, com um extensão final a 72 ° C durante 15 min. Após purificação de membrana de afinidade, utilizando o kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Carlsbad, CA, EUA), os produtos de PCR foram sujeitos a sequenciação por ciclos com o respectivo iniciador directo e inverso utilizando um sistema automatizado ABI 3100 sequenciador de ADN por GeneCore Bio Technologies (Xangai, China) .
ensaio de luciferase com SNP no nucleótido (nt) -443 no promotor do OPN
os fragmentos de 250 pb do promotor de OPN (a partir de -590 a -340) que transportam tanto o alelo T ou C foram sintetizados pela Invitrogen e inserido a montante do gene de luciferase de pirilampo, no plasmídeo vector pGL3-Enhancer (Promega, EUA) em procedimentos separados. Cada construção foi confirmada por sequenciação. Uma série de OPN promotor-luciferase construções repórter foram transientemente transfectados para as linhas celulares de cancro gástrico MKN28 (Shanghai Institute of Digestive Disease) e SGC-7901 (Cancer Institute Xangai), e transfecção foi realizada com Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) de acordo com a o protocolo do fabricante. As linhas de células MKN28 e SGC-7901 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor 10%. A actividade dos promotores diferentes genótipos foi medida utilizando o Repórter de Luciferase Assay System (Promega, EUA). Todos os experimentos foram repetidos em triplicado.
Análise estatística
análise estatística foi realizada no programa SPSS 10.0. As variáveis ​​quantitativas que partem da distribuição normal, incluindo a idade, foram resumidos como média e desvio padrão (SD). Comparação de idade entre casos e controles foi avaliada usando t de um estudante independente
-teste. Comparação de tumores extra-gástricos, infecção por H. pylori
e freqüências genotípicas entre casos e controles foi avaliada utilizando um teste do qui-quadrado e exato de Fisher. A sobrevivência foi calculada pelo método de Kaplan-Meier. Todos os valores (P
) de probabilidade foram bicaudais e significância estatística foi indicado como P Art < 0.05.
Resultados
demográfica e características clínicas dos pacientes
O câncer gástrico grupo (GC) foi constituído por 200 indivíduos (64% do sexo masculino), com idade média de 56.29 ± 3,46 anos. O grupo controle (não-GC) foi constituído por 200 indivíduos, dos quais 64% eram do sexo masculino, com idade média de 55,67 ± 4,21 anos (Tabela 1). Não houve diferenças significativas em termos de distribuição de idade e sexo, bem como H. pylori
soropositividade. características clinicopatológicas dos pacientes e controles são apresentados na Tabela 1 1.Table características clínico-patológicas de pacientes com carcinoma de câncer gástrico e controles saudáveis ​​
Característica
No. de pacientes ou controles
P
casos (n)
Controle (n)
No.
200
200
Idade, anos
> 0,05
média
56,29
55,67
Desvio padrão
3,46
4,21
Faixa
63
65
Sexo Art > 0,05
Masculino
130
130
Feminino
70
70
Helicobacter pylori
infecção
0,12
Seronegativo
62
77
Seropositivo
138
123
Vascular invasão
Ausência
155
- Presença
45
- Linfonodo metástase
ausência
80
- Presença
120
- fígado metástase
ausência
182
- Presença
18 Restaurant -
peritoneal divulgação
Ausência
172
- Presença
28
- estágio TNM
- IA
39 Restaurant -
IB
40
- II
33
- III
45
- IV
43 Restaurant -
SNPs na região promotora do gene OPN humano
a sequenciação directa dos fragmentos de ADN entre nt nt -473 e -3 em pacientes e controles pareados por idade e género revelado 3 SNPs no promotor do OPN, localizado no nt -156 [ ,,,0],GG /homozigotos GG, GG /G- (supressão) heterozigotos, G- /G- homozigotos], nt -443 [homozigotos CC, heterozigotos TC, homozigotos TT] e nt -66 (Figura 1), como mostra a Tabela 2 . não houve diferença significativa na distribuição desses SNPs (nt -66, -156, -443) entre os pacientes e controles GC. A distribuição de genótipos de fases TNM em cancro gástrico é mostrado na Tabela 3. A Figura 1 Diagrama esquemático de dados e sequenciação do promotor do OPN. valor representativo para a análise de sequenciação do promotor. O SNP nt -443 tem os seguintes alelos: CC, CT e TT. Há uma pequena inserção no nt-156, que tem três alelos: G /G, G /GG, GG /GG. O SNP nt -66 tem apenas um alelo:. TT
Tabela 2 Comparação de promotor OPN entre pacientes com câncer gástrico e controles saudáveis ​​
Controles
Pacientes

O câncer gástrico
genótipos
n
n
P
LN (+)
LN (-)
P


-66
TT
200
200
1.00
124
76
1.00
-156
G/G
86
67
1.00
41
25
1.00
G/GG
78
92
0.064
57
36
0.92
GG/GG
36
41
0.18
25
16
0.91
-443
CC
22
15
1.00
8
8
1.00
CT
93
94
0.28
63
33
0.23
TT
85
91
0.22
53
35
0.45
Tabela 3 A distribuição dos genótipos para os estádios TNM em câncer gástrico
Os TNMS de gástrica cancer

Genotypes

IA

IB

II

III

IV

-66
TT
38
44
26
52
40
-156
G/G
16
16
13
20
19
G/GG
16
15
15
16
18
GG/GG
7
9
5
9
6
-443
CC
1
2
1
4
14
CT
17
19
19
19
19
TT
14
18
5
19
29
No entanto, em relação estágios TNM tumor-nódulo-metástase, descobrimos que para o SNP no nt -443, entre os pacientes com o genótipo CT, houve uma diferença significativa entre os pacientes com estádios II e IV (P Art < 0,01) , e entre a fase IV, e todas as outras fases (IA + IB + II + III; P =
0,04; Tabela 4). Da mesma forma, entre os pacientes com o genótipo CC no nt -443, houve uma diferença significativa entre os pacientes com estágios IV e estágio I (IA + IB; P =
0,011) e entre estágio IV e todas as outras fases (IA + IB + II + III; P = 0,012
; Tabela 4). Não houve diferenças significativas entre os estágios TNM e os outros dois SNPs (nt -66 e nt -156) do promotor OPN. Nós também não encontrou associação entre os SNPs no OPN promotor e linfonodo metastasis.Table 4 A distribuição dos genótipos de nt -443 no promotor OPN por gástrica TNM câncer em estágio
Os estágios TNM de câncer gástrico

genótipos
IA + IB
IV
P
II
IV
P
III
IV
P
IA + IB + II + III
IV

P


-443
TT
32
29
1.00
5
29
1.00
19
29
1.00
56
29
1.00
CT
36
19
0.16
19
19
< 0.01*
19
19
0.33
74
19
0.04*
CC
3
14
0.011*
1
14
0.98
4
14
0.18
8
14
0.012*
* Indica diferença estatisticamente significativa (P < 0,05). Associações
entre genótipos na região do promotor de OPN e sobrevivência
estimativas de Kaplan-Meier de diferentes genótipos no nt -443 no promotor do OPN
são mostrados na Figura 2 . as taxas de sobrevivência para pacientes com o genótipo C /C foram significativamente menores do que as taxas de sobrevivência para pacientes com os outros dois genótipos (C /T, T /T). Não houve associação significativa entre a sobrevivência e genótipos nos outros locais (nt -156 e -66 nt). Figura 2 de Kaplan-Meier de sobrevivência é significativamente mais baixa em doentes com cancro gástrico com o genótipo C /C, em comparação com os outros dois genótipos no nt -443 no promotor do OPN.
Efeito do polimorfismo -443 T → C sobre a actividade do promotor
Para examinar o efeito do polimorfismo T → C -443 da região promotora da transcrição do gene OPN
, medimos a actividade do promotor com uma luciferase duplo Sistema de ensaio de repórter e comparadas as actividades da -443C e -443 T alelos utilizando um ensaio de transfecção transiente com o MKN28 e linhas celulares SGC-7901. Como mostrado na Figura 3, as actividades da luciferase significativamente mais elevados foram gerados com o constructo pGL3-C em comparação com a construção de pGL3-T (P = 0,001 para
MKN28; P = 0,021 para
SGC-7901). Figura 3 Efeito do polimorfismo T → C -443 na actividade do promotor. Significativamente mais elevadas actividades de luciferase foram gerados pela construção pGL3-C, em comparação com a construção de pGL3-T (P = 0,001 para
MKN28; P = 0,021 para
SGC-7901) Discussão
montagem. evidência sugere que OPN desempenha um papel na regulação da metástase de tumores e que a expressão do OPN é particularmente elevada nos tumores metastáticos [22]. OPN é sobre-expresso em cancros que têm uma alta propensão para formar metástases ósseas. Em metástases ósseas, a OPN está geralmente associada com a interface entre o carcinoma e a superfície do osso, e isto parece estar relacionada com o aumento da actividade de reabsorção de osso pelos osteoclastos [23]. Além disso, a alta expressão de OPN no tumor primário está associada a metástase precoce e má evolução clínica no cancro gástrico humano e de outros cancros [24-27].
Um estudo recente sugeriu que o promotor OPN foi associada com NSCLC [19]. No presente estudo, enfocamos a associação desses SNPs com GC, e, embora a distribuição de genótipos do OPN
promotor não foi significativamente diferente entre os pacientes do GC e controles saudáveis, houve diferenças significativas na distribuição dos genótipos ( CC) em nt -443 entre os pacientes com estágio IV e fase I cancro gástrico (IA + IB) e entre estágio IV e os combinados outros três estágios de câncer gástrico (IA + IB + II + III; Tabela 4). As taxas de sobrevivência para pacientes com o genótipo C /C foram significativamente menores do que as taxas de sobrevivência dos outros dois genótipos (C /T, T /T; Figura 3). Além disso, as actividades da luciferase significativamente mais elevados foram gerados com o constructo pGL3-C em comparação com a construção de pGL3-T. A análise do gene repórter tem mostrado que a -443C haplótipo /L -156 /-66 T está associada com a actividade do promotor significativamente melhorada em comparação com cinco outras variantes alélicas testados [28]. Um estudo recente em metástases de melanoma descobriram que os que são homozigóticos para o alelo -443C expressaram níveis significativamente mais elevados de ARNm de OPN em comparação com aqueles que eram ou heterozigótica (CT) ou homozigóticos para o alelo T -443 [29]. factor de transcrição de c-Myb liga-se à região do promotor de OPN numa forma específica de alelo e induz a actividade aumentada da -443C em comparação com a -443 T OPN
promotor [30]. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a variação no nt -443 no promotor do OPN desempenha um papel na progressão e metástase de GC, especialmente para o genótipo CC no nt -443 no promotor do OPN
. Se a polimorfismos de OPN está relacionada com a expressão de OPN em câncer pacientes permanecem desconhecidas, embora. Sobre-expressão de OPN foi encontrado em amostras de câncer gástrico em um estudo anterior [14]. Portanto, são necessários estudos adicionais para elucidar este achado.
No presente estudo, verificou-se que o genótipo CT em nt -443 no promotor OPN mostrou diferenças significativas entre estágio IV e estágio II de câncer gástrico, e também entre estágio IV e outras etapas do câncer gástrico (IA + IB + II + III), mas não entre estágio IV e estágio III ou estágio I. a principal razão para isto pode ser devido ao número limitado de pacientes em cada subgrupo. É também possível que o factor de transcrição c-Myb pode ter aumentado a actividade da região do promotor do OPN
que continha o CC ou genótipos CT, mas não o outro genótipo (isto é, TT) [29]. No entanto, essas hipóteses necessitam de uma investigação mais aprofundada em estudos maiores.
Os achados genômicas em controles saudáveis ​​não eram idênticos aos resultados anteriores entre indivíduos controle japoneses e italianos [30, 31]. Embora relatórios anteriores sugerem que a alta OPN é expresso em níveis elevados em GC [17], não encontramos nenhuma associação entre os genótipos do OPN
promotor com o risco de GC. diferenças étnicas No entanto, temos encontrado em SNPs de vários genes do hospedeiro em pacientes GC [30, 31]. Portanto, os achados podem não se aplicar a todas as populações. No entanto, apesar de não haver associação entre OPN SNPs e GC susceptibilidade câncer gástrico ou gravidade em pacientes chineses, os nossos resultados sugerem que existe uma associação com metástase de GC.
Conclusão
Em conclusão, este é o primeiro estudo de polimorfismos genéticos do OPN e o risco de GC em uma população chinesa. Nós demonstramos que os polimorfismos genéticos a -443 no promotor do OPN estão associados com a metástase e morte subsequente de GC. Portanto, estes resultados podem oferecer uma abordagem para prever o resultado clínico dos pacientes do GC. No entanto, são necessários estudos adicionais usando uma coorte maior de pacientes para confirmar estes resultados.
Notas
Fujun Zhao, Xiaoyi Chen contribuíram igualmente para este trabalho.
Declarações
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por fundos das Ciências naturais da China (No. 81072032 e 30770992). Os autores agradecem Medjaden Bioscience Limited pela revisão do manuscrito.
Autores 'arquivos enviados originais para imagens
Abaixo estão os links para os autores' arquivos originais apresentados para imagens. 'arquivo original para a figura 1 12885_2012_3447_MOESM2_ESM.tiff Autores' 12885_2012_3447_MOESM1_ESM.pdf Autores arquivo original para a figura 2 12885_2012_3447_MOESM3_ESM.tiff Autores 'arquivo original para a figura 3 Competir interesses
Os autores declaram não interesses concorrentes.
Autores' contribuições
ZF participou no desenho do estudo e realizada a análise estatística, CX realizado o ensaio de luciferase, MT, HB concebeu o estudo, e particpated na sua concepção e coordenação, ZZ, ZG participou no desenho do estudo. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

• O FOXO4 fator de transcrição é regulada para baixo e inibe a proliferação de tumores e metástases no cancro gástrico
• estudo de Fase I de imatinib, cisplatina e 5-fluorouracil ou com capecitabina em avançado de esôfago e adenocarcinoma gástrico