Les polymorphismes génétiques dans le promoteur de ostéopontine augmente le risque de métastases à distance et la mort chez les patients chinois avec cancer

gastrique polymorphismes génétiques dans le promoteur de ostéopontine augmente le risque de métastases à distance et la mort chez les patients chinois atteints de cancer gastrique
Résumé de l'arrière-plan
in vitro et in vivo

études ont suggéré que l'ostéopontine (OPN) est associée à de nombreux types de cancers. Cependant, aucune étude n'a rapporté l'incidence des polymorphismes OPN et le risque de cancer de l'estomac. Le but de cette étude était d'étudier l'association entre les polymorphismes OPN et le cancer gastrique dans une population chinoise patient.
Trois variantes génétiques de méthodes dans le promoteur OPN ont été génotypés en utilisant le séquençage direct chez 200 patients atteints de cancer gastrique et 200 sexe et à l'âge adapté témoins sans cancer. La courbe de survie de 4 ans a été calculé selon la méthode de Kaplan-Meier et comparées en utilisant le test du log-rank pour chaque site polymorphisme nucléotidique simple (SNP). Nous avons mesuré l'activité de promoteur de l'-443 T → C polymorphisme utilisant un dosage rapporteur double luciférase.
Résultat
Pour la variante à nt -443 (CC), il y avait une différence significative entre le nombre de patients au stade IV et ceux de stade I cancer gastrique (IA + IB; P = 0,014
) et entre ceux de stade IV et tous les autres stades du cancer gastrique (IA + IB + II + III; P = 0,02
). Pour la variante à nt -443 (CT), il y avait une différence significative entre le nombre de patients atteints de cancer gastrique de stade IV et ceux avec la phase II (P = 0,013
). Les taux de survie des patients avec le génotype C /C étaient significativement plus faibles que pour les patients avec les deux autres génotypes (C /T, T /T). En outre, les activités de luciférase significativement plus élevées ont été observées dans le pGL3-C construction par rapport à la pGL3-T construction.
Conclusions
Cette étude fournit la première preuve que la variation au niveau du nt -443 dans le promoteur OPN augmente le potentiel de l'estomac les métastases du cancer et la mort subséquente de la population chinoise.
Mots-clés
Osteopontin cancer gastrique polymorphismes génétiques variantes métastase Contexte
gastrique adénocarcinome reste la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde entier, ce qui représente 738.000 décès par an [1] . Le cancer gastrique est le troisième cancer le plus commun en Chine. Le développement du cancer gastrique est associé principalement avec l'infection de Helicobacter pylori [2], mais d'autres facteurs de risque incluent une alimentation riche en sel, le tabagisme, la consommation d'aliments marinés et origines génétiques spécifiques [3]. Il a été démontré que l'infection par H. pylori est un facteur de risque indépendant qui mène à la colonisation persistante et une inflammation chronique de la muqueuse gastrique, ce qui augmente le risque de développer un ulcère gastro-duodénal et le cancer gastrique [2, 4-6]. Cependant, il existe des différences marquées entre les individus dans la mesure de l'inflammation chez les personnes atteintes de l'infection par H. pylori, et les conséquences cliniques ne se développent dans un petit nombre de cas de cancer gastrique. modèles multifactoriels suggèrent que la susceptibilité génétique due à des variantes allèles spécifiques à des polymorphismes peut influer sur les résultats de l'exposition environnementale [7] de. Osteopontin (OPN) est une phosphoglycoprotéine adhésive sécrétée qui contient une fonctionnelle Gly-Arg-Gly-Asp-Ser séquence de liaison cellulaire [8]. Le Site gène OPN a été localisé sur le chromosome 4q24-q25, et il a été démontré que l'OPN joue un rôle important dans les métastases tumorales [9]. OPN a été montré pour être exprimé dans les cellules tumorales et dans le stroma environnant de nombreux cancers humains, tels que du côlon, du sein, du poumon, de l'estomac, de l'endomètre et de la thyroïde, fournissant un lien avec envahissement malin [10-13]. Des études antérieures ont montré que l'OPN est fréquemment surexprimé dans le cancer gastrique humain [14], et que l'expression de l'ARNm de l'OPN était significativement plus élevé dans les tissus du cancer de l'estomac par rapport à des tissus non tumoraux.
Plusieurs polymorphismes ont été décrits pour la population de l'OPN gènes, dont certains sont associés à oligoarticulaire (ou pauciarticular) l'arthrite juvénile idiopathique, la lithiase rénale et d'hépatite C chronique [15-18]. Une étude récente [19] ont rapporté que les patients avec un génotype G /G au nt -156 dans le promoteur OPN ont été plus fréquemment diagnostiqués avec un stade avancé (IIIB-IV) non-petit cancer du poumon à petites cellules (NSCLC) que ceux avec d'autres génotypes, tandis qu'un autre rapport suggère que le polymorphisme OPN pourrait être le facteur génétique pour l'hépatite B clairance virale et carcinome hépatocellulaire occurrence [20].
Il n'y a pas d'études publiées évaluant la relation entre OPN
polymorphismes génétiques et le risque de l'estomac le développement du cancer. Par conséquent, le but de cette étude était de déterminer s'il existe une association entre les polymorphismes OPN et le risque de cancer gastrique dans la population chinoise.
Méthodes
Sujets De 2005 à 2008, 310 patients non apparentés atteints de cancer gastrique (GC groupe), étaient inscrits au premier hôpital affilié de l'Université médicale de Nanjing. Tous les patients étaient ethniques résidents chinois Han qui avait histologiquement confirmés adénocarcinome gastrique. Le groupe témoin (le groupe non-GC) est composée d'un échantillon aléatoire de 591 ethnies Han de la province du Jiangsu. Après avoir donné un consentement éclairé écrit, tous les participants ont été priés de fournir un échantillon de sang. Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique de la Première affilié de l'Université médicale de Nanjing (n 2010-SR-073).
Avant le séquençage des génotypes dans le promoteur de l'OPN, nous avons utilisé SPSS v10.0 (SPSS, Inc ., logiciels Chicago, IL, USA) pour sélectionner au hasard 200 patients du GC et sexe et par âge correspondent les 200 contrôles sélectionnés au hasard du groupe non-GC. Nous avons évalué tous les patients et les contrôles pour H. pylori
en utilisant un test indirect solide immunochromatographique de phase (ICM) pour enquêter sur la présence d'anticorps IgG à H. pylori
(Genelabs Diagnostics, Singapour). Cette méthode d'essai a été validé précédemment dans notre laboratoire avec une précision de 92,3% [21].
ADN génomique provenant des contrôles et des patients atteints d'un cancer de l'estomac a été extrait de l'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) -anticoagulated sang périphérique en fonction de la protéinase K et du phénol traditionnel méthode -chloroforme, et stocké à -70 ° C.
Analyse des polymorphismes dans la région régulatrice OPN The OPN-66, -156 (rs17524488) et -443 (rs11730582) variantes ont été génotypés par séquençage direct de l'amplification sens et anti-sens brins suivants réaction en chaîne par polymérase (PCR) du promoteur région régulatrice -473 à -3 (amorce sens 5 '- CAA GCT ACT GCA TAC TCG AAA TCA CA-3 '; amorce inverse 5 '- ACA ACC AAG CCC TCC CAG AAT TTA-3 '), comme décrit précédemment [19]. La PCR a été réalisée en utilisant l'ADN 50 ng de matrice dans les conditions suivantes: 95 ° C pendant 10 min, puis 36 cycles de 94 ° C pendant 30 s, une température de recuit pendant 60 secondes et 72 ° C pendant 60 s, avec une extension finale à 72 ° C pendant 15 min. Après purification de la membrane d'affinité en utilisant le kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Carlsbad, CA, USA), les produits de PCR ont été soumis à un séquençage de cycle avec le respectif avant et arrière amorce en utilisant un système automatisé ABI 3100 séquenceur d'ADN par GeneCore Bio Technologies (Shanghai) .
Luciferase Assay par le SNP au niveau du nucleotide (nt) -443 dans le promoteur OPN
les fragments de 250 pb du promoteur OPN (-590 à -340) portant l'une ou l'autre allèle T ou C ont été synthétisées par Invitrogen et inséré en amont du gène de la luciférase de luciole dans le plasmide vecteur pGL3-Enhancer (Promega, Etats-Unis) dans des procédures distinctes. Chaque construction a été confirmée par séquençage. Une série d'OPN promoteur luciférase constructions rapporteurs ont été transitoirement transfectés dans les lignées cellulaires du cancer de l'estomac MKN28 (Shanghai Institute of Digestive Disease) et SGC-7901 (Cancer Institute Shanghai), et la transfection a été effectuée avec de la lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) selon le le protocole du fabricant. Les lignées de cellules MKN28 et CGS-7901 ont été cultivées dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 10% inactivé par la chaleur. L'activité des différents promoteurs de génotype a été mesurée à l'aide du rapporteur Luciférase Assay System (Promega, USA). Toutes les expériences ont été répétées en triple.
Analyse statistique
analyse statistique a été effectuée à l'aide du logiciel SPSS 10.0. Les variables quantitatives au départ de la distribution normale, y compris l'âge, ont été résumés comme moyenne et écart-type (SD). Comparaison de l'âge entre les cas et les témoins a été évaluée à l'aide de t
-test d'un étudiant indépendant. Comparaison des tumeurs extra-gastrique, l'infection de H. pylori, et les fréquences de génotype entre les cas et les contrôles a été évaluée en utilisant un test de chi-carré et le test exact de Fisher. La survie a été calculée par la méthode de Kaplan-Meier. Toutes les probabilités (P)
valeurs ont été à deux queues et la signification statistique a été indiqué que P
< Résultats de 0,05.
démographique et les caractéristiques cliniques des patients
Le cancer gastrique groupe (GC) se composait de 200 personnes (64% d'hommes), avec un âge moyen de 56.29 ± 3,46 années. Le groupe témoin (non-GC) est composée de 200 personnes, dont 64% étaient des hommes, avec un âge moyen de 55,67 ± 4,21 années (tableau 1). Il n'y avait pas de différences significatives en termes de distribution de l'âge et le sexe, ainsi que la séropositivité de H. pylori. caractéristiques clinicopathologiques des patients et des contrôles sont présentés dans le tableau 1 1.Table caractéristiques clinicopathologiques des patients atteints d'un carcinome du cancer gastrique et des témoins sains
Caractéristique
No. des patients ou des contrôles
P
Cas (n)
contrôle (n)
n °
200
200
âge, années
> 0,05
Mean
56.29
55.67
Déviation standard
3,46
4.21
Range
63
65
Sexe
> 130
130
Femme de 0,05
Homme
70
70
Helicobacter pylori infection

0,12
séronégative
62
77
Séropositif
138
123
Absence de Vascular invasion
155
- 45
Présence -
ganglionnaire métastase
Absence
80
- 120
Présence -
métastases hépatiques
Absence
182
- 18
Présence -
péritonéale diffusion
Absence
172
- 28
Présence -
stade TNM
- IA
39
-
IB
40
- II
33
- III
45
- IV
43
-
SNP dans la région de promoteur du gène OPN humaine
séquençage direct de fragments d'ADN entre nt -473 et nt -3 chez les patients et les contrôles selon l'âge et le sexe appariés ont révélé 3 SNP dans le promoteur OPN, situé au nt -156 [ ,,,0],GG /homozygotes GG, GG /G- (suppression) hétérozygotes, G- /G- homozygotes], nt -443 [CC homozygotes, hétérozygotes CT, homozygotes TT] et nt -66 (figure 1), comme indiqué dans le tableau 2 . Il n'y avait pas de différence significative dans la distribution de ces SNP (nt -66, -156, -443) entre les patients et les témoins GC. La distribution des génotypes pour les stades TNM dans le cancer gastrique est indiqué dans le Tableau 3. Figure 1 Les données schématiques du diagramme et de séquençage du promoteur OPN. chiffre représentant pour l'analyse de séquençage du promoteur. Le SNP nt -443 a les allèles suivants: CC, CT et TT. Il y a une petite insertion au nt-156, qui a trois allèles: G /G, G /GG, GG /GG. Le SNP nt -66 a un seul allèle:. TT
Tableau 2 Comparaison des OPN promoteur entre les patients atteints de cancer gastrique et des contrôles sains

Contrôles
patients

Le cancer gastrique
génotypes
n
n
P
LN (+)
LN (-)
P


-66
TT
200
200
1.00
124
76
1.00
-156
G/G
86
67
1.00
41
25
1.00
G/GG
78
92
0.064
57
36
0.92
GG/GG
36
41
0.18
25
16
0.91
-443
CC
22
15
1.00
8
8
1.00
CT
93
94
0.28
63
33
0.23
TT
85
91
0.22
53
35
0.45
Tableau 3 La distribution des génotypes pour les stades TNM dans le cancer gastrique
Les TNMS de l'estomac cancer

Genotypes

IA

IB

II

III

IV

-66
TT
38
44
26
52
40
-156
G/G
16
16
13
20
19
G/GG
16
15
15
16
18
GG/GG
7
9
5
9
6
-443
CC
1
2
1
4
14
CT
17
19
19
19
19
TT
14
18
5
19
29
Cependant, en ce qui concerne les stades TNM tumeur-node-métastases, nous avons constaté que pour le SNP au nt -443, chez les patients avec le génotype CT, il y avait une différence significative entre les patients avec des stades II et IV (P
< 0,01) et entre le stade IV et toutes les autres étapes (IA + IB + II + III, p =
0,04; Tableau 4). De même, chez les patients avec le génotype CC au nt -443, il y avait une différence significative entre les patients avec des stades IV et le stade I (IA + IB; P = 0,011
) et entre le stade IV et toutes les autres étapes (IA + IB + II + III; P = 0,012
; Tableau 4). Il n'y avait pas de différences significatives entre les stades TNM et les deux autres SNPs (nt -66 et -156 nt) du promoteur OPN. Nous avons également trouvé aucune association entre les SNP dans le promoteur OPN et des ganglions lymphatiques metastasis.Table 4 La distribution des génotypes du nt -443 dans le promoteur OPN par gastrique TNM du cancer stade
Les stades TNM de cancer gastrique

génotypes
IA + IB
IV
P
II
IV
P
III
IV
P
IA + IB + II + III
IV

P


-443
TT
32
29
1.00
5
29
1.00
19
29
1.00
56
29
1.00
CT
36
19
0.16
19
19
< 0.01*
19
19
0.33
74
19
0.04*
CC
3
14
0.011*
1
14
0.98
4
14
0.18
8
14
0.012*
* Indique une différence significative (P < 0,05). Les associations de entre génotypes dans la région du promoteur de OPN et la survie
estimations de Kaplan-Meier de différents génotypes au nt -443 dans le promoteur du OPN sont représentés sur la Figure 2 . les taux de survie des patients avec le génotype C /C étaient significativement plus faibles que les taux de survie des patients avec les deux autres génotypes (C /T, T /T). Il n'y avait aucune association significative entre la survie et les génotypes sur les autres sites (nt -156 et -66 nt). Figure 2 Kaplan-Meier de survie est significativement plus faible chez les patients atteints de cancer gastrique ayant le génotype C /C par rapport aux deux autres génotypes au nt -443 dans le promoteur OPN.
Effet du polymorphisme -443 T → C sur l'activité du promoteur
Afin d'examiner l'effet du T → C -443 région promotrice polymorphisme sur la transcription du gène de l'OPN, nous avons mesuré l'activité du promoteur avec un Dual Luciférase système de dosage de rapporteur et a comparé les activités de la -443C et -443 T allèles en utilisant un essai de transfection transitoire avec la MKN28 et des lignées cellulaires CGT-7901. Comme on le voit sur la figure 3, les activités luciférase ont été significativement plus élevées générées par la construction pGL3-C comparativement à la construction pGL3-T (P = 0,001 pour
MKN28; P = 0,021 pour
SGC-7901). Figure 3: Effet de l'-443 T → C polymorphisme sur l'activité de promoteur. De manière significative les activités luciférase plus élevées ont été générées par le pGL3-C construction par rapport à la pGL3-T construct (P = 0,001 pour
MKN28; P = 0,021
pour SGC-7901) Rapport de
montage. il semble que OPN joue un rôle dans la régulation des métastases tumorales et que l'expression de l'OPN est particulièrement élevée dans les tumeurs métastatiques [22]. OPN est surexprimée dans les cancers qui ont une forte propension à former des métastases osseuses. Dans les métastases osseuses, l'OPN est généralement associée à l'interface entre le carcinome et la surface de l'os, ce qui semble être liée à une augmentation de l'activité de résorption osseuse par les ostéoclastes [23]. En outre, l'expression élevée OPN dans la tumeur primaire est associée à des métastases précoces et mauvais résultat clinique dans le cancer gastrique humain et d'autres cancers [24-27].
Une étude récente suggère que le promoteur OPN a été associé à un CPNPC [19]. Dans la présente étude, nous nous sommes concentrés sur l'association de ces SNP avec GC, et bien que la distribution des génotypes dans le promoteur de l'OPN n'a pas été significativement différente entre les patients du GC et des contrôles sains, il y avait des différences significatives dans la distribution des génotypes ( CC) au nt -443 entre les patients de stade IV et le stade I cancer gastrique (IA + IB) et entre le stade IV et les combinés trois autres stades du cancer gastrique (IA + IB + II + III; tableau 4). Les taux de survie des patients avec le génotype C /C étaient significativement plus bas que les taux des deux autres génotypes (C /T, T /T; Figure 3) survie. En outre, les activités de luciférase significativement plus élevées ont été obtenues avec la construction pGL3-C comparativement à la construction pGL3-T. l'analyse du gène rapporteur a montré que l'haplotype -443C /G -156 /-66 T est associée à une activité de promoteur significativement amélioré par rapport aux cinq autres variants alléliques testé [28]. Une étude récente sur les métastases de mélanome a révélé que ceux homozygotes pour l'allèle -443C exprimé des niveaux significativement plus élevés d'OPN ARNm par rapport à ceux qui étaient soit hétérozygote (CT) ou homozygotes pour l'allèle T -443 [29]. Facteur de transcription c-myb lie à la région du promoteur OPN d'une manière spécifique d'allèle et induit une activité accrue du -443C par rapport au promoteur de l'OPN -443 T [30]. Pris ensemble, ces données suggèrent que la variation au niveau du nt -443 dans le promoteur OPN joue un rôle dans la progression de la CPG et les métastases, en particulier pour le génotype CC au niveau du nt -443 dans le promoteur de l'OPN. patients Que les polymorphismes de l'OPN est liée à l'expression de l'OPN dans le cancer restent inconnues bien. La surexpression de l'OPN a été trouvé dans les échantillons de cancer gastrique dans une étude précédente [14]. Par conséquent, des études supplémentaires sont nécessaires pour élucider cette constatation.
Dans la présente étude, nous avons constaté que le génotype CT au nt -443 dans le promoteur OPN a montré des différences significatives entre le stade IV et le stade II de cancer de l'estomac, et aussi entre la scène IV et d'autres stades du cancer gastrique (IA + IB + II + III), mais pas entre le stade IV et stade III ou I. la raison principale de ceci est peut-être en raison du nombre limité de patients dans chaque sous-groupe. Il est également possible que le facteur de transcription c-myb aurait augmenté l'activité de la région de promoteur du OPN qui contenait le ou les génotypes CC CT, mais pas l'autre génotype (par exemple, TT) [29]. Toutefois, ces hypothèses nécessitent une enquête plus approfondie dans des études plus importantes.
Les résultats génomiques présents dans les contrôles sains n'étaient pas identiques aux résultats précédents chez les sujets témoins japonais et italiens [30, 31]. Bien que les rapports précédents suggèrent que la forte OPN est exprimée à des niveaux élevés en GC [17], nous avons trouvé aucune association entre les génotypes du promoteur de l'OPN avec le risque de GC. différences ethniques Cependant, nous avons trouvé dans les SNP de plusieurs gènes de l'hôte chez les patients du GC [30, 31]. Par conséquent, les résultats actuels peuvent ne pas appliquer à toutes les populations. Néanmoins, bien qu'il n'y avait pas d'association entre OPN SNPs et GC susceptibilité au cancer gastrique ou de la gravité chez les patients chinois, nos résultats suggèrent qu'il existe une association avec des métastases du GC.
Conclusion
En conclusion, cette étude est la première de l'OPN et les polymorphismes génétiques du risque de GC dans la population chinoise. Nous avons démontré que les polymorphismes génétiques à -443 dans le promoteur OPN sont associées à des métastases et de la mort ultérieure du CPG. Par conséquent, ces résultats peuvent offrir une approche de prédire l'issue clinique des patients du GC. Cependant, des études supplémentaires sont nécessaires en utilisant une plus grande cohorte de patients afin de confirmer ces résultats
. Fujun Zhao Notes, Xiaoyi Chen a contribué également à ce travail.
Déclarations Remerciements
Ce travail a été soutenue par les Fonds des sciences naturelles de la Chine (n ° 81072032 et 30770992). Les auteurs remercient Medjaden Bioscience limitée pour la relecture du manuscrit.
Auteurs fichiers originaux soumis pour les images
Voici les liens vers les auteurs originaux soumis les fichiers pour les images. de fichier d'origine pour la figure 1 12885_2012_3447_MOESM2_ESM.tiff Auteurs 12885_2012_3447_MOESM1_ESM.pdf Auteurs fichier d'origine pour la figure 2 12885_2012_3447_MOESM3_ESM.tiff Auteurs fichier d'origine pour la figure 3 Intérêts concurrents
Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêts.
Auteurs des contributions
ZF a participé à la conception de l'étude et a effectué l'analyse statistique, CX effectue le dosage de la luciférase, MT, HB conçu de l'étude, et été partenaire dans sa conception et la coordination, ZZ, ZG a participé à la conception de l'étude. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

• FOXO4 le facteur de transcription est régulée à la baisse et inhibe la prolifération tumorale et des métastases dans le cancer gastrique
• Étude de phase I de l'imatinib, le cisplatine et le 5-fluorouracile ou capécitabine dans l'œsophage avancé et adénocarcinome gastrique