Genetische polymorfismen in het osteopontine promotor verhoogt het risico op afstand metastase en dood in Chinese patiënten met maag cancer

genetische polymorfismen in de osteopontine promotor verhoogt het risico op afstand metastase en dood in Chinese patiënten met maagkanker
De abstracte Achtergrond
in vitro en in vivo

studies hebben gesuggereerd dat osteopontine (OPN) is geassocieerd met vele soorten kanker. Echter geen studies de incidentie van OPN polymorfismen en het risico op maagkanker gerapporteerd. Het doel van deze studie was om de associatie tussen OPN polymorfismen en maagkanker in een Chinese patiëntenpopulatie te onderzoeken.
Methods
Drie genetische varianten in de OPN promotor werden gegenotypeerd met behulp van directe sequencing in 200 maagkankerpatiënten en 200 gender- en leeftijd-geëvenaard vrij van kanker controles. Het 4-jaars overleving curve werd berekend met behulp van de Kaplan-Meier-methode en vergeleken met behulp van de log-rank test voor elke single nucleotide polymorfismen (SNP) website. We maten de promotoractiviteit van de T → C -443 polymorfisme met een dual luciferase reporter assay.
Resultaat
Voor de variant op nt -443 (CC), was er een significant verschil tussen het aantal patiënten met stadium IV en mensen met een stadium I maagkanker (IA + IB; P =
0.014) en tussen mensen met een stadium IV en alle andere stadia van maagkanker (IA + IB + II + III; P =
0,02). Voor de variant op nt -443 (CT), was er een significant verschil tussen het aantal maagkanker patiënten met stadium IV en die met fase II (P = 0,013
). De overleving van patiënten met de C /C genotype was significant lager dan bij patiënten met de andere twee genotypen (C /T, T /T). Bovendien werden significant hogere luciferase activiteiten die worden waargenomen in de pGL3-C construct in vergelijking met de pGL3-T construct.

Conclusies Deze studie levert het eerste bewijs dat de variatie op nt -443 in de promoter OPN verhoogt de kans op maag uitzaaiing van kanker en de daaropvolgende dood in de Chinese bevolking.
Sleutelwoorden
Osteopontine Maagkanker Polymorfismen genetische varianten metastase Achtergrond
Maagdarmkanker blijft de tweede belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd, goed voor 738.000 doden per jaar [1] . Maagkanker is de derde meest voorkomende kanker bij China. De ontwikkeling van maagkanker wordt voornamelijk geassocieerd met Helicobacter pylori
infectie [2], maar ook andere risicofactoren, zoals een dieet met veel zout, roken, consumptie van gepekelde voedingsmiddelen, en specifieke genetische achtergronden [3]. Het is aangetoond dat H. pylori
infectie een onafhankelijke risicofactor die leidt tot aanhoudende kolonisatie en chronische ontsteking van het maagslijmvlies, waardoor het risico op maagzweren en maagkanker [2, 4-6] verhogen. Echter, er duidelijke inter-individuele verschillen in de mate van ontsteking bij mensen met H. pylori infectie
en klinische gevolgen alleen ontwikkelen in een klein aantal gevallen maagkanker. Multifactoriële modellen suggereert dat de erfelijke gevolg van specifieke variante allelen in polymorfismen de resultaten van de blootstelling van het milieu kan beïnvloeden [7].
Osteopontine (OPN) is een uitgescheiden hechtmiddel phosphoglycoprotein dat een functioneel Gly-Arg-Gly-Asp-Ser bevat celbinding sequentie [8]. Het OPN
gen is in kaart gebracht op chromosoom 4q24-q25, en het is aangetoond dat OPN speelt een belangrijke rol bij tumormetastase [9]. OPN is aangetoond dat expressie in tumorcellen en in het omliggende stroma van talrijke menselijke kankers, zoals colon-, borst-, long-, maag, endometrium, schildklier-, biedt een verbinding met kwaadaardige invasie [10-13]. Eerdere studies toonden aan dat OPN vaak overexpressie in menselijke maagkanker [14], en dat expressie van OPN mRNA was significant hoger bij maagkanker weefsels in vergelijking met niet-tumorweefsels.
Verschillende polymorfismen zijn beschreven voor het OPN
gen, waarvan sommige zijn verbonden met oligoarticulair (of pauciarticular) juveniele idiopathische artritis, nierstenen en chronische hepatitis C [15-18]. Een recente studie [19] dat patiënten met een G /G genotype op nt -156 in de promoter OPN vaker werden gediagnosticeerd met gevorderde stadium (IIIB-IV) niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) dan die met andere genotypen, terwijl een ander rapport suggereerde dat de OPN polymorfisme de genetische factor voor hepatitis B virale klaring en hepatocellulair carcinoom voorkomen [20] kan zijn.
Er zijn nog geen gepubliceerde studies beoordelen van de relatie tussen OPN
genetische polymorfismen en de kans op maag- kankerontwikkeling. Daarom was het doel van deze studie om te bepalen of een verband bestaat tussen OPN polymorfismen en het risico van maagkanker in de Chinese bevolking.
Methods
Onderwerpen van 2005 tot 2008, 310 niet-verwante patiënten met maagkanker (de GC groep), werden ingeschreven bij het First Affiliated Hospital van Nanjing Medical University. Alle patiënten waren etnische Han-Chinezen bewoners die histologisch had bevestigd adenocarcinoom van de maag. De controlegroep (de niet-GC-groep) bestond uit een aselecte steekproef van 591 etnische Han-Chinezen uit de provincie Jiangsu. Na het geven van informed consent, werden alle deelnemers gevraagd om een ​​bloedmonster te bieden. Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de First Affiliated van Nanjing Medical University (É0-SR-073).
Voor het sequencen van de genotypes in de OPN
promotor, gebruikten we SPSS v10.0 (SPSS, Inc ., Chicago, IL, USA) software om willekeurig 200 GC patiënten en geslacht en leeftijd-match hen tot 200 willekeurig geselecteerde controles van de niet-GC-groep. Evalueerden we alle patiënten en controles voor H. pylori
met een indirecte immuno- vaste fase (ICM) test op de aanwezigheid van IgG-antilichamen tegen H. pylori
(Genelabs Diagnostics, Singapore) onderzoeken. Deze testmethode is eerder gevalideerd in ons laboratorium met een nauwkeurigheid van 92,3% [21].
Genomisch DNA van controles en maagkankerpatienten werd geëxtraheerd uit ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) -anticoagulated perifeer bloed volgens traditioneel proteinase K en fenol -chloroform werkwijze en opgeslagen bij -70 ° C.
analyse van polymorfismen in het regulerende gebied OPN
OPN-66, -156 (rs17524488) en -443 (rs11730582) varianten werden gegenotypeerd door directe sequentiebepaling van de sense en anti-sense strengen na polymerase-kettingreactie (PCR) amplificatie van de promoter regulerende gebied -473 tot -3 (voorwaartse primer 5 '- CAA GCT ACT GCA TAC TCG AAA TCA CA-3 '; reverse primer 5 '- ACA ACC AAG CCC TCC CAG AAT TTA-3 '), zoals eerder beschreven [19]. PCR werd uitgevoerd met 50 ng DNA als templaat onder de volgende omstandigheden: 95 ° C gedurende 10 min, vervolgens 36 cycli van 94 ° C gedurende 30 s, een annealing temperatuur gedurende 60 s en 72 ° C gedurende 60 s, met een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 15 minuten. Na affiniteit membraan zuivering met de QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Carlsbad, CA, USA), werden de PCR-producten onderworpen aan cyclische sequentie met de respectieve voorwaartse en omgekeerde primer een geautomatiseerd ABI 3100 DNA sequencer GeneCore Bio Technologies (Shanghai China) .
Luciferase assay met SNP op nucleotide (nt) -443 in de promoter OPN
250 bp fragmenten van OPN promoter (van -590 tot -340) die ofwel T of C allel werden gesynthetiseerd door Invitrogen en ingevoegd stroomopwaarts van het vuurvlieg luciferase gen in het pGL3-enhancer plasmidevector (Promega, USA) in afzonderlijke procedures. Elk construct werd bevestigd door sequentiebepaling. Een reeks OPN promotor-luciferase reporter constructen werden tijdelijk getransfecteerd in de maagkanker cellijnen MKN28 (Shanghai Institute of Digestive Disease) en SGC-7901 (Shanghai Cancer Institute), en transfectie werd uitgevoerd met Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) volgens de protocol van de fabrikant. De MKN28 en SGC-7901 cellijnen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum. De activiteit van de verschillende promoters genotype werd gemeten met de Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA). Alle experimenten werden herhaald in drievoud.
Statistische analyse
Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van SPSS 10.0 software. Kwantitatieve variabelen afwijkt van de normale verdeling, zoals leeftijd, werden samengevat als gemiddelde en de standaarddeviatie (SD). Vergelijking van de leeftijd tussen patiënten en controles werd beoordeeld met behulp van een onafhankelijke t Student's
-test. Vergelijking van de extra-maag-tumoren, H. pylori
infectie en genotype frequenties tussen patiënten en controles werd beoordeeld met behulp van een chi-kwadraat-test en de exacte toets van een Fisher's. Overleving werd berekend met de Kaplan-Meier-methode. Alle waarschijnlijkheid (P
) waarden werden tweezijdige en statistische significantie werd aangeduid als P Restaurant < 0,05.
Resultaten
demografische en klinische kenmerken van de patiënten
maagkanker (GC) groep bestond uit 200 individuen (64% man) met een gemiddelde leeftijd van 56,29 ± 3,46 jaar. De controle (niet-GC) groep bestond uit 200 individuen, waarvan 64% man, met een gemiddelde leeftijd van 55,67 ± 4,21 jaar (tabel 1). Er waren geen significante verschillen in termen van verdeling van leeftijd en geslacht, evenals H. pylori
seropositiviteit. Clinicopathologische kenmerken van de patiënten en controles worden in tabel 1 1.Table clinicopathologic kenmerken van patiënten met maagkanker carcinoom en gezonde controles
Karakteristiek
No. van de patiënten of controles
P
Cases (n)
Control (n)
No.
200
200
Leeftijd, jaren
> 0.05
Mean
56,29
55,67
standaardafwijking
3,46
4.21
Range
63
65
Gender Restaurant > 0.05
Man
130
130
Female
70
70
Helicobacter pylori
infectie
0.12
Seronegatief
62
77
Seropositive
138
123
Vasculaire invasie
Absence
155
- Aanwezigheid
45
- lymfekliermetastasen
afwezigheid
80
- Aanwezigheid
120
- lever metastase
afwezigheid
182
- Aanwezigheid
18
-
peritoneale verspreiding
Absence
172
- Aanwezigheid
28
- TNM stadium
- IA
39
-
IB
40
- II
33
- III
45
- IV
43
-
SNPs in de promotorregio van humaan OPN gen
Directe sequentiebepaling van DNA-fragmenten tussen nt -473 en nt -3 bij patiënten en leeftijd en geslacht gematchte controles is gebleken 3 SNPs in de OPN promotor, gelegen op nt -156 [ ,,,0],GG /GG homozygoten GG /G- (schrapping) heterozygoten, G- /G- homozygoten] nt -443 [CC homozygoten CT heterozygoten, TT homozygoten] en -66 nt (figuur 1), zie tabel 2 . Er was geen significant verschil in de verdeling van deze SNPs (nt -66, -156, -443) tussen GC patiënten en controles. De verdeling van genotypen voor TNM stadia van maagkanker is weergegeven in Tabel 3. Figuur 1 Schematische weergave en sequentiedata van de OPN promoter. Representatieve waarde voor de sequentie analyse van de promotor. De SNP nt -443 heeft de volgende allelen: CC, CT, en TT. Er is een kleine insertie op nt-156, dat drie allelen heeft: G /G, G /GG GG /GG. De SNP nt -66 heeft slechts één allel. TT
Tabel 2 Vergelijking van OPN promotor tussen maagkanker patiënten en gezonde controles
Controls
Patiënten

Maagkanker
genotypen
n
n
P
LN (+)
LN (-)
P


-66
TT
200
200
1.00
124
76
1.00
-156
G/G
86
67
1.00
41
25
1.00
G/GG
78
92
0.064
57
36
0.92
GG/GG
36
41
0.18
25
16
0.91
-443
CC
22
15
1.00
8
8
1.00
CT
93
94
0.28
63
33
0.23
TT
85
91
0.22
53
35
0.45
Tabel 3 De verdeling van de genotypes voor TNM stadia van maagkanker
De TNMs van de maag cancer

Genotypes

IA

IB

II

III

IV

-66
TT
38
44
26
52
40
-156
G/G
16
16
13
20
19
G/GG
16
15
15
16
18
GG/GG
7
9
5
9
6
-443
CC
1
2
1
4
14
CT
17
19
19
19
19
TT
14
18
5
19
29
Echter, met betrekking tot tumor-knoop-metastase TNM stadia, vonden we dat het SNP op nt -443, bij patiënten met de CT genotype was er een significant verschil tussen patiënten met stadium II en IV (P
< 0,01) en tussen stadium IV en alle andere stadia (IA + IB + II + III; P =
0,04; tabel 4). Ook bij patiënten met het CC genotype op nt -443, was er een significant verschil tussen patiënten met stadium IV en stadium I (IA + IB; P = 0,011
) en tussen stadium IV en alle andere stadia (IA + IB + II + III; P
= 0,012; Tabel 4). Er waren geen significante verschillen tussen de TNM stadia en de andere twee SNPs (nt nt -66 en -156) van de OPN promoter. We vonden ook geen verband tussen de SNPs in de OPN-promotor en lymfeklieren metastasis.Table 4 Het genotype verdeling van nt -443 in de OPN promotor door maagkanker TNM stadium
De TNM stadia van maagkanker

genotypen
IA + IB
IV
P
II
IV
P
III
IV
P
IA + IB + II + III
IV

P


-443
TT
32
29
1.00
5
29
1.00
19
29
1.00
56
29
1.00
CT
36
19
0.16
19
19
< 0.01*
19
19
0.33
74
19
0.04*
CC
3
14
0.011*
1
14
0.98
4
14
0.18
8
14
0.012*
* Geeft duidelijk verschil aan (P < 0,05).
Associaties tussen genotypen in de OPN promotorgebied en overleving
Kaplan-Meier schattingen van verschillende genotypen op nt -443 in de OPN
promoter worden in Figuur 2 . de overleving van patiënten met de C /C genotype waren aanzienlijk lager dan de overleving van patiënten met de andere twee genotypen (C /T, T /T). Er waren geen significante associaties tussen overleven en genotypes op de andere sites (nt -156 en nt -66). Figuur 2 Kaplan-Meier significant lager bij maagkanker patiënten met de C /C genotype vergeleken met de andere twee genotypen op nt -443 in OPN promoter.
Effect van -443 T → C polymorfisme op promotoractiviteit Belgique Om het effect van de -443 T → C promotergebied polymorfisme op de transcriptie van het gen OPN
onderzoeken, maten we promoteractiviteit met een Dual Luciferase Reporter assay System en vergeleek de activiteiten van -443C en -443 T allelen met een transiënte transfectie assay met de MKN28 en SGC-7901 cellijnen. Zoals getoond in figuur 3, waren significant hogere luciferase activiteiten gegenereerd met pGL3-C construct in vergelijking met de pGL3-T construct (P = 0,001 voor
MKN28; P = 0,021 voor
SGC-7901). Figuur 3 Effect van de T → C -443 polymorfisme op promotoractiviteit. Waren significant hogere luciferase activiteiten die door de pGL3-C construct in vergelijking met de pGL3-T construct (P = 0,001 voor
MKN28; P = 0,021 voor
SGC-7901)
Bespreking
montage. aanwijzingen dat OPN speelt een rol in de regulatie van tumormetastase en OPN expressie bijzonder hoog in metastatische tumoren [22]. OPN overexpressie wordt gebracht in kankers die een sterke neiging voor het vormen van botmetastasen. In botmetastasen wordt OPN algemeen geassocieerd met de interface tussen het carcinoom en het botoppervlak, en dit lijkt verband te houden met verhoogde bot resorptie activiteit van osteoclasten [23]. Voorts wordt hoge expressie OPN in de primaire tumor geassocieerd met vroege metastase en slechte klinische uitkomst bij menselijke maagkanker en andere kankers [24-27].
Een recente studie suggereert dat OPN promoter geassocieerd met NSCLC [19]. In de huidige studie, hebben we ons gericht op de betrokkenheid van deze SNPs met GC, en hoewel de verdeling van de genotypes in de OPN
promotor was niet significant verschillend tussen de GC-patiënten en gezonde controles, waren er significante verschillen in de verdeling van de genotypes ( CC) op nt -443 tussen patiënten met stadium IV stadium I en maagkanker (IA + IB) en tussenfase IV en de gecombineerde andere drie stadia van maagkanker (IA + IB + II + III; Tabel 4). De overleving van patiënten met de C /C genotype waren significant lager dan de overlevingskansen van de andere twee genotypen (C /T, T /T; Figuur 3). Bovendien werden significant hogere luciferase activiteiten gegenereerd met pGL3-C construct in vergelijking met de pGL3-T construct. Reportergen analyse blijkt dat het haplotype -443C /-156 G /-66 T is geassocieerd met significant verhoogde promotor activiteit vergeleken met vijf andere allelische varianten getest [28]. Een recente studie over melanoommetastasen vond dat zij homozygoot zijn voor het allel -443C tot expressie significant hogere OPN mRNA in vergelijking met die welke ofwel heterozygoot (CT) of homozygoot voor het T-allel -443 [29] was. Transcriptiefactor c-Myb bindt aan het gebied van de OPN promoter in een allel-specifieke wijze en induceert verhoogde activiteit van de -443C vergelijking met -443 T OPN
promotor [30]. Samengenomen suggereren deze gegevens dat de variatie op nt -443 in de promoter OPN speelt een rol in GC en metastase, in het bijzonder voor het CC genotype op nt -443 in de OPN
promoter. Of de polymorfismen van OPN is gerelateerd aan expressie van OPN in kankerpatiënten onbekend hoewel. Overexpressie van OPN werd gevonden in maagkanker monsters in een eerder onderzoek [14]. Daarom zijn aanvullende studies nodig zijn om deze bevinding verder te ontrafelen.
In de huidige studie, vonden we dat de CT genotype op nt -443 in de OPN promotor toonde significante verschillen tussen stadium IV en fase II maagkanker, en ook tussen het podium IV en andere stadia van maagkanker (IA + IB + II + III), maar niet tussen stadium IV en stadium III of fase I. de voornaamste reden hiervoor kan zijn vanwege het beperkte aantal patiënten in elke subgroep. Het is ook mogelijk dat de transcriptiefactor c-Myb de activiteit van het gebied van de OPN
promotor die de CC of CT genotypen aanwezig kunnen zijn verbeterd, maar niet de andere genotype (d.w.z. TT) [29]. Echter, deze hypothesen nader bestudeerd moeten worden in grotere studies. Ondernemingen De huidige genomische bevindingen bij gezonde controles waren niet identiek aan eerdere bevindingen onder de Japanse en Italiaanse controle onderwerpen [30, 31]. Hoewel eerdere rapporten suggereren dat hoge OPN expressie wordt gebracht in hoge niveaus in GC [17], vonden we geen verband tussen de genotypes van de OPN
promoter met het risico van GC. Wij hebben echter gevonden etnische verschillen in SNPs meerdere genen samen met GC patiënten [30, 31]. Daarom kan de huidige bevindingen niet voor alle bevolkingsgroepen. Niettemin, hoewel er geen verband tussen OPN SNPs en GC maagkanker gevoeligheid of ernst Chinese patiënten Onze resultaten suggereren dat er een associatie met metastase van GC.

Conclusie Concluderend is de eerste studie OPN genetische polymorfismen en het risico van GC in een Chinese bevolking. We hebben aangetoond dat genetische polymorfismen bij -443 in de OPN promotor geassocieerd met metastase en daaropvolgende dood van GC. Daarom kunnen deze bevindingen een benadering bieden voor het klinische verloop van GC patiënten te voorspellen. Echter, zijn aanvullende studies nodig met behulp van een grotere groep patiënten om deze bevindingen te bevestigen.
Notes
Fujun Zhao, Xiaoyi Chen eveneens bijgedragen aan dit werk.
Verklaringen
Dankwoord
Dit werk werd gesteund door Natuurwetenschappen Funds of China (nr 81072032 en 30770992). De auteurs danken Medjaden Bioscience Limited voor proeflezen het manuscript.
Authors 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan ​​de links naar de auteurs oorspronkelijke ingediende dossiers voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12885_2012_3447_MOESM2_ESM.tiff Authors' 12885_2012_3447_MOESM1_ESM.pdf Auteurs originele bestand voor figuur 2 12885_2012_3447_MOESM3_ESM.tiff Authors 'originele bestand voor figuur 3 Concurrerende belangen Ondernemingen De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Auteurs bijdragen
ZF deel aan de opzet van het onderzoek en de statistische analyse uitgevoerd, CX voerde de Luciferase assay, MT, HB bedacht de studie en particpated het ontwerp en coördinatie, ZZ, ZG deel aan de opzet van de studie. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• De transcriptiefactor FOXO4 is down-gereguleerd en remt de tumor proliferatie en metastase bij maagkanker
• Fase I studie van imatinib, cisplatine en 5-fluoruracil of capecitabine in geavanceerde slokdarm en de maag adenocarcinoom