polimorfismi genetici nel promotore osteopontina aumenta il rischio di metastasi a distanza e di morte nei pazienti cinesi con cancro gastrico

polimorfismi genetici nel promotore osteopontina aumenta il rischio di metastasi a distanza e di morte nei pazienti cinesi con cancro gastrico
Abstract
sfondo
in vitro e in vivo

studi hanno suggerito che osteopontina (OPN) è associato con molti tipi di tumori. Tuttavia, nessuno studio ha riportato l'incidenza di polimorfismi OPN e il rischio di cancro gastrico. Lo scopo di questo studio è stato quello di indagare l'associazione tra polimorfismi OPN e cancro gastrico in una popolazione cinese paziente.
Metodi
Tre varianti genetiche nel promotore OPN sono stati genotipizzati utilizzando sequenziamento diretto in 200 pazienti affetti da cancro gastrico e 200 di genere e di pari età controlli privi di tumore. La curva di sopravvivenza a 4 anni è stato calcolato utilizzando il metodo di Kaplan-Meier e confrontata con il log-rank test per ogni sito polimorfismi a singolo nucleotide (SNP). Abbiamo misurato l'attività del promotore del -443 T → C polimorfismo usando un test giornalista luciferasi doppio.
Risultato
Per la variante a nt -443 (CC), c'è stata una differenza significativa tra il numero di pazienti con stadio IV e quelli con stadio I cancro gastrico (IA + IB; P = 0,014
) e tra quelli con stadio IV e tutti gli altri stadi del cancro gastrico (IA + IB + II + III; P = 0,02
). Per la variante a nt -443 (CT), vi era una differenza significativa tra il numero di pazienti affetti da cancro gastrico in stadio IV e quelli con stadio II (P = 0,013
). I tassi di sopravvivenza per i pazienti con il genotipo C /C erano significativamente più bassi rispetto ai pazienti con gli altri due genotipi (C /T, T /T). Inoltre, sono stati osservati attività luciferasi significativamente più elevati nel costrutto pGL3-C rispetto al costrutto pGL3-T.
Conclusioni
Questo studio fornisce la prima evidenza che la variazione in nt -443 nel promotore OPN aumenta il potenziale per gastrica metastasi del cancro e la successiva morte nella popolazione cinese.
Parole
osteopontina cancro gastrico polimorfismi genetici varianti metastasi Sfondo
adenocarcinoma gastrico resta la seconda causa di decessi correlati al cancro in tutto il mondo, che rappresentano 738.000 morti ogni anno [1] . cancro gastrico è il terzo tumore più comune in Cina. Lo sviluppo del cancro gastrico è associata principalmente con Helicobacter pylori
infezione [2], ma anche altri fattori di rischio includono una dieta ricca di sale, il fumo, il consumo di cibi in salamoia, e background genetici specifici [3]. E 'stato dimostrato che H. pylori
infezione è un fattore di rischio indipendente che conduce alla colonizzazione persistente e infiammazione cronica della mucosa gastrica, aumentando così il rischio di sviluppare ulcera peptica e cancro gastrico [2, 4-6]. Tuttavia, vi sono marcate differenze inter-individuali nella misura di infiammazione tra le persone con H. pylori
infezione e conseguenze cliniche svilupparsi solo in un piccolo numero di casi di cancro gastrico. modelli multifattoriali suggeriscono che la suscettibilità genetica a causa di specifiche varianti alleliche di polimorfismi può influenzare gli esiti di esposizione ambientale [7]
. osteopontina (OPN) è un phosphoglycoprotein adesivo secreta che contiene un funzionale Gly-Arg-Gly-Asp-Ser cell-binding sequenza [8]. Il
gene OPN è stato mappato al cromosoma 4q24-q25, ed è stato dimostrato che OPN svolge un ruolo importante nella metastasi tumorali [9]. OPN ha dimostrato di essere espresso all'interno delle cellule tumorali e nello stroma circostante di numerosi tumori umani, come del colon, della mammella, del polmone, dello stomaco, endometrio, e la tiroide, fornendo un collegamento con l'invasione maligno [10-13]. Studi precedenti hanno dimostrato che OPN è spesso sovraespresso nel cancro gastrico umano [14], e che l'espressione di OPN mRNA era significativamente più alta nei tessuti di cancro gastrico rispetto ai tessuti non tumorali.
diversi polimorfismi sono stati descritti per la
OPN gene, alcuni dei quali sono associati con oligoarticolare (o pauciarticular) artrite giovanile idiopatica, nefrolitiasi, e l'epatite cronica C [15-18]. Un recente studio [19] ha riferito che i pazienti con un genotipo G /G a nt -156 nel promotore OPN sono stati più frequentemente diagnosticati con stadio avanzato (IIIB-IV) non a piccole cellule del polmone (NSCLC) rispetto a quelli con altri genotipi, mentre un altro rapporto ha suggerito che il polimorfismo OPN potrebbe essere il fattore genetico per l'epatite B clearance virale e il carcinoma epatocellulare occorrenza [20].
non ci sono studi pubblicati che valutano il rapporto tra OPN
polimorfismi genetici e il rischio di gastrica lo sviluppo del cancro. Pertanto, lo scopo di questo studio era di determinare se esiste un'associazione tra i polimorfismi OPN e il rischio di cancro gastrico nella popolazione cinese.
Metodi
Soggetti Dal 2005 al 2008, 310 pazienti non imparentati con cancro gastrico (GC gruppo), sono stati arruolati presso il primo Ospedale Affiliato di Nanjing Medical University. Tutti i pazienti erano di etnia residenti cinesi Han che avevano istologicamente confermato adenocarcinoma gastrico. Il gruppo di controllo (gruppo non-GC) consisteva di un campione casuale di 591 di etnia cinese Han Da Provincia di Jiangsu. Dopo aver dato il consenso informato scritto, tutti i partecipanti sono stati invitati a fornire un campione di sangue. Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico della prima Affiliated di Nanjing Medical University (2010 N.-SR-073).
Prima di sequenziamento dei genotipi in OPN
promotore, abbiamo usato SPSS v10.0 (SPSS, Inc. ., Chicago, iL, USA) il software per selezionare in modo casuale 200 pazienti GC e genere e loro età corrisponde a 200 controlli selezionati in modo casuale al gruppo non-GC. Abbiamo valutato tutti i pazienti e controlli per H. pylori
utilizzando un test indiretto fase immunocromatografico solida (ICM) per indagare la presenza di anticorpi IgG anti H. pylori
(Genelabs Diagnostics, Singapore). Questo metodo è stato convalidato in precedenza nel nostro laboratorio con una precisione del 92,3% [21].
DNA genomico da controlli e pazienti con cancro gastrico è stato estratto da acido ethylenediaminetetracetic (EDTA) -anticoagulated sangue periferico secondo la proteinasi K tradizionale e fenolo metodo -chloroform, e conservato a -70 ° C.
analisi dei polimorfismi nella regione normativo OPN
il OPN-66, -156 (rs17524488), e -443 (rs11730582) varianti sono stati genotipizzati mediante sequenziamento diretto del il senso e anti-senso fili seguenti reazione a catena della polimerasi (PCR) amplificazione della regione regolatoria promotore -473 a -3 (primer forward 5 '- CAA TCA GCT ACT GCA TAC TCG AAA CA-3 '; inversione di fondo 5 '- ACA ACC AAG CCC TCC CAG AAT TTA-3 '), come descritto in precedenza [19]. PCR è stata eseguita usando DNA 50 ng come modello nelle seguenti condizioni: 95 ° C per 10 min, quindi 36 cicli di 94 ° C per 30 s, una temperatura di ricottura per 60 s, e 72 ° C per 60 s, con estensione finale a 72 ° C per 15 min. Dopo la purificazione membrana affinità con il kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Carlsbad, CA, USA), i prodotti di PCR sono stati sottoposti a sequenziamento ciclo con il rispettivo avanti e retromarcia fondo utilizzando un processo automatizzato ABI 3100 DNA sequencer per GeneCore Bio Technologies (Shanghai Cina) .
saggio luciferasi con SNP al nucleotide (nt) -443 nel promotore OPN
I 250 bp frammenti del promotore OPN (da -590 a -340) che trasportano sia l'allele T o C sono stati sintetizzati da Invitrogen e inserita a monte del gene della luciferasi di lucciola nel plasmide vettore pGL3-Enhancer (Promega, USA) in procedure separate. Ogni costrutto è stato confermato mediante sequenziamento. Una serie di OPN promotore-luciferasi costrutti reporter sono stati trasfettate nelle linee gastrica di cellule di cancro MKN28 (Shanghai Institute of Disease Digestive) e SGC-7901 (Shanghai Cancer Institute), e trasfezione è stata effettuata con Lipofectamine 2000 Reattivo (Invitrogen) secondo il protocollo del produttore. Le linee cellulari MKN28 e SGC-7901 sono state coltivate in terreno Dulbecco modificato Eagle (DMEM) integrato con siero fetale bovino 10% inattivato al calore. L'attività dei diversi promotori genotipo è stata misurata utilizzando la luciferasi Reporter Assay System (Promega, USA). Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti in triplicato.
Analisi statistica
analisi statistica è stata effettuata utilizzando il software SPSS 10.0. Quantitativi variabili in partenza dalla distribuzione normale, tra cui l'età, sono stati riassunti come media e deviazione standard (SD). Confronto di età compresa tra casi e controlli è stata valutata utilizzando t di uno studente indipendente
-test. Confronto di tumori extra-gastrici, H. pylori
infezione, e frequenze genotipiche tra casi e controlli è stata valutata utilizzando un test chi-quadrato e il test esatto di Fisher. La sopravvivenza è stata calcolata con il metodo di Kaplan-Meier. Tutti (P)
valori di probabilità sono stati a due code e significatività statistica è stato indicato come P
< 0.05.
Risultati
demografica e caratteristiche cliniche dei pazienti
Il cancro gastrico (GC) gruppo era composto da 200 soggetti (64% maschi), con un'età media di 56.29 ± 3,46 anni. Il (non-GC) gruppo di controllo era costituito da 200 individui, di cui il 64% era di sesso maschile, con un'età media di 55.67 ± 4,21 anni (Tabella 1). Non ci sono state differenze significative in termini di distribuzione di età e sesso, nonché H. pylori
sieropositività. caratteristiche clinico-patologiche dei pazienti e controlli sono riportati nella tabella 1 1.Table caratteristiche clinico-patologiche dei pazienti con carcinoma cancro gastrico e controlli sani
Caratteristica
No. dei pazienti o controlli
P
casi (n)
di controllo (n)
n
200
200
Età, anni
> 0.05
Mean
56.29
55.67
Deviazione standard
3.46
4.21
Gamma
63
65
genere
> 0.05
Maschio
130
130
femminile
70
70
Helicobacter pylori
infezione
0.12
sieronegative
62
77
sieropositivi
138
123
vascolare invasione
Assenza
155 -
Presenza
45 -
metastasi linfonodali
assenza
80 -
Presenza
120 -
fegato metastasi
assenza
182 -
Presenza
18
-
peritoneale diffusione
Assenza
172 -
Presenza
28 -
stadio TNM -
IA
39
-
IB
40 -
II
33 -
III
45 -
IV
43
-
SNPs nella regione del promotore del gene umano OPN
sequenziamento diretto dei frammenti di DNA tra nt -473 e nt -3 in pazienti e controlli appaiati per età e sesso ha rivelato 3 SNPs nel promotore OPN, che si trova a nt -156 [ ,,,0],GG /omozigoti GG, GG /G- (soppressione) eterozigoti, G- /G- omozigoti], NT -443 [omozigoti CC, eterozigoti CT, omozigoti TT], e nt -66 (Figura 1), come mostrato nella tabella 2 . non vi era alcuna differenza significativa nella distribuzione di questi SNP (nt -66, -156, -443) tra pazienti e controlli GC. La distribuzione dei genotipi di stadi TNM a cancro gastrico è mostrato nella Tabella 3. Figura 1 schema e sequenziamento schematici dati del promotore OPN. dato rappresentativo per l'analisi di sequenziamento sul promotore. L'SNP nt -443 ha le seguenti alleli: CC, CT, e TT. C'è un piccolo inserimento nt-156, che ha tre alleli: G /G, G /GG, GG /GG. L'SNP nt -66 ha un solo allele:. TT
Tabella 2 Confronto di OPN promotore tra i pazienti di cancro gastrico e controlli sani
Controls
pazienti

cancro gastrico
genotipi
n
n
P
LN (+)
LN (-)
P


-66
TT
200
200
1.00
124
76
1.00
-156
G/G
86
67
1.00
41
25
1.00
G/GG
78
92
0.064
57
36
0.92
GG/GG
36
41
0.18
25
16
0.91
-443
CC
22
15
1.00
8
8
1.00
CT
93
94
0.28
63
33
0.23
TT
85
91
0.22
53
35
0.45
Tabella 3 La distribuzione dei genotipi per le fasi TNM a cancro gastrico
Il TNMs di gastrico cancer

Genotypes

IA

IB

II

III

IV

-66
TT
38
44
26
52
40
-156
G/G
16
16
13
20
19
G/GG
16
15
15
16
18
GG/GG
7
9
5
9
6
-443
CC
1
2
1
4
14
CT
17
19
19
19
19
TT
14
18
5
19
29
Tuttavia, per quanto riguarda le fasi TNM del tumore-node-metastasi, abbiamo scoperto che per l'SNP a nt -443, tra i pazienti con il genotipo CT, vi era una differenza significativa tra i pazienti con stadi II e IV (P
< 0,01) e tra stadio IV e tutte le altre fasi (IA + IB + II + III; P = 0,04
; Tabella 4). Allo stesso modo, tra i pazienti con il genotipo CC a nt -443, vi era una differenza significativa tra i pazienti con stadi IV e stadio I (IA + IB; P = 0.011
) e tra stadio IV e tutte le altre fasi (IA + IB + II + III; P = 0.012
; Tabella 4). Non ci sono state differenze significative tra le fasi TNM e gli altri due SNPs (nt -66 e -156 nt) del promotore OPN. Abbiamo anche trovato alcuna associazione tra l'SNP in OPN promotore e dei linfonodi metastasis.Table 4 La distribuzione del genotipo di nt -443 nel promotore OPN da cancro gastrico TNM fase
Le fasi TNM del cancro gastrico

genotipi
IA + IB
IV
P
II
IV
P
III
IV
P
IA + IB + II + III
IV

P


-443
TT
32
29
1.00
5
29
1.00
19
29
1.00
56
29
1.00
CT
36
19
0.16
19
19
< 0.01*
19
19
0.33
74
19
0.04*
CC
3
14
0.011*
1
14
0.98
4
14
0.18
8
14
0.012*
* Indica una differenza significativa (P < 0,05).
Associazioni tra genotipi nella regione OPN promotore e la sopravvivenza
Kaplan-Meier stime di diversi genotipi a nt -443 nel OPN
promotore sono mostrati in figura 2 . i tassi di sopravvivenza per i pazienti con il genotipo C /C erano significativamente più bassi rispetto ai tassi di sopravvivenza per i pazienti con gli altri due genotipi (C /T, T /T). Non c'erano associazioni significative tra la sopravvivenza e genotipi presso gli altri siti (nt -156 e -66 nt). Figura 2 Kaplan-Meier di sopravvivenza è significativamente più bassa nei pazienti con cancro gastrico con il genotipo C /C rispetto agli altri due genotipi a nt -443 a OPN promotore.
Effetto del polimorfismo -443 T → C sulla attività del promotore
per esaminare l'effetto del -443 T → C regione del promotore polimorfismo sulla trascrizione del gene OPN
, abbiamo misurato attività del promotore con un luciferasi doppio Reporter sistema di test e rispetto alle attività del -443C e -443 T alleli utilizzando un saggio di trasfezione transiente con il MKN28 e linee di cellule SGC-7901. Come mostrato in figura 3, attività luciferasi significativamente più elevati sono stati generati con il costrutto pGL3-C rispetto al costrutto pGL3-T (P = 0,001
per MKN28; P = 0.021
per SGC-7901). Figura 3 Effetto del -443 T → C polimorfismo sulla attività del promotore. Significativamente attività luciferasi più alti sono stati generati dal costrutto pGL3-C rispetto al costrutto pGL3-T (P = 0,001
per MKN28; P = 0,021
per SGC-7901)
Discussione
di montaggio. l'evidenza suggerisce che OPN gioca un ruolo nella regolazione della metastasi tumorali e che l'espressione OPN è particolarmente elevata nei tumori metastatici [22]. OPN è sovraespresso nei tumori che hanno una elevata propensione per la formazione di metastasi ossee. In metastasi ossee, OPN è generalmente associata con l'interfaccia tra il carcinoma e la superficie ossea, e questo sembra essere correlato all'aumento dell'attività riassorbimento osseo da osteoclasti [23]. Inoltre, elevata espressione di OPN nel tumore primario è associato a metastasi precoce e poveri risultati clinici nel carcinoma gastrico umano e di altri tumori [24-27].
Un recente studio ha suggerito che il promotore OPN è stato associato con NSCLC [19]. Nel presente studio, ci siamo concentrati sulla associazione di questi SNP con GC, e anche se la distribuzione dei genotipi in OPN
promotore non era significativamente differente tra i pazienti CG e controlli sani, vi erano differenze significative nella distribuzione dei genotipi ( CC) a nt -443 tra i pazienti con stadio IV e stadio i cancro gastrico (IA + IB) e tra stadio IV e gli combinati altri tre stadi del cancro gastrico (IA + IB + II + III; Tabella 4). I tassi di sopravvivenza per i pazienti con il genotipo C /C erano significativamente più bassi rispetto ai tassi di sopravvivenza degli altri due genotipi (C /T, T /T; Figura 3). Inoltre, attività luciferasi significativamente più elevati sono stati generati con il costrutto pGL3-C rispetto al costrutto pGL3-T. analisi gene reporter ha dimostrato che la -443C aplotipo /-156 G /-66 T è associato con l'attività del promotore notevolmente migliorato rispetto ad altri cinque varianti alleliche testati [28]. Un recente studio sulle metastasi di melanoma ha trovato che coloro omozigoti per l'allele -443C espresso livelli significativamente più elevati di OPN mRNA rispetto a quelli che erano o eterozigoti (CT) o omozigoti per l'allele T -443 [29]. fattore di trascrizione c-Myb si lega alla regione del promotore OPN in modo allele-specifica e induce maggiore attività del -443C rispetto al -443 T OPN
promotore [30]. Presi insieme, questi dati suggeriscono che la variazione in nt -443 nel promotore OPN svolge un ruolo nella progressione GC e metastasi, soprattutto per il genotipo CC a nt -443 nel OPN
promotore. Sia il polimorfismi di OPN è legato alla espressione di OPN nel cancro pazienti rimangono sconosciute, anche se. Over-espressione di OPN è stato trovato in campioni di cancro gastrico in uno studio precedente [14]. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per chiarire ulteriormente questo risultato.
Nel presente studio, abbiamo scoperto che il genotipo CT a nt -443 nel promotore OPN ha mostrato differenze significative tra stadio IV e la fase II cancro gastrico, e anche tra il palco IV e le altre fasi del cancro gastrico (IA + IB + II + III), ma non tra stadio IV e stadio III o fase I. la ragione principale di questo può essere dovuto al limitato numero di pazienti in ciascun sottogruppo. È anche possibile che il fattore di trascrizione c-Myb avrebbe migliorato l'attività della regione del promotore OPN
che conteneva il CC o genotipi CT, ma non il genotipo (cioè, TT) [29]. Tuttavia, queste ipotesi richiedono ulteriori indagini in studi più ampi.
I presenti risultati genomici nei controlli sani non erano identiche alle precedenti scoperte tra i soggetti di controllo giapponesi e italiani [30, 31]. Anche se i rapporti precedenti suggeriscono che l'alta OPN è espressa ad alti livelli in GC [17], non abbiamo trovato alcuna associazione tra i genotipi del OPN
promotore con il rischio di GC. differenze etniche Tuttavia, abbiamo trovato in SNPs di diversi geni ospitanti in pazienti CG [30, 31]. Pertanto, i risultati attuali potrebbero non essere applicabili a tutte le popolazioni. Tuttavia, anche se non vi era alcuna associazione tra OPN SNP e GC gastrica suscettibilità al cancro o la gravità in pazienti cinesi, i nostri risultati suggeriscono che ci sia un'associazione con metastasi del GC.
Conclusione
In conclusione, questo è il primo studio di OPN polimorfismi genetici e il rischio di GC in una popolazione cinese. Abbiamo dimostrato che polimorfismi genetici a -443 nel promotore OPN sono associati a metastasi e la successiva morte di GC. Pertanto, questi risultati possono offrire un approccio di prevedere l'esito clinico dei pazienti GC. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi con un più ampio gruppo di pazienti al fine di confermare questi risultati
. Note
Fujun Zhao, Xiaoyi Chen contribuito in maniera uguale a questo lavoro
. Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questo lavoro è stata sostenuta da fondi di Scienze naturali della Cina (n ° 81.072.032 e 30.770.992). Gli autori ringraziano Medjaden Bioscience Limited per la correzione del manoscritto.
Autori fascicoli presentati originali per
di seguito sono riportati i link ai file degli autori originali inviati per le immagini. 'file originale per la figura 1 12885_2012_3447_MOESM2_ESM.tiff Autori 12885_2012_3447_MOESM1_ESM.pdf autori file originale per la figura 2 12885_2012_3447_MOESM3_ESM.tiff Autori file originale per gli interessi figura 3 Competere
Gli autori dichiarano interessi in gioco.
autori contributi
ZF partecipato alla progettazione dello studio ed eseguito l'analisi statistica, CX effettuato il saggio luciferasi, MT, HB concepito dello studio, e particpated nel design e coordinamento, ZZ, ZG partecipato alla progettazione dello studio. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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