Генетические полиморфизмы промотора остеопонтина увеличивает риск метастазирования расстояния и смерти у китайских больных с желудочной cancer

генетическим полиморфизмом в промоторе остеопонтина увеличивает риск метастазирования расстояния и смерти в китайских пациентов с раком желудка
Аннотация
Справочная информация <бр> в пробирке
и в естественных условиях
исследования предположили, что остеопонтина (OPN) связан со многими видами рака. Тем не менее, никаких исследований не сообщили о заболеваемости OPN полиморфизмов и риск развития рака желудка. Целью данного исследования было изучение взаимосвязи между OPN полиморфизмов и рака желудка в китайской популяции пациентов.
Методов
Три генетические варианты в промотор OPN генотипирования с использованием прямого секвенирования в 200 больных раком желудка и 200 гендерно и соответствующего возраста без рака управления. Кривая выживаемости 4 года была рассчитана с использованием метода Каплана-Мейера и сравнивали с помощью теста лог-ранга для каждого сайта полиморфизм единичного нуклеотида (SNP). Мы измерили промоторной активности -443 T → C полиморфизма с помощью двойного анализа люциферазы репортер.
Результат
Для варианта нуклеотида -443 (CC), существует значительная разница между числом пациентов со стадией IV и те со стадией I рака желудка (IA + IB; P = 0,014
) и между теми, с IV стадией и всех других стадиях рака желудка (IA + IB + II + III; P = 0,02
). Для варианта нуклеотида -443 (КТ), существует значительная разница между количеством больных раком желудка с IV стадией и те, со стадией II (P = 0,013)
. Показатели выживаемости пациентов с генотипом С /С, были значительно ниже, чем у пациентов с двумя другими генотипами (С /Т, Т /Т). Кроме того, наблюдались значительно более высокие люциферазные деятельность в конструкции pGL3-C по сравнению с pGL3-T конструкции.
Выводы
Это исследование дает первое доказательство того, что изменение нуклеотида -443 в промоторе OPN увеличивает потенциал для желудка метастазы рака и последующая смерть в китайской популяции.
Ключевые слова
остеопонтина рак желудка полиморфизмы Генетические варианты метастазы фон
аденокарциномы желудка остается второй ведущей причиной смертности от онкологических заболеваний во всем мире, что составляет 738,000 смертей в год [1] , Рак желудка является третьим наиболее распространенным видом рака в Китае. Развитие рака желудка связано преимущественно с Helicobacter Pylori
инфекции [2], но и другие факторы риска включают диеты с высоким содержанием соли, курение, потребление соленых продуктов, а также специфические генетические фоны [3]. Было показано, что H. Pylori
инфекция является независимым фактором риска, который приводит к постоянной колонизации и хроническое воспаление слизистой оболочки желудка, тем самым увеличивая риск развития пептической язвы и рака желудка [2, 4-6]. Тем не менее, существуют заметные между индивидуальные различия в степени воспаления у лиц с H. Pylori
инфекции и клинические последствия развиваются лишь в небольшом количестве случаев рака желудка. Многофакторные модели позволяют предположить, что генетическая предрасположенность из-за специфических вариантов аллелей полиморфизма могут повлиять на результаты воздействия окружающей среды [7].
Остеопонтин (ОПН) представляет собой секретируемый клей phosphoglycoprotein, который содержит функциональный Gly-Arg-Gly-Asp-Ser клеточного связывания последовательность [8]. Ген OPN
был картирован на хромосоме 4q24-Q25, и было показано, что OPN, играет важную роль в метастазировании опухолей [9]. OPN, было показано, экспрессируется в опухолевых клетках и в окружающей стромы многочисленных человеческих раковых клеток, таких как рак толстой, молочной железы, легкого, желудка, матки и рака щитовидной железы, обеспечивая связь со злокачественными инвазии [10-13]. Предыдущие исследования показали, что OPN, часто избыточно экспрессируется при раке желудка человека [14], и что экспрессия мРНК OPN была значительно выше в желудочных раковых тканей по сравнению с неопухолевой ткани.
Несколько полиморфизмы были описаны для OPN
ген, некоторые из которых связаны с олигоартикулярная (или pauciarticular) ювенильный идиопатический артрит, почечно-каменной болезни и хронического гепатита с [15-18]. В недавнем исследовании [19] сообщили, что пациенты с генотипом G /G нуклеотида -156 в промоторе OPN были чаще диагностированы с продвинутой стадии (IIIB-IV) немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), чем те, с другими генотипами, в то время как другой отчет предположил, что полиморфизм OPN может быть генетический фактор для вирусного гепатита клиренса и возникновения гепатоцеллюлярной карциномы [20]. не
Есть в настоящее время нет опубликованных исследований, оценивающих отношения между OPN
генетических полиморфизмов и риск желудка развитие рака. Таким образом, цель данного исследования состояла в том, чтобы определить, является ли объединение существует между OPN полиморфизмов и риском развития рака желудка в китайской популяции.
Методы
Субъекты С 2005 по 2008, 310 неродственных пациентов с раком желудка (ГХ группа), были включены в первый филиал больницы Нанкин медицинского университета. Все пациенты были этническими Хань китайские жители, которые имели гистологически подтвержденные аденокарциномы желудка. Контрольная группа (не-GC группа) состояла из случайной выборки из 591 этнических ханьцев из провинции Цзянсу. После предоставления письменного информированного согласия, всем участникам было предложено представить образец крови. Данное исследование было одобрено Комитетом по этике первый филиал Нанкин медицинского университета (É0-SR-073) путем.
Перед секвенирования генотипов в OPN
промотор, мы использовали SPSS v10.0 (SPSS, Inc ., Чикаго, Иллинойс, США) программное обеспечение для случайного выбора 200 пациентов GC и полу и возрасту соответствует их 200 случайным образом выбранных управлений не-GC группы. Мы оценивали у всех пациентов и контроль в отношении H. Pylori изображения с помощью непрямой твердофазный иммунохроматографический (ИВМ) анализа для исследования на наличие IgG антител к H. Pylori
(Genelabs Diagnostics, Сингапур). Этот метод испытаний был предварительно подтверждено в нашей лаборатории с точностью до 92,3% [21].
Геномную ДНК из контрольной и у больных раком желудка была извлечена из этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) -anticoagulated периферической крови в соответствии с традиционным протеиназы К и фенола метод хлороформ, и хранили при -70 ° с.
Анализ полиморфизмов в регуляторной области OPN
The OPN-66, -156 (rs17524488) и -443 (rs11730582) варианты генотипирования путем прямого секвенирования смысл и антисмысловые нити следующие полимеразной цепной реакции (ПЦР) в регуляторной области промотора -473 до -3 (прямой праймер 5 '- CAA GCT ACT GCA TAC TCG AAA TCA CA-3 '; обратный праймер 5 '- ACA ACC AAG CCC ТСС CAG TTA AAT-3 '), как описано ранее [19]. ПЦР проводили с использованием 50 нг ДНК в качестве матрицы, при следующих условиях: 95 ° C в течение 10 мин, затем 36 циклов при 94 ° С в течение 30 с, при температуре отжига в течение 60 с и 72 ° С в течение 60 с, а установленный окончательное удлинение при 72 ° С в течение 15 мин. После очистки мембранной аффинности с использованием QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Карлсбад, Калифорния, США), ПЦР-продукты подвергали секвенированию цикла с соответствующим прямого и обратного праймера, с использованием автоматизированной ABI 3100 ДНК секвенсор GeneCore Bio Technologies (Шанхай) .
люциферазы с SNP в нуклеотида (нт) -443 в промоторе OPN
250 фрагментов п.н. промотора OPN (от -590 до -340), несущих либо Т или с аллель были синтезированы Invitrogen и вставляется перед светлячка гена люциферазы в плазмидный вектор pGL3-Enhancer (Promega, США) в отдельных процедурах. Каждая конструкция была подтверждена секвенированием. Серия OPN промотор-люциферазы конструкции были трансфицированы в клетку рака желудка линии MKN28 (Шанхайский институт заболеваний пищеварительной системы) и СГК-7901 (Шанхайский институт рака) и трансфекцию проводили с Липофектамин 2000 Reagent (Invitrogen) в соответствии с протокол производителя. Клеточные линии MKN28 и СГК-7901 культивировали в среде Игла в модификации Игла (DMEM), дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки. Активность различных генотипов промоторы измеряли с использованием люциферазы систему анализа (Promega, США). Все эксперименты были повторены в трех экземплярах.
Статистический анализ
Статистический анализ проводили с использованием программы SPSS 10.0 программного обеспечения. Количественные переменные, вылетающие из нормального распределения, в том числе возраст, были обобщены в виде среднего значения и стандартного отклонения (SD). Сравнение возраста между случаями и контролем оценивали с помощью т независимого Стьюдента
-тесту. Сравнение экстра-опухоли желудка, H. Pylori
инфекции, а также частот генотипов между случаями и контролем оценивали с помощью критерия хи-квадрат и точный критерий Фишера в. Выживание рассчитывали по методу Каплана-Мейера. Все вероятности (P)
значения были двухвостый и статистической значимости было указано, как P &
ЛТ; 0.05.
Результаты
Демографические и клинические особенности пациентов
желудочным раком (GC) группа состояла из 200 человек (64% мужчин), со средним возрастом 56,29 ± 3,46 лет. Контроль (без ГХ) группа состояла из 200 человек, из которых 64% составляли мужчины, со средним возрастом 55,67 ± 4,21 лет (таблица 1). Там не было никаких существенных различий с точки зрения распределения возраста и пола, а также H. Pylori
серопозитивностью. Клиникопатологическими характеристики пациентов и контроля приведены в таблице 1.Table 1 клиникопатологическими характеристики больных с желудочной карциномой раком и здоровых людей
Характеристика

No. пациентов или управления

P



случаях (п)

управления (п)


No. <бр> 200
200
Возраст, лет
> 0,05
Среднее
56,29
55.67
Стандартное отклонение
3,46
4,21
Диапазон
63
65
Пол
> 0.05
Male
130
130
Женский
70
70
хеликобактер пилори
инфекция
0.12
Серонегативных
62
77
серопозитивных
138
123
васкулярной инвазии
Отсутствие
155
-
Присутствия
45
-
лимфоузлов метастаз
Отсутствие
80
-
Присутствия
120
-
печени метастаз
Отсутствие
182
-
Присутствия
18
-
перитонеальный распространение
Отсутствие
172
-
Присутствия
28
-
TNM стадии
-
И.А.
39
-
IB
40
-
II
33
-
III
45
-
IV
43
- <бр> полиморфизмов в промоторной области гена человеческого OPN
Прямое секвенирование фрагментов ДНК между нт -473 и нт -3 больных и возраст и пол контрольной группы показали 3 ОНП в промоторной OPN, расположенных нуклеотида -156 [ ,,,0],GG /GG гомозигот, GG /G- (удаление) гетерозигот, G- /G- гомозиготы], нт -443 [CC гомозиготы, CT гетерозигот, TT гомозигот] и нт -66 (Рисунок 1), как показано в таблице 2 . Там не было никакого существенного различия в распределении этих полиморфизмов (нт -66, -156, -443) между пациентами ГХ и контрольной группы. Распределение генотипов TNM стадий рака желудка показано в таблице 3. На рисунке 1 Схема и секвенирования данные промотора OPN. Представитель показатель для анализа секвенирования на промотор. SNP нт -443 имеет следующие аллели: CC, КТ и TT. Существует небольшая вставка нуклеотида-156, который имеет три аллели: G /G, G /GG, GG /GG. SNP нт -66 имеет только один аллель:. ТТ
Таблица 2 Сравнение OPN промотора между больных раком желудка и здоровой контрольной группы

Controls

Пациенты

<бр> рак желудка

генотипов

п

п

P


LN (+)

LN (-)

P


-66
TT
200
200
1.00
124
76
1.00
-156
G/G
86
67
1.00
41
25
1.00
G/GG
78
92
0.064
57
36
0.92
GG/GG
36
41
0.18
25
16
0.91
-443
CC
22
15
1.00
8
8
1.00
CT
93
94
0.28
63
33
0.23
TT
85
91
0.22
53
35
0.45
Таблица 3 Распределение генотипов для стадий TNM при раке желудка

The TNMS желудочного cancer

Genotypes

IA

IB

II

III

IV

-66
TT
38
44
26
52
40
-156
G/G
16
16
13
20
19
G/GG
16
15
15
16
18
GG/GG
7
9
5
9
6
-443
CC
1
2
1
4
14
CT
17
19
19
19
19
TT
14
18
5
19
29
Тем не менее, в отношении опухолевых узлов метастазы стадии TNM, мы обнаружили, что для SNP нуклеотида -443, у пациентов с генотипом CT, существует значительная разница между пациентами со стадиями II и IV (P &
л; 0,01) , и между стадией IV и всех других стадий (IA + IB + II + III, р = 0,04
; Таблица 4). Кроме того, у пациентов с генотипом CC нуклеотида -443, существует значительная разница между пациентами с этапами IV и стадии I (IA + IB; P = 0,011
), а также между стадией IV и всех других стадий (IA + IB + II + III, P
= 0,012; Таблица 4). Там не было никаких существенных различий между стадиями TNM и двух других полиморфизмов (нт -66 нт и -156) промотора OPN. Мы также не обнаружили никакой связи между ОНП в OPN промотора и лимфатических узлов metastasis.Table 4 Распределение генотипов нт -443 в промоторе OPN желудочной TNM стадии рака

The TNM стадий рака желудка

генотипы

IA + IB

IV

P


II

IV

P


III

IV

P


IA + IB + II + III

IV <бр>
P


-443
TT
32
29
1.00
5
29
1.00
19
29
1.00
56
29
1.00
CT
36
19
0.16
19
19
< 0.01*
19
19
0.33
74
19
0.04*
CC
3
14
0.011*
1
14
0.98
4
14
0.18
8
14
0.012*
* Указывает на существенную разницу (P < 0,05).
Ассоциации между генотипами в области OPN промотора и выживания
Каплана-Мейера различных генотипов нуклеотида -443 в OPN
промотора показаны на рисунке 2 . показатели выживаемости у пациентов с генотипом C /C были значительно ниже, чем показатели выживаемости пациентов с двумя другими генотипами (C /T, T /T). Там не было никаких существенных ассоциаций между выживанием и генотипов на других сайтах (нуклеотиды -156 и -66 нт). Рисунок 2 Каплана-Мейера выживаемость значительно ниже у больных раком желудка с генотипом С /С по сравнению с другими двумя генотипами нуклеотида -443 в OPN промотора.
Влияние полиморфизма -443 T → C на активности промотора
для изучения влияния -443 T → C области промотора полиморфизма на транскрипцию гена OPN
, мы измерили активность промотора с двойным люциферазы Reporter система анализа и сравнили деятельность -443C и -443 T аллели с использованием переходного процесса анализа трансфекции с MKN28 и SGC-7901 клеточных линий. Как показано на рисунке 3, значительно более высокие люциферазные деятельность генерировались с конструкцией pGL3-C по сравнению с pGL3-T конструкции (P
= 0,001 для MKN28; Р = 0,021
для СГК-7901). Рисунок 3 Влияние -443 T → C полиморфизма по активности промотора. Значительно более высокие люциферазные мероприятия были получены с помощью конструкции pGL3-C по сравнению с pGL3-T конструкции (P = 0,001
для MKN28; P = 0,021
для SGC-7901)
Обсуждение
Монтаж. данные свидетельствуют о том, что OPN, играет определенную роль в регуляции метастазировании опухолей и что экспрессия OPN, особенно высока в метастатических опухолей [22]. OPN гиперэкспрессируется в раковых заболеваний, которые имеют высокую склонность к формированию костных метастазов. В костных метастазов, OPN, как правило, ассоциируется с интерфейсом между карциномой и поверхностью кости, и это по-видимому, связана с повышенной резорбцией кости активности остеокластов [23]. Кроме того, высокая экспрессия OPN в первичной опухоли связано с ранним метастазированием и плохим клиническим исходом при раке желудка человека и других видов рака [24-27].
Недавнее исследование показало, что промотор OPN был связан с НМРЛ [19]. В настоящем исследовании мы сосредоточились на объединении этих полиморфизмов с GC, и хотя распределение генотипов в OPN
промотор достоверно не отличалась между пациентами ГХ и здоровой контрольной группы, существуют значительные различия в распределении генотипов ( CC), при нт -443 между пациентами с IV стадией и стадией I рака желудка (IA + IB), и между стадией IV и объединенные другие три стадии рака желудка (IA + IB + II + III, таблица 4). Показатели выживаемости у пациентов с генотипом C /C были значительно ниже, чем показатели выживаемости двух других генотипов (C /T, T /T, рисунок 3). Кроме того, значительно более высокие активности люциферазы генерировались с pGL3-C конструкцией по сравнению с pGL3-T конструкции. Анализ гена репортер показал, что гаплотип -443C /-156 G /-66 Т связано со значительно повышенной активностью промотора по сравнению с пятью другими аллельные варианты испытанных [28]. Недавнее исследование по меланомой метастазов обнаружили, что те, гомозиготные по аллелю -443C выражены значительно более высокие уровни мРНК OPN по сравнению с теми, которые были либо гетерозиготными (КТ) или гомозиготным по -443 аллеля Т [29]. фактор транскрипции с-Myb связывается области промотора OPN в аллель-специфическим образом и вызывает повышенную активность -443C по сравнению с -443 T OPN
промотора [30]. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что изменение нуклеотида -443 в промоторе OPN играет роль в прогрессировании ГХ и метастазирование, особенно для генотипа СС нуклеотида -443 в OPN
промотора. Является ли полиморфизмы ОПН связано с выражением OPN в развитии рака у пациентов остаются неизвестными, хотя. Избыточная экспрессия OPN была обнаружена в образцах рака желудка в предыдущем исследовании [14]. Поэтому необходимы дополнительные исследования для дальнейшего выяснения этот вывод.
В настоящем исследовании мы обнаружили, что генотип CT нуклеотида -443 в промоторе OPN показали значительные различия между стадией IV и рака желудка стадии II, а также между стадией IV и другие стадии рака желудка (IA + IB + II + III), но не между стадией IV и III стадии или стадии I. Основной причиной этого может быть из-за ограниченного числа пациентов в каждой подгруппе. Также возможно, что фактор транскрипции с-Myb могли бы повысить активность области в OPN
промотор, который содержал CC или генотипов CT, но не другой генотип (т.е. ТТ) [29]. Тем не менее, эти гипотезы требуют дальнейшего изучения в более крупных исследованиях.
Настоящие геномные результаты в здоровых не были идентичны предыдущим выводам среди японских и итальянских контрольных субъектов [30, 31]. Хотя предыдущие доклады свидетельствуют о том, что высокая OPN выражается на высоких уровнях в GC [17], мы не обнаружили никакой связи между генотипами OPN
промотора с риском GC. Тем не менее, мы обнаружили, этнические различия в ОНП нескольких генов, принимающих в GC пациентов [30, 31]. Таким образом, нынешние результаты не могут применяться ко всем группам населения. Тем не менее, хотя не было никакой связи между OPN ОНП и GC желудка, предрасположенность к раку или тяжести в китайских пациентов, наши результаты предполагают, что существует связь с метастазами ГК.
Заключение
В заключение, это первое исследование генетических полиморфизмов OPN и риск GC в китайской популяции. Мы показали, что генетический полиморфизм при -443 в промоторе OPN связаны с метастазами и последующей смертью GC. Таким образом, эти результаты могут предложить подход для прогнозирования клинического исхода больных GC. Тем не менее, необходимы дополнительные исследования с использованием большего когорту пациентов, чтобы подтвердить эти выводы.
Notes
Fujun Чжао, Xiaoyi Чен также внесли вклад в эту работу.
Декларациях
Выражение признательности
Эта работа была поддержана естественнонаучных фондов Китая (№ 81072032 и 30770992). Авторы благодарят Medjaden Bioscience Limited за вычитку рукописи.
Авторов оригинальные представленные файлы для изображений изображения Ниже приведены ссылки на авторов оригинала, представленных файлов для изображений. 'Исходный файл для Рисунок 1 12885_2012_3447_MOESM2_ESM.tiff Авторского 12885_2012_3447_MOESM1_ESM.pdf авторов исходного файла для Рисунок 2 12885_2012_3447_MOESM3_ESM.tiff Авторского исходного файла для фигурного 3 Конкурирующие интересы
Авторы заявляют нет конкурирующих интересов.
Авторов вклады <бр> ZF участвовал в разработке дизайна исследования и проводили статистический анализ, CX проведен анализ люциферазы, MT, HB задуманную исследования и particpated в ее разработке и координации, ZZ, З. Г. участвовал в разработке дизайна исследования. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Фактор транскрипции FOXO4 подавляется и подавляет пролиферацию опухоли и метастаз при раке желудка
• Фаза I исследования иматиниба, цисплатин и 5-фторурацил или капецитабин в продвинутом пищевода и аденокарцино…