Genetiske polymorfier i osteopontin promotor øger risikoen for afstanden metastaser og død i kinesiske patienter med gastrisk cancer

Genetiske polymorfier i osteopontin promotor øger risikoen for afstanden metastaser og død i kinesiske patienter med mavekræft
Abstract
Baggrund
In vitro
og in vivo
undersøgelser har antydet, at osteopontin (OPN) er forbundet med mange typer af kræft. Imidlertid har ingen undersøgelser rapporteret forekomsten af ​​OPN-polymorfier og risikoen for mavekræft. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge sammenhængen mellem OPN polymorfier og gastrisk cancer hos en kinesisk patientpopulation.
Metoder Salg Tre genetiske varianter i OPN-promotoren blev genotypebestemt ved anvendelse af direkte sekventering i 200 mavecancerpatienter og 200 køns- og aldersmatchende kræft-fri kontrol. Det 4-års overlevelsen kurve blev beregnet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet under anvendelse af log-rank test for hver enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) site. Vi målte promotoraktiviteten af ​​-443 T → C polymorfi under anvendelse af en dobbelt luciferase reporter assay.
Resultat Hus Til varianten ved nt -443 (CC), der var en signifikant forskel mellem antallet af patienter med stadium IV og dem med stadium i mavekræft (IA + IB; P =
0,014) og mellem dem med stadie IV og alle andre faser af mavekræft (IA + IB + II + III; P =
0,02). For varianten ved nt -443 (CT), var der en signifikant forskel mellem antallet af mavecancerpatienter med stadie IV og dem med trin II (P =
0,013). Overlevelsesprocenten for patienter med C /C genotype var væsentligt lavere end for patienter med de to andre genotyper (C /T, T /T). Desuden blev væsentligt højere luciferaseaktiviteter observeret i pGL3-C-konstruktionen sammenlignet med pGL3-T-konstruktionen.
Konklusioner
Denne undersøgelse giver den første bevis på, at variation ved nt -443 i OPN-promotoren øger muligheden for gastrisk cancer metastaser og efterfølgende død i den kinesiske befolkning.
Nøgleord
Osteopontin mavekræft Polymorphisms genetiske varianter metastase Baggrund
gastrisk adenocarcinom stadig den næststørste årsag til kræftrelaterede dødsfald på verdensplan, der tegner sig for 738.000 dødsfald om året [1] . Mavekræft er den tredje mest almindelige kræftform i Kina. Udviklingen af ​​mavekræft er forbundet overvejende med Helicobacter pylori
infektion [2], men andre risikofaktorer omfatter en kost høj i salt, rygning, indtagelse af syltede fødevarer, og specifikke genetiske baggrunde [3]. Det er blevet vist, at H. pylori
infektion er en uafhængig risikofaktor, der fører til vedvarende kolonisering og kronisk inflammation af mavens slimhinde, hvilket øger risikoen for at udvikle mavesår og gastrisk cancer [2, 4-6]. Men er der markante inter-individuelle forskelle i omfanget af inflammation hos personer med H. pylori
infektion, og kliniske konsekvenser kun udvikle sig i et lille antal gastrisk kræfttilfælde. Multifaktorielle modeller tyder på, at den genetiske modtagelighed grund af særlige variante alleler i polymorfismer kan påvirke resultaterne af miljømæssig eksponering [7].
Osteopontin (OPN) er et secerneret klæbende phosphoglycoprotein der indeholder en funktionel Gly-Arg-Gly-Asp-Ser cellebindende sekvens [8]. OPN
genet er blevet kortlagt til kromosom 4q24-Q25, og det har vist sig, at OPN spiller en vigtig rolle i tumormetastase [9]. OPN er blevet vist at blive udtrykt i tumorceller og i det omkringliggende stroma af talrige humane cancere, såsom colon-, bryst-, lunge-, mave, endometrium, og skjoldbruskkirtlen, hvilket giver en forbindelse med malign invasion [10-13]. Tidligere undersøgelser har vist, at OPN ofte overudtrykkes i human gastrisk cancer [14], og at ekspression af OPN-mRNA var signifikant højere i gastrisk cancer væv sammenlignet med ikke-tumorvæv.
Adskillige polymorfismer er blevet beskrevet for OPN
gen, hvoraf nogle er forbundet med Oligoartikulær (eller pauciartikulær) juvenil idiopatisk arthritis, nephrolithiasis, og kronisk hepatitis C [15-18]. En nylig undersøgelse [19] rapporterede, at patienter med en G /G genotype ved nt -156 i OPN-promotoren blev hyppigere diagnosticeret med fremskreden fase (IIIB-IV) ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) end dem med andre genotyper, mens en anden rapport foreslog, at OPN polymorfi kan være den genetiske faktor for hepatitis B virus clearance og hepatocellulært carcinom forekomst [20].
der er i øjeblikket ingen publicerede undersøgelser, der vurderer forholdet mellem OPN
genetiske polymorfier og risikoen for gastrisk cancerudvikling. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at bestemme, om der findes en sammenhæng mellem OPN polymorfier og risikoen for mavekræft i den kinesiske befolkning.
Metoder
Emner Fra 2005 til 2008 310 ubeslægtede patienter med mavekræft (GC gruppe), blev indskrevet på First Affiliated Hospital i Nanjing Medical University. Alle patienterne var etniske Han kinesiske beboere, der histologisk havde bekræftet gastrisk adenocarcinom. Kontrolgruppen (den ikke-GC gruppe) bestod af en stikprøve af 591 etniske han-kinesere fra Jiangsu-provinsen. Efter at have givet skriftligt informeret samtykke, blev alle deltagere bedt om at give en blodprøve. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for Første Affiliated af Nanjing Medical University (É0-SR-073).
Før sekventering genotyperne i OPN
promotor, vi brugte SPSS v10.0 (SPSS, Inc ., Chicago, IL, USA) software til at tilfældigt vælge 200 GC patienterne og køns- og alderssvarende matche dem til 200 tilfældigt udvalgte kontrol af ikke-GC gruppe. Vi evaluerede alle patienter og kontroller for H. pylori
hjælp af en indirekte fastfase immunokromatografisk (ICM) assay til at undersøge tilstedeværelsen af ​​IgG-antistoffer mod H. pylori
(Genelabs Diagnostics, Singapore). Denne testmetode er tidligere valideret i vores laboratorium med en nøjagtighed på 92,3% [21].
Genomisk DNA fra kontroller og gastriske cancerpatienter blev ekstraheret fra ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) -anticoagulated perifert blod efter den traditionelle proteinase K og phenol chloroformaddukt metode, og opbevaret ved -70 ° C.
Analyse af polymorfier i OPN regulatoriske region
OPN-66, -156 (rs17524488), og -443 (rs11730582) varianter blev genotypebestemt ved direkte sekventering af sense- og antisense-strengene følgende polymerasekædereaktion (PCR) amplifikation af promotoren regulatoriske region -473 til -3 (fremadrettet primer 5 '- CAA GCT ACT GCA TAC TCG AAA TCA CA-3 '; reverse primer 5 '- ACA ACC AAG CCC TCC CAG AAT TTA-3 '), som tidligere beskrevet [19]. PCR blev udført under anvendelse af 50 ng DNA som en template under følgende betingelser: 95 ° C i 10 minutter, derefter 36 cykler ved 94 ° C i 30 s, et annealing temperatur i 60 s og 72 ° C i 60 s, med en endelig ekstension ved 72 ° C i 15 min. Efter membranoprensning affinitet under anvendelse af QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Carlsbad, CA, USA), blev PCR-produkterne underkastes cyklussekventering med den respektive forward og reverse primer anvendelse af en automatiseret ABI 3100 DNA sequencer ved GeneCore Bio Technologies (Shanghai China) .
Luciferase assay med SNP ved nukleotid (nt) -443 i OPN-promotoren Salg The 250 bp fragmenter af OPN-promotoren (fra -590 til -340), der bærer enten T eller C-allel blev syntetiseret ved Invitrogen og indsat opstrøms for ildflue-luciferase-genet i pGL3-Enhancer plasmidvektor (Promega, USA) i separate procedurer. Hver konstruktion blev bekræftet ved sekventering. En serie af OPN-promotor-luciferase-reporterkonstruktioner blev transient transficeret ind i de gastriske cancercellelinier MKN28 (Shanghai Institute of Digestive Disease) og SGC-7901 (Shanghai Cancer Institute), og transfektion blev udført med lipofectamin 2000 Reagent (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens protokol. De MKN28 og SGC-7901 cellelinjer blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum. Aktiviteten af ​​de forskellige genotype promotorer blev målt ved anvendelse af Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA). Alle forsøg blev gentaget tre gange.
Statistisk analyse
Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS 10.0 software. Kvantitative variable afgår fra normalfordelingen, herunder alder, blev opsummeret som middelværdi og standardafvigelse (SD). Sammenligning af alder mellem cases og kontroller blev vurderet ved hjælp af en uafhængig Students t
-test. Sammenligning af ekstra-gastriske tumorer, H. pylori
infektion, og genotypefrekvenser mellem og kontrolpersoner blev vurderet ved anvendelse af en chi-square test og en Fishers eksakte test. Overlevelse blev beregnet af Kaplan-Meier-metoden. Alle sandsynligheden (P
) værdier blev tosidede og statistisk signifikans blev angivet som P
< 0.05.
Resultater
Demografiske og kliniske træk ved patienterne
mavekræft (GC) gruppe bestod af 200 personer (64% mandlige), med en gennemsnitsalder på 56.29 ± 3,46 år. Kontrollen (ikke-GC) gruppe bestod af 200 personer, hvoraf 64% var mænd, med en gennemsnitsalder på 55,67 ± 4,21 år (tabel 1). Der var ingen signifikante forskelle i fordelingen af ​​alder og køn samt H. pylori
seropositivitet. Clinicopathologic karakteristika for de patienter og kontroller er vist i tabel 1.Table 1 Clinicopathologic karakteristika for patienter med mavekræft karcinom og raske kontrolpersoner
Karakteristisk
No. af patienter eller kontroller
P Vejviser Cases (n)
Kontrol (n)
No.
200
200
Alder, år
> 0.05
Mean
56,29
55,67
Standardafvigelse
3,46
4,21
Range
63
65
Køn
> 0.05
Mand
130
130
Female
70
70
Helicobacter pylori
infektion
0,12
Seronegative
62
77
seropositive
138
123
Vaskulær invasion
Fravær
155 -
Tilstedeværelse
45 -
lymfeknudemetastase
Fravær
80 -
Tilstedeværelse
120 -
levermetastaser
Fravær
182 -
Tilstedeværelse
18
-
Peritoneal formidling
Fravær
172 -
Tilstedeværelse
28 -
TNM stadie -
IA
39
-
IB
40 -
II
33 -
III
45 -
IV
43
-
SNP'er i promotorregionen af ​​humant OPN-gen
Direkte sekventering af DNA-fragmenter mellem nt -473 og nt -3 hos patienter og alders- og kønsmatchede kontroller afslørede 3 SNP'er i OPN-promotoren, som ligger ved nt -156 [ ,,,0],GG /GG homozygotes, GG /G- (tekst udgår) heterozygoter G- /G- homozygoter], NT -443 [CC homozygoter, CT heterozygoter, TT homozygoter] og nt -66 (figur 1), som vist i tabel 2 . Der var ingen signifikant forskel i fordelingen af ​​disse SNPs (nt -66, -156, -443) mellem GC patienter og kontroller. Fordelingen af ​​genotyper for TNM stadier i gastrisk cancer, er vist i tabel 3. Figur 1 Skematisk diagram og sekventeringsdata af OPN-promotoren. Repræsentativ værdi for det sekvensanalyse af promotoren. SNP'en nt -443 har følgende alleler: CC, CT, og TT. Der er en lille insertion ved nt-156, som har tre alleler: G /G, G /GG, GG /GG. Den SNP nt -66 har kun én allel:. TT
Tabel 2 Sammenligning af OPN promotor mellem gastrisk kræftpatienter og raske kontrolpersoner
Controls
Patienter

mavekræft
genotyper
n
n
P
LN (+)
LN (-)
P


-66
TT
200
200
1.00
124
76
1.00
-156
G/G
86
67
1.00
41
25
1.00
G/GG
78
92
0.064
57
36
0.92
GG/GG
36
41
0.18
25
16
0.91
-443
CC
22
15
1.00
8
8
1.00
CT
93
94
0.28
63
33
0.23
TT
85
91
0.22
53
35
0.45
Tabel 3 Fordelingen af ​​genotyper for TNM stadier i mavekræft
Den TNMs af gastrisk cancer

Genotypes

IA

IB

II

III

IV

-66
TT
38
44
26
52
40
-156
G/G
16
16
13
20
19
G/GG
16
15
15
16
18
GG/GG
7
9
5
9
6
-443
CC
1
2
1
4
14
CT
17
19
19
19
19
TT
14
18
5
19
29
om tumor-node-metastase TNM etaper, Vi fandt imidlertid, at for SNP ved nt -443, blandt patienter med CT-genotype, var der en signifikant forskel mellem patienter med trin II og IV (P
< 0,01) og mellem trin IV og alle andre faser (IA + IB + II + III; P =
0.04, tabel 4). Ligeledes blandt patienter med CC-genotypen ved nt -443, var der en signifikant forskel mellem patienter med trin IV og trin I (IA + IB; P =
0,011) og mellem trin IV og alle andre faser (IA + IB + II + III; P
= 0,012; tabel 4). Der var ingen signifikante forskelle mellem TNM etaper og de to andre SNPs (nt -66 og nt -156) af OPN promotor. Vi fandt heller ikke nogen sammenhæng mellem SNPs i OPN promotoren og lymfeknude metastasis.Table 4 genotype fordeling af nt -443 i OPN promotor af mavekræft TNM stadie
TNM stadier af mavekræft

genotyper
IA + IB
IV
P
II
IV
P
III
IV
P
IA + IB + II + III
IV

P


-443
TT
32
29
1.00
5
29
1.00
19
29
1.00
56
29
1.00
CT
36
19
0.16
19
19
< 0.01*
19
19
0.33
74
19
0.04*
CC
3
14
0.011*
1
14
0.98
4
14
0.18
8
14
0.012*
* Angiver signifikant forskel (P < 0,05).
Associations mellem genotyper i OPN-promotorregionen og overlevelse
Kaplan-Meier-estimater af forskellige genotyper ved nt -443 i OPN
promotoren er vist i figur 2 . de overlevelsesrater for patienter med C /C genotype var betydeligt lavere end de overlevelsesrater for patienter med de to andre genotyper (C /T, T /T). Der var ingen signifikante sammenhænge mellem overlevelse og genotyper på andre sites (nt -156 og nt -66). Figur 2 Kaplan-Meier overlevelse er betydeligt lavere i mavecancerpatienter med C /C genotype sammenlignet med de to andre genotyper ved nt -443 i OPN-promotoren.
Virkning af -443 T → C polymorfi på promotoraktivitet
For at undersøge virkningen af ​​-443 T → C promotorregion polymorfi på transkription af OPN
genet, målte vi promotoraktivitet med et Dual Luciferase Reporter assay System og sammenlignet aktiviteter -443C og -443 T alleler ved hjælp af en transient transfektion assay med MKN28 og SGC-7901 cellelinjer. Som vist i figur 3, var signifikant højere luciferaseaktiviteter genereret med pGL3-C-konstruktionen sammenlignet med pGL3-T-konstruktion (P
= 0,001 for MKN28; P
= 0,021 for SGC-7901). Figur 3 Virkning af -443 T → C polymorfi på promotoraktivitet. Betydeligt højere luciferaseaktiviteter blev genereret af pGL3-C-konstruktion i sammenligning med pGL3-T-konstruktion (P
= 0,001 for MKN28; P
= 0,021 for SGC-7901)
Diskussion
Montering. tyder på, at OPN spiller en rolle i reguleringen af ​​tumormetastaser og at OPN udtryk er særlig høj i metastatiske tumorer [22]. OPN overudtrykkes i cancere, der har en høj tilbøjelighed til at danne knoglemetastaser. I knoglemetastaser, er OPN generelt forbundet med grænsefladen mellem carcinom og knogleoverfladen, og dette synes at være relateret til øget knogleresorberende aktivitet ved osteoklaster [23]. Desuden er høje OPN ekspression i den primære tumor er forbundet med tidlig metastase og dårlig klinisk resultat i human gastrisk cancer og andre kræftformer [24-27].
En nylig undersøgelse antydede, at OPN-promotoren var forbundet med NSCLC [19]. I nærværende undersøgelse har vi fokuseret på foreningen af ​​disse SNPs med GC, og selv om fordelingen af ​​genotyper i OPN
promotor ikke var signifikant forskellig mellem GC patienter og raske kontrolpersoner, der var signifikante forskelle i fordelingen af ​​genotyper ( CC) ved nt -443 mellem patienter med stadium IV og trin i gastrisk cancer (IA + IB) og mellem trin IV og de kombinerede andre tre stadier af mavecancer (IA + IB + II + III; tabel 4). De overlevelsesrater for patienter med C /C genotype var betydeligt lavere end overlevelsesrater for de to andre genotyper (C /T, T /T; figur 3). Desuden blev væsentligt højere luciferaseaktiviteter genereret med pGL3-C-konstruktionen sammenlignet med pGL3-T-konstruktionen. Reportergen-analyse har vist, at haplotypen -443C /-156 G /-66 T er forbundet med signifikant forøget promotoraktivitet sammenlignet med fem andre testede allelvarianter [28]. En nylig undersøgelse af melanoma-metastaser konstateret, at de homozygote for -443C allel udtrykt signifikant højere niveauer af OPN-mRNA sammenlignet med dem, der var enten heterozygotiske (CT) eller homozygot for T-allelen -443 [29]. Transkriptionsfaktor c-Myb binder til området ved OPN-promotoren i en allel-specifik måde og inducerer forøget aktivitet af -443C forhold til -443 T OPN
promotor [30]. Taget sammen antyder disse data, at variationen ved nt -443 i OPN-promotoren spiller en rolle i GC progression og metastase, især for CC-genotypen ved nt -443 i OPN
promotoren. Hvorvidt polymorfier OPN er relateret til ekspression af OPN i cancer patienter forbliver ukendt, selv om. Over-ekspression af OPN blev fundet i gastrisk cancer prøver i en tidligere undersøgelse [14]. Derfor er yderligere undersøgelser nødvendige for yderligere at belyse dette fund.
I nærværende undersøgelse fandt vi, at CT-genotype ved nt -443 i OPN promotoren viste signifikante forskelle mellem trin IV og trin II mavekræft, og også mellem scenen IV og andre stadier af mavekræft (IA + IB + II + III), men ikke mellem trin IV og stadie III eller fase I. den væsentligste årsag til dette kan skyldes, at det begrænsede antal patienter i hver undergruppe. Det er også muligt, at transkriptionsfaktoren c-Myb kunne have forøget aktivitet området af OPN
promotor, der indeholdt CC eller CT genotyper, men ikke den anden genotype (dvs. TT) [29]. Men disse hypoteser kræver, yderligere undersøgelser i større studier.
Den nuværende genomiske fund i raske kontrolpersoner var ikke identiske med tidligere resultater blandt japanske og italienske kontrolpersoner [30, 31]. Selvom tidligere rapporter viser, at høje OPN udtrykkes i høje niveauer i GC [17], fandt vi ingen sammenhæng mellem genotyperne af OPN
promotoren med risiko for GC. Vi har imidlertid fundet etniske forskelle i SNP'er af flere værtsgener i GC patienter [30, 31]. Derfor kan de nuværende resultater ikke gælder for alle befolkningsgrupper. Ikke desto mindre, selv om der ikke var nogen sammenhæng mellem OPN SNP'er og GC gastrisk kræft modtagelighed eller sværhedsgraden i kinesiske patienter, behøver vores resultater tyder på, at der er en sammenhæng med metastase af GC.
Konklusion
Afslutningsvis er dette den første undersøgelse OPN genetiske polymorfier og risikoen for GC i en kinesisk population. Vi har vist, at genetiske polymorfier ved -443 i OPN-promotoren er forbundet med metastase og efterfølgende død af GC. Derfor vil disse fund tilbyde en tilgang til at forudsige det kliniske resultat af GC patienter. Der er dog behov for yderligere undersøgelser ved hjælp af en større kohorte af patienter med henblik på at bekræfte disse resultater.
Notes
Fujun Zhao, Xiaoyi Chen bidraget ligeligt til dette arbejde.
Erklæringer
Tak
Dette arbejde blev støttet af Natural Science Funds i Kina (nr 81.072.032 og 30.770.992). Forfatterne takker Medjaden Bioscience Limited for korrekturlæsning manuskriptet.
Forfattere 'originale indsendte filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12885_2012_3447_MOESM1_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12885_2012_3447_MOESM2_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12885_2012_3447_MOESM3_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 3 konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Forfattere bidrag
ZF deltaget i udformningen af ​​undersøgelsen og udført statistisk analyse, CX foretaget Luciferase assay MT, HB udtænkt af undersøgelsen, og particpated i sit design og koordinering, ZZ, ZG deltaget i udformningen af ​​undersøgelsen. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Transskriptionsfaktoren FOXO4 er nedreguleret og hæmmer tumor spredning og metastaser i gastrisk kræft
• Fase I studie med imatinib, cisplatin og 5-fluoruracil eller capecitabin i avanceret esophageal og gastrisk adenocarcinom