Somatiska ramskiftningsmutationer i Bloom syndrom BLM gen är vanliga i sporadiska gastric karcinom med mikro mutator phenotype

Somatiska ramskiftningsmutationer i Bloom syndrom BLM
genen är vanliga i sporadiska gastric karcinom med mikro mutatorfenotyp Bild Sammanfattning
Bakgrund
Genomisk instabilitet har rapporterats vid mikro områden i några kodande sekvenser. Vi har visat att Bloom syndrom BLM
genen kan vara ett mål för microsatelliteinstability (MSI) i ett kort poly-adenin upprepning belägen i dess kodande region. För att ytterligare karakterisera medverkan av BLM
i tumörbildning, har vi undersökt mutationer i nio gener som innehåller kodande mikro i mikro mutatorfenotyp (MMP) positiva och negativa mag karcinom (GC).
Metoder
Vi analyserade 50 gastric karcinom (GCS) för mutationer i BLM
poly (A) -området också som i de kodande mikrosatelliter i TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6, BAX, WRN, RECQL
och CBL
gener. Search Results
BLM
mutationer påträffades i 27% av MMP + GC (4/15 fall), men inte i någon av de MMP negativa GC (0/35 fall). Frekvensen av mutationer i den andra åtta kodande regioner mikrosatellit var följande: TGFβ1-RII
(60%), BAX
(27%), hMSH6
(20%), hMSH3
(13 %), CBL
(13%), IGFIIR
(7%), RECQL
(0%) och WRN
(0%). Mutationer i BLM
verkar vara oftare i samband med förskjutningar i BAX Mössor och i hMSH6 Mössor och /eller hMSH3.
Tumörer med BLM
förändringar medför en högre frekvens av instabil mono- och trinukleotid upprepningar belägna i kodande regioner jämfört med mutatorfenotyp tumörer utan BLM
förskjutningar. sälja slutsatser
BLM
förskjutningar är frekventa förändringar i GC särskilt i samband med MMP + tumörer. Vi föreslår att BLM
funktionsförlust av MSI kan öka den genetiska instabilitet en pre-existerande instabil genotyp i mag tumörer.
Bakgrund
Cancer är en progressiv genetisk sjukdom som kännetecknas av progressiv ansamling av mutationer i både kodning och icke-kodande sekvenser [1]. Enkel sekvens upprepar eller mikro är mycket instabila i vissa mänskliga tumörer, identifiera en klass av tumörer med mikro mutatorfenotypen (MMP +) (för översikt se [2]). MMP + ve status definieras av instabilitet i mer än 30% av analised mikro, varav minst en mononukleotid (såsom BAT26 eller BAT25) [3]. Mikro instabilitet (MSI) har beskrivits som en vanlig genetisk förändring i olika humana solida tumörer, inklusive sporadiska och familjära gastriska karcinom (GCS). I nästan alla patienter med hnpcc (HNPCC) har molekylära studier visat att MSI orsakas av nedärvda mutationer i gener som kodar för proteiner som krävs för mismatch repair (MMR) [4]. Gener som hMSH2, hMLH1, PMS1, PMS2 Mössor och hMSH6 /GTBP
[5-8], definierades som "vaktmästare" eftersom när störs, de gynnar förvärvet av mutationer med hög frekvens i flera gener, inklusive onkogener och tumörsuppressorgener [9]. Men i en betydande andel av sporadisk MMP + tumörer, mutationsanalys har inte gjort det möjligt att identifiera de gener som är ansvariga för MSI [2, 10], vilket tyder på att, i sådana fall kan MSI orsakas av epigenetiska mekanismer. I själva verket var geners uttryck av promotor hypermethylation nyligen visat för hMLH1
genen [11-13].
Betydelse MSI i tumörbildning har stötts av demonstrationen att genetisk instabilitet som kännetecknar MMP + gastrointestinal cancer kan rikta kort repetitiva områden inom den kodande regionen av gener som är viktiga för cellöverlevnad och -proliferation. Införing /deletionsmutationer hittades i generna för den transformerande tillväxtfaktor-beta-typ II-receptor (TGFβ1-RII
), insulinliknande tillväxtfaktor typ II-receptor (IGFIIR
), de DNA mismatch-reparationsgener hMSH3 Mössor och hMSH6
den proapoptotiska genen BAX Mössor och transkriptionsfaktorn E2F-4
[14-18]. I samtliga fall, med undantag för E2F-4,
nukleotiderna insättning /radering resulterade i ramskiftningsmutationer och proteintrunkering. Även den biologiska betydelsen av dessa förändringar inte är helt etablerad, föreslogs att frånvaron av TGFβ1-RII receptorer från ytan av gastrointestinala epitelceller skulle kunna eliminera den negativa tillväxten kontroll av TGF-β, vilket leder till okontrollerad celltillväxt [19]. IGFIIR har en roll i tillväxthämning genom att binda och aktivera TGFβ1 receptorkomplexet och genom att mediera internalisering, med efterföljande nedbrytning, av tillväxtfaktorn IGF-II [20, 21]. BAX
främjar apoptos och det rapporterades att BAX
inaktive leder till snabb tumörtillväxt [22]. De humana generna hMSH3
och hMSH6
är homologa med de bakteriella MutS
gen vars produkter binder DNA-felpamingar för att initiera strängspecifik reparation av DNA-replikations fel [23]. Somatiska och nedärvda mutationer i hMSH6
var förknippade med sporadiska MMP + kolorektala karcinom och HNPCC [6].
Vi har funnit tidigare att BLM
genen kan också vara ett mål för MSI [24]. De läsramsförskjutningar, som finns i en kort poly-adenin repeat, förutsades för att generera en trunkerad och icke-funktionellt BLM protein. Homozygota eller sammansatta heterozygota mutationer vid BLM
genen visade sig orsaka att Bloom syndrom (BS; OMIM 210900), en pre-maligna tillstånd som kännetecknas genom kromosomal instabilitet och ökad mutationsfrekvens. BS patienter är predisponerade för ett brett utbud av neoplams diagnostiserade vid tidig ålder. Anmärkningsvärt, bland 100 tumörer som registrerats i BS registret 19 var gastrointestinala (matstrupe, magsäck och kolon) och endast två diagnostiserades efter 40 års ålder [25]. Dessa data tyder på att mutationer i BLM
genen kan främja tumörbildning
att bättre definiera rollen av BLM
i mag-tarmtumörbildning vi skärmad en panel av MMP + och MMP- mag karcinom (GC) för: a.) förskjutningar i BLM
kodande regionen mikro och b) för eventuella associationer med andra intragenic förskjutningar.
Resultat
MSI status Hus till den aktuella studien, vår panel av 50 GC innehåller 15 MMP + tumörer med MSI på två eller flera loci (tabell 2) och 35 GC MMP- med förändring vid en mikrosatellit (4-tumörer) eller utan MSI (31 tumörer). Alla MMP + fallen var BAT 26 positiva, och BAT 25 instabilitet hittades i 13 av 15 fall (utom fall 67R och 27P). De klinisk-patologiska drag av MMP + tumörer beskrivs i Tabell 1. MMP + fenotypen var nära förknippad med en låg pTNM scen och med en mindre förekommande knutpunkter metastaser (p = 0,02 och p = 0,001 vid Fisher exakta test, respektive, jämfört med
MMP-tumörer). Inom MMP + -gruppen, har ett överskott av tumörer i ett tidigt skede och utan lymfkörtel metastas hittade (10/15 fall jämfört med 10/32 fall av MMP- fall, p = 0,02 och 11/15 fall jämfört med 7/32 fall av MMP- fall, p = 0,001 respektive), data som stödjer den föreslagna bättre prognostiska av GC MMP + [33, 34]. Notera var inget överskott av intestinal typ bland MMP + tumörer (12/15 fall vs.
20/32 av MMP- fall) (tabell 1), data i enlighet med nya studier visar ingen signifikant skillnad i frekvensen av MSI i intestinal-typ och diffus typ karcinom [26, 35] .table en Histotype och mellan parametrar associerade med MMP fenotyp i vår GCsa
Variabel

Antal patienter
P värdeB
Totalt (%) Review MMP + (%) Review MMP - (%) katalog Histotype
Intestinal
32 (68,0) Review 12 (37,5) Review 20 (62,5) Review Diffus + Mixed
15 (32,0) Review 3 (20,0) Review 12 (80,0) Review Nsc
T (djup vägg infiltration) Review T1 + T2
12 (25,5) Review 6 (50,0) Review 6 (50,0) Review T3 + T4
35 (74,5 ) Review 9 (25,7) Review 26 (74,3) katalog NS
N (lymfkörtel status) katalog N0
18 (38,3) Review 11 (78,5) Review 7 (21,5) Review N +
29 (61,7) Review 4 (12,1) Review 25 (87,9) katalog = 0,001
M (metastaser) katalog M0
40 (85,1 ) Review 14 (35,0) Review 26 (65,0) Review M +
7 (14,9) Review en (14,2) Review 6 (85,8) katalog NS
Staging
I + II
20 (42,5) Review 10 (58,8) Review 10 (41,2) Review III + IV
27 (57,5) Review 5 (16,6) Review 22 ( 83,4) katalog = 0,02
Totala
47
15
32
a - data fanns tillgängliga för 47 av 50 fall b - på Fisher exakta test c - NS = inte statistiskt signifikant
Tabell 2 Status för kodningsmikro inom BLM, WRN, RECQL, CBL, hMSH6, hMSH3, IGFIIR, TGF-βRII Mössor och BAX
gener i serien av gastric karcinom med mikro mutatorfenotyp.
Case

Histotypea

Stagingb


BLM

WRN

REQL

CBL

hMSH6

hMSH3

IGFIIR

TGF-βRII

BAX

No.



MSIc

(A)9

(A)8

(A)9

(ATG)6

(C)8

(A)8

(G)8

(A)10

(G)8

31R
I
I(T2N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
57R
I
IV(T3N1M1)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
63R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
+
-
-
+
+
67R
I
I(T2N0M0)
4/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
69R
D
II(T3N0M0)
4/5
+
-
-
+
+
+
-
+
+
79R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3P
I
II(T3N0M0)
4/7
+
-
-
-
-
-
-
-
+
11P
I
III(T3N1M0)
3/7
+
-
-
-
-
+
+
+
-
14P
M
II(T3N0M0)
6/7
+
-
-
+
+
-
-
+
+
17P
I
II(T3N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
19P
D
III(T3N1M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
27P
I
IV(T4N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
30P
I
I(T2N0M0)
3/6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
37P
I
I(T2N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
38P
I
III(T3N2M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
%
present studie (antal fall) katalog 27%
0%
0%
13%
20%
13%
7%
60%
27 %
mutationer
(4/15) Review (0/15) Review (0/15) Review (2/15) Review (3/15) Review (2 /15) Review (1/15) Review (9/15) Review (4/15) Review rapporterats i litteraturen (i GC) d -
- Omdömen - -
22-52%
19-64%
19-24%
42-83%
15-64%
a - I = intestinal typ; D = diffus typ; M = blandad typ b - enligt TNM klassificeringen (Sobin och Wittekind, 1997) c - Antalet instabila /totalt testade mikro D - data som sammanställts från referenser: [17,27,42,50,51,52]
BLM läsramsförskjutningar
PCR-amplifiering av BLM
mikrosatellit avslöjade onormala band, som är frånvarande i de normala matchade DNA: n, i 4 av de 15 MMP + tumörer (27%) (Fig. 1). Vi har bekräftat genom sekvensering att de abnorma banden är orsakade av en deletion av en adeninrest i poly-adenin-tarmkanalen (minskning från nio till åtta adeniner), såsom tidigare visats [24]. Mutationsfrekvensen i BLM
kan vara en låg uppskattning, eftersom vi har uteslutit de fall där onormala band i tumör DNA särskilt svagare än de normala, möjligen till följd av en stor förorening av tumör med icke-maligna celler eller en låg parti av maligna celler som uppvisar abnormitet (Fig. 1). Eftersom ingen BLM
mutation sågs i MMP- tumörer ramskiftningsmutationer i BLM
genen verkar vara särskilt förknippade med gastric MMP + tumörer (sannolikhet P < 0,01 vid Fisher exakta test), liknande den tidigare väl dokumenterade förändringar i TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6
och BAX
gener [14, 16, 17, 32]. Därför våra data utöka repertoaren av förändrade gener associerade med MMP + gastric karcinom. Figur 1 Representativa exempel på mutationer som upptäckts i mikrosatelliter vid gen kodande regioner. Antalet fall visas ovanför varje matchande normal (N) och tumör (T) DNA-par. Pilar indikerar de onormala band. Observera att vi inte har övervägt muterade prover där onormala band var mycket svag (som i BLM Mössor och BAX
gener av tumörprov 30P). På grund av tendensen hos Taq-polymeras för att lägga till en extra nukleotid i slutet av de syntetiserade DNA-fragmenten, PCR-produkter visas ibland som dubbelband. Med undantag för BAX
läsramsförskjutning i tumör 69R visas ingen annan mutation att vara homozygot. Men genom att veta förhållandet mellan maligna celler i tumörprov, vi har tidigare indikerat att BLM
mutation i tumör 69R är också homozygot [24].
Förskjutningar i andra CDR mikro och relationer med BLM förskjutningar
samma panel av MMP + tumörer analyserades också med avseende på närvaro av förskjutningar i mikrosatelliter belägna i de kodande regionerna av åtta andra gener (tabell 2). Vi har funnit variation i sekvenslängd i TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6 Mössor och BAX
gener, alla tidigare rapporterats ändras i MMP + GC. Uppgifter om TGFβ1-RII
status för åtta (P-serien i tabell 2) av de femton tumörer tidigare rapporterats [27]. De observerade mutationsfrekvenser var jämförbara med dem som tidigare rapporterats för alla dessa gener, med undantag för IGFIIR
som vi funnit en låg andel av förskjutningar (tabell 2). Intressant i jämförelse med BLM
mutationer, endast TGFβ1-RII
förskjutningar var mer frekventa (60% mot 27%, respektive) och BAX
förskjutningar var liksom frekvent (27%). Dessa data tyder på att förskjutningar i BLM
är vanliga förändringar i MMP + GC. En trend mot en associering mellan mutationer i BLM
och mutationer i BAX
och hMSH3
och /eller hMSH6
observerades (tabell 2) (P = 0,05 vid Fishers exakthetstest).
Vi har också analyserat RecQL, WRN Mössor och CBL
gener, som innehåller korta upprepningar i deras kodande regioner. De första två generna är medlemmar av samma helikas-genfamiljen som BLM
[36, 37]. Medan RecQL
inte är associerad med någon mänsklig sjukdom, mutationer i WRN
genen är orsaken till Werner syndrom (WS; OMIM 277700), en sällsynt autosomal recessiv sjukdom kliniskt kännetecknas av för tidigt åldrande och den ökade risken för en mängd av neoplasmer, och genetiskt kännetecknas av genomisk instabilitet. CBL
är en tyrosinkinasreceptor [38], vars avreglering var associerad med onkogenes [39]. Vi har funnit mutationer endast i CBL
genen (Fig. 1). Två prover (69R och 14P) befanns bära en insättning 3 bp trinukleotiden (ATG) 6 upprepning av CBL
genen (data ej visade). Som vi tidigare har rapporterat [24], eftersom ingen läsramsförskjutning produceras ingen funktionell konsekvens kan utläsas. Båda mutationer hittades i cancrar som uppvisar också BLM
läsramsförskjutningar (tabell 2). Det är anmärkningsvärt att denna undergrupp av tumörer visar en statistiskt signifikant överskott av MSI i kodande regioner jämfört med MMP + delmängd utan BLM
ändringar. (P < 0,001 vid Χ 2 test) (tabell 2)
Diskussion
Flera studier har dokumenterat att alternativa vägar kan finnas i mag-tarm MMP + och MMP- cancer som kännetecknas av olika uppsättningar av förändrade gener [40]. En gradvis modell av Mutator mutationer ( "muteringssekvensen som muterar den andra mutator") föreslogs att definiera mutator kontra suppressor vägar i gastrointestinala tumörer [41]. Genom att analysera tidpunkten för mutationshändelser i genetiskt instabila GC, föreslogs att de första målen för felpamingsreparation brist är mononukleotid områden av TGFβ1-RII Mössor och BAX. Sälja The ramskiftningsmutationer av hMSH3 Mössor och hMSH6
verkar vara sekundära mismatch reparations lesioner, som genererar mutationer i IGFIIR
[42]. Upptäckten att ramskiftningsmutationer på TGFβ1-RII
är den vanligaste och IGFIIR
är mindre frekventa i mag MMP + tumörer stöder den modell där tidiga händelser bör vara närvarande i de flesta tumörer och sena mutationer endast i en mindre del [43]. Detta konstaterande bekräftas också i vår studie (tabell 2). BLM
ramskiftningsmutationer förknippas oftare med första och andra steg förändringar som föreslås i denna modell, vilket tyder på att de är underordnade felpamingsreparation defekter (i hMSH3 Mössor och /eller hMSH6
) närvarande i celler som inte gör det genomgå apoptos (möjligen till följd av BAX
inaktivering). Anmärkningsvärd, i fall 3P, förutom BLM,
de enda läsramsförskjutningar hittades i BAX (se
figur 1) och p53
(data ej visade) gener, vilket antyder att, i vissa fall, BLM
förändring kan ske utan hMSH3 Mössor och /eller hMSH6
mutationer i celler med onormal p53-medierad väg av apoptotisk respons på DNA mismatch.
medverkan BLM
i tumörbildning utanför BS patienter verkar tänkbart, eftersom denna gen tycks verka som en vaktmästare. BLM
mutationer är kända för att orsaka en ökad genomisk instabilitet som kännetecknas av ett ökat antal kromosom raster, luckor och omflyttningar och ett alltför stort antal mutationer i både kodande och icke-kodande regionerna, troligen härrör från olika syster kromatidutbyte, utmärkande drag av Bloom syndrom [44, 45]. Följaktligen, BS uppvisar en kombination av genomisk instabilitet och förhöjd cancerrisk, en förening som också finns i andra sjukdomar orsakade av defekter i vaktmästare gener (såsom HNPCC, WS, ataxi-telangiektasi och xeroderma pigmentosum). Liknar de mutationer som finns i BS, de läsramsförskjutningar som beskrivs i GC avskaffa helikas funktion av BLM protein [24]. BLM protein har en bevisad DNA avveckling aktivitet [46] och skulle kunna vara involverade i processer som störs i maligna celler, såsom DNA-replikation, rekombination, kromosomsegregation, DNA-reparation och transkription. Faktum är att den fissionsjäst BLM genen
homolog (radl2
+ /rqhl
+) visades att reglera S-fas checkpoint och föreslogs för att koppla kromosomal integritet med cellcykelprogression [47, 48]. Men upptäckten av BLM
mutationer i MMP + tumörer genererar en paradox: BLM
mutationer förväntas generera kromosomala instabilitet medan de flesta av MMP + tumörer är diploida. Ändå vissa MMP + tumörer är aneuploid och BLM
förlust-of-funktion mutationer kan ha pleiotropa konsekvenser, möjligen påverkar också mikroinstabilitet vägen, som föreslagits av beskrivningen av en ökad intra-genmutationer i Bloom syndrom [44, 45 ]. I suppoprt till vårt förslag är konstaterandet att vi har funnit att BLM
är muterad i LoVo cellinje en tjocktarmscancer cellinje med både mikro och kromosomala inatability [43]. Mycket mer, det var nyligen rapporterade att SGS1
genen, Saccharomyces cerevisiae
homolog av BLM Mössor och WRN
trycker genomet instabilitet och homeologous rekombination och är överflödigt med mismatch repair (MMR) för att undertrycka brutto kromosomala omflyttningar och för att undertrycka rekombination mellan olika DNA-sekvenser [49].
slutsatser
Våra resultat tyder på att BLM
förskjutningar är frekventa förändringar i GC och särskilt i samband med MMP + tumörer uppvisar åtminstone 2 instabila mikro. Mutationer i BLM
verkar vara ofta förknippade med förskjutningar i och i hMSH6 Mössor och /eller hMSH3, Mössor och tumörer med BLM
förändringar BAX
presenterar ett antal instabila mono- och trinukleotid upprepningar ligger i kodande regioner betydligt högre än vad som observerats i MMP + tumörer utan BLM
förskjutningar. Vi föreslår att BLM
funktionsförlust av MSI i mag tumörer är en mellanmutations händelse, vilket kan öka instabiliteten av en pre-existerande instabil genotyp.
Metoder
tumörprover sälja Femtio primära gastriska tumörer och deras normala parade vävnader (blod eller normal magslemhinnan) valdes på grundval av tillgängliga DNA från en panel av 80 gastriska tumörer (27, Calin G och Negrini M opublicerade data). När det är möjligt, områden av tumörvävnad med minimala inflammatoriska celler eller minimal stroma, eller båda, valdes ut för att erhålla en neoplastisk cell belastning som är större än 50%. Samtliga fall identifierades histopatologiskt som adenokarcinom. Histotype (enligt Laurens klassificering) [28] och iscensättning (enligt TNM klassificering) [29] var känd för 47 av 50 fall (94%) (tabell 1). Trettiotvå fall var av intestinal histotype och 15 fall av diffusa eller blandad typ. Tjugo tumörer iscensatt I eller II, medan 27 var i stadium III eller IV. När det gäller lymfkörtel status, var arton fall NO och 29 var N-positiva. Ingen av patienterna hade utvecklat en cancer vid en tidig ålder, och ingen hade en familjehistoria som tyder på genetisk predisposition för cancer. Högmolekylära DNA: n isolerades med användning av etablerade förfaranden [30] Utvärdering av MSI
MSI
avslöjades med två uppsättningar av anonyma markörer vid loci:. (I) D11S1778, D11S1328, D11S922
och D11S1318
[24] eller (ii) D2S177, D3S1076, D5S433, D11S904, D17S796
och D18S59
[27]. Primrarna för dessa dinukleotid mikro loci erhölls från information som finns tillgänglig via genomdatabasen. PCR-amplifieringar utfördes såsom tidigare beskrivits [24, 27]. För alla prover BAT25 Köpa och BAT26
mikroanalyserades genom PCR-amplifiering som beskrivits [31]. MSI bedömdes om en rörlighetsskiftning av PCR-produkter från tumör-DNA jämfört med den normala motsvarighet identifierades. Endast tumörer med åtminstone två MSI (> 30% av testade mikro). Ansågs MMP +
Förstärkning av mikro i BLM och i andra kodande regioner (CDR)
(A) 9 mikro belägen vid position 1610- 1618 av BLM
cDNA-sekvensen analyserades för alla parade prover. I korthet framställdes mikrosatelliten amplifierades genom PCR med användning av 50 ng templat-DNA, 1 | iM av varje primer, 1,5 mM av MgC12, 50 pM vardera av dATP, dGTP och dTTP och 5,0 pM för dCTP, 0,1 enhet Taq-DNA-polymeras och 1 pCi [α33P] dCTP i 10 pl reaktionsvolym. PCR-reaktioner utfördes under en cykel av 94 ° C under 5 min följt av 35 cykler vid 94 ° C under 30 s, 60 ° C under 30 s och 72 ° C under 30 s. PCR-produkter från tumören och motsvarande kontroll DNA laddades på parallellt på 6% akrylamid sekvenseringsgeler och exponerades för visualisering genom autoradiografi på Kodak X-AR-filmer. Detektion av mutationer i mikro belägna i CDR från åtta andra gener ((a) 10 i TGFβ1-RII,
(G) 8 i IGFIIR
(G) 8 i BAX,
(A) 8 i hMSH3,
(C) 8 i hMSH6
(A) 9 i RecQL
(A) 8 i WRN
och (ATG) 6 i CBL
) utfördes såsom tidigare beskrivits [14, 16, 17, 24, 32]. För kontroll, var varje PCR upprepades minst två gånger. En muterad allel representerades av ett band förskjutning av 1 till 3 bp från den normala bandet med intensitet jämförbar med eller större än den för vildtyp-bandet (Fig. 1).
Sekvensering av onormala produkter
iska DNA-fragment uppvisar bandskiften återamplifierades under samma betingelser med undantag för utelämnandet av märkt dCTP. Före sekvensering, PCR-produkterna renades antingen direkt eller efter separation i en 2% agarosgel, med användning av Qiagen-reningssatser. Båda DNA-strängarna sekvenserades med hjälp av PCR-primers och en automatiserad Applied Biosystems 377 sekvense station. Nukleotidsekvenser analyserades med hjälp av Wisconsin (GCG) programpaketet version Unix-8,1.
Statistisk analys
Den statistiska analysen av resultaten utfördes med användning av Χ 2 test eller Fishers exakta test. AP
värde. ≪ 0,05 ansågs statistiskt signifikant
förklaringar
Bekräftelse
Detta arbete har finansierats med bidrag från Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) och dels från EG Biomed kontrakt BMH4-CT95-0914. GC stöddes av en IARC Forskarutbildning Fellowship.
Författarnas ursprungliga inlämnade handlingarna Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 12863_2001_18_MOESM1_ESM.png Författaroriginalfilen för figur 1

• Buken migrän hos barn: association mellan gastrisk motilitet parametrar och kliniska egenskaper
• Anti-ulcerogena aktiviteten av roten bark extrakt av den afrikanska laburnum "Cassia Sieberiana" och dess effekt på antioxidant försvarssystem hos råttor