Somatiske læserammeforskydningsmutationer i Bloom syndrom BLM-genet er hyppige i sporadiske gastriske carcinomer med mikrosatellit mutator fænotype

Somatiske læserammeforskydningsmutationer i Bloom syndrom BLM
gen er hyppige i sporadiske gastriske carcinomer med mikrosatellit mutator fænotype
Abstract
Baggrund
Genomisk ustabilitet er blevet rapporteret ved mikrosatellitmarkørerne skrifter i få sekvenser. Vi har vist, at Bloom syndrom BLM
gen kan være et mål for microsatelliteinstability (MSI) i en kort poly-adenin repeat placeret i dets kodende region. Til yderligere karakterisering af inddragelse af BLM
i tumorigenese, har vi undersøgt mutationer i ni gener indeholdende kodende mikrosatellitter i mikrosatellit mutatorfænotype (MMP) positive og negative gastriske carcinomer (GC'er). Salg Metoder
Vi analyserede 50 gastrisk carcinomer (GCS) for mutationer i BLM
poly (A) kanal national som i de kodende mikrosatellitter i TGFp1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6, BAX, WRN, RECQL
og CBL
gener.
Resultater
BLM
mutationer blev fundet i 27% af MMP + GCS (4/15 tilfælde), men ikke i nogen af ​​de MMP negative GCS (0/35 tilfælde). Hyppigheden af ​​mutationer i de andre otte kodende regioner mikrosatellit var følgende: TGFp1-RII Hotel (60%), BAX Hotel (27%), hMSH6 Hotel (20%), hMSH3 Hotel (13 %), CBL Hotel (13%), IGFIIR Hotel (7%), RECQL
(0%) og WRN
(0%). Mutationer i BLM
synes at være mere ofte forbundet med rammeskift i BAX
i hMSH6
og /eller hMSH3.
Tumorer med BLM
ændringer udgør en højere frekvens af ustabile mono- og trinukleotid gentagelser beliggende i kodende regioner i forhold til mutator fænotype tumorer uden BLM
rammeforskydninger.
konklusioner
BLM
rammeforskydninger er hyppige ændringer i GC'ers specifikt forbundet med MMP + tumorer. Vi foreslår, at BLM
tab af funktion af MSI kan øge genetisk ustabilitet af en præ-eksisterende ustabil genotype i gastriske tumorer.
Baggrund
Cancer er en progressiv genetisk sygdom karakteriseret ved progressiv akkumulering af mutationer i både kodende og ikke-kodende sekvenser [1]. Simple sekvens gentager eller mikrosatellitter er meget ustabil i nogle menneskelige neoplasmer, identificere en klasse af tumorer med mikrosatellit mutator fænotype (MMP +) (for gennemgang se [2]). MMP + ve status defineres af ustabilitet i mere end 30% af analised mikrosatellitter, herunder mindst en mononukleotid (såsom BAT26 eller BAT25) [3]. Mikrosatelitter ustabilitet (MSI) er blevet beskrevet som en hyppig genetisk ændring i forskellige humane faste tumorer, herunder sporadiske og familiære gastriske carcinomer (GCS). I næsten alle patienter med HNPCC (HNPCC), har molekylære undersøgelser vist, at MSI er forårsaget af germlinie mutationer i gener, der koder for proteiner, der kræves til DNA mismatch repair (MMR) [4]. Gener som hMSH2, hMLH1, PMS1-, PMS2
og hMSH6 /GTBP
[5-8], blev defineret som "viceværter", fordi, når forstyrret, de favoriserer køb af mutationer ved høj frekvens i adskillige gener, herunder onkogener og tumorsuppressorgener [9]. Men i en betydelig del af sporadisk MMP + tumorer, mutation analyse har ikke tilladt at identificere de gener, der er ansvarlige for MSI [2, 10], hvilket tyder på, at der i sådanne tilfælde kan MSI skyldes epigenetiske mekanismer. Faktisk blev gen-silencing ved promotor hypermethylering nylig vist for hMLH1
genet [11-13].
Betydningen af ​​MSI i tumorigenese er blevet understøttet af påvisningen af, at den genetiske ustabilitet karakteriserer MMP + gastrointestinale kræftformer kan målrette kort repetitive skrifter i den kodende region af gener er vigtige for cellens overlevelse og proliferation. Insertion /deletionsmutationer blev fundet i generne for den transformerende vækstfaktor-beta receptor type II (TGFp1-RII
), insulin-lignende vækstfaktor type II receptor (IGFIIR
), DNA mismatch-reparation gener hMSH3
og hMSH6,
proapoptotiske gen BAX
transkriptionsfaktoren E2F-4
[14-18]. I alle de tilfælde, med undtagelse af E2F-4,
nukleotiderne indsættelses /deletion resulterede i læserammeforskydningsmutationer og proteinafkortning. Selv om den biologiske betydning af disse forandringer ikke er fuldt etableret, blev det foreslået, at fraværet af TGFp1-RII-receptorer fra overfladen af ​​gastrointestinale epitelceller kunne eliminere den negative vækstkontrol af TGF-β, hvilket fører til ukontrolleret cellevækst [19]. IGFIIR har en rolle i væksthæmning ved binding og aktivering af TGFp1 receptorkomplekset og ved mediering internalisering, med efterfølgende nedbrydning, af vækstfaktoren IGF-II [20, 21]. BAX
fremmer apoptose og det blev rapporteret, at BAX
inaktivering fører til hurtig vækst tumor [22]. De menneskelige gener hMSH3
og hMSH6
er homologe med de bakterielle MutS
gen, hvis produkter binder DNA mismatch at initiere streng-specifikke reparation af DNA-replikation fejl [23]. Somatiske og germline mutationer i hMSH6
var forbundet med sporadiske MMP + kolorektale karcinomer og HNPCC [6].
Vi har fundet tidligere, at BLM
genet også kan være et mål for MSI [24]. De rammeforskydninger, der findes i en kort poly-adenin gentagelse, blev forudsagt at frembringe en trunkeret og ikke-funktionelt BLM protein. Homozygote eller sammensatte heterozygote mutationer ved BLM
genet viste sig at forårsage Bloom syndrom (BS; OMIM 210.900), en præ-malign tilstand karakteriseret ved kromosomal ustabilitet og øget mutations rate. BS patienter er disponeret for en bred vifte af neoplams diagnosticeret ved tidlig alder. Bemærkelsesværdige blandt 100 neoplasmer registreret i BS registreringsdatabasen, 19 var gastrointestinale (spiserør, mavesæk og tyktarm), og kun to blev diagnosticeret efter det fyldte 40 [25]. Disse data indikerer, at mutationer i BLM
gen kan fremme tumorigenese
For bedre definere den rolle, BLM
i mave tumorigenese vi screenede et panel af MMP + og MMP- gastriske carcinomer (GC'er) for: a.) rammeskift i BLM
kodende region mikrosatellit og b) for mulige associationer med andre intrageniske rammeforskydninger.
Resultater
MSI status
for nærværende undersøgelse, vores panel af 50 GCS indeholder 15 MMP + tumorer med MSI på to eller flere loci (tabel 2) og 35 GC'er MMP- med ændring på én mikrosatellit (4 tumorer) eller uden MSI (31 tumorer). Alle MMP + sager BAT 26 positive, og BAT 25 ustabilitet blev fundet i 13 ud af 15 tilfælde (undtagen sager 67R og 27P). De klinisk-patologiske træk ved MMP + tumorer er beskrevet i tabel 1. MMP + fænotypen var tæt forbundet med en lav pTNM fase og med en mindre udbredt nodal metastaser (p = 0,02 og p = 0,001 ved Fisher exact test, henholdsvis vs.
MMP-tumorer). Inden for MMP + gruppen, blev et overskud af tumorer i tidlige stadier og uden lymfeknude metastaser fundet (10/15 sager vs 10/32 tilfælde af MMP- sager, p = 0,02 og 11/15 sager vs. 7/32 tilfælde af MMP- tilfælde, p = 0,001, henholdsvis), data, der understøtter den foreslåede bedre prognostiske af GC'ers MMP + [33, 34]. Notatet blev der ikke overskud af intestinal type, blandt MMP + tumorer fundet (12/15 sager vs.
20/32 af MMP- tilfælde) (tabel 1), data i overensstemmelse med de seneste undersøgelser, der viser ingen signifikant forskel i hyppigheden af MSI i tarm-typen og diffus-type karcinomer [26, 35] .table en Histotype og mellemstationer parametre forbundet med MMP fænotype i vores GCsa
Variabel

Antal patienter
P værdiB
alt (%)
MMP + (%)
MMP - (%)
Histotype
Intestinal
32 (68,0)
12 (37,5)
20 (62,5)
Diffuse + Blandet
15 (32,0)
3 (20,0)
12 (80,0)
NSC
T (dybde væg infiltration)
T1 + T2
12 (25,5)
6 (50,0)
6 (50,0)
T3 + T4
35 (74,5 )
9 (25,7)
26 (74,3)
NS
N (lymfeknude status)
n0
18 (38,3)
11 (78,5)
7 (21,5)
N +
29 (61,7)
4 (12.1)
25 (87,9)
= 0,001
M (metastaser)
M0
40 (85,1 )
14 (35,0)
26 (65,0)
M +
7 (14,9)
1 (14,2)
6 (85,8)
NS
Iscenesættelse
I + II
20 (42,5)
10 (58,8)
10 (41,2)
III + IV
27 (57,5)
5 (16,6)
22 ( 83,4)
= 0.02
Totala
47
15
32
a - data var tilgængelige for 47 ud af 50 tilfælde b - ved Fisher eksakt test c - NS = ikke statistisk signifikant
tabel 2 status for de kodende mikrosatellitter inden BLM, WRN, RECQL, CBL, hMSH6, hMSH3, IGFIIR, TGF-βRII
og BAX
gener i serien af ​​gastrisk karcinom med mikrosatellit mutator fænotype.
Case

Histotypea

Stagingb


BLM

WRN

REQL

CBL

hMSH6

hMSH3

IGFIIR

TGF-βRII

BAX

No.



MSIc

(A)9

(A)8

(A)9

(ATG)6

(C)8

(A)8

(G)8

(A)10

(G)8

31R
I
I(T2N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
57R
I
IV(T3N1M1)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
63R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
+
-
-
+
+
67R
I
I(T2N0M0)
4/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
69R
D
II(T3N0M0)
4/5
+
-
-
+
+
+
-
+
+
79R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3P
I
II(T3N0M0)
4/7
+
-
-
-
-
-
-
-
+
11P
I
III(T3N1M0)
3/7
+
-
-
-
-
+
+
+
-
14P
M
II(T3N0M0)
6/7
+
-
-
+
+
-
-
+
+
17P
I
II(T3N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
19P
D
III(T3N1M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
27P
I
IV(T4N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
30P
I
I(T2N0M0)
3/6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
37P
I
I(T2N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
38P
I
III(T3N2M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
%
present undersøgelse (antal tilfælde)
27%
0%
0%
13%
20%
13%
7%
60%
27 %
mutationer
(4/15) Hotel (0/15) Hotel (0/15) Hotel (2/15) Hotel (3/15) Hotel (2 /15) Hotel (1/15) Hotel (9/15) Hotel (4/15)
rapporteret i litteraturen (i GC'er) d -
-
- -
22-52%
19-64%
19-24%
42-83%
15-64%
en - I = intestinal type D = diffus type M = blandet type b - i henhold til TNM klassifikation (Sobin og Wittekind, 1997) c - antal ustabile /testet samlede mikrosatellitter d - data indsamlet fra referencerne: [17,27,42,50,51,52]
BLM rammeskift
PCR-amplifikation af BLM
mikrosatellit afslørede unormale bands, fraværende hos de normale matchede DNA'er, i 4 af de 15 MMP + tumorer (27%) (fig. 1). Vi har bekræftet ved sekventering, at de unormale bands er forårsaget af en deletion af én adenin-rest i poly-adenin-tarmkanalen (reduktion fra ni til otte adeniner), som vist tidligere [24]. Mutationen frekvens i BLM
kan være et lavt skøn, fordi vi har udelukket sager, hvor unormale bands i tumor DNA var især svagere end de normale, muligvis som følge af en stor forurening af tumor med ikke-maligne celler eller af en lav portion af maligne celler, som viser den abnormitet (fig. 1). Da ingen BLM
mutation blev set i MMP- tumorer, rammeskift mutationer i BLM
genet synes at være specifikt forbundet med gastriske MMP + tumorer (sandsynlighed P < 0,01 ved Fisher exact test), svarer til den foregående vel- dokumenterede ændringer i TGFp1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6
og BAX
gener [14, 16, 17, 32]. Derfor er vores data udvide det repertoire af ændrede gener associeret med MMP + gastriske carcinomer. Figur 1 Repræsentative eksempler på mutationer detekteret i mikrosatellitter ved gen-kodende regioner. Case numre er vist over hver matchende normal (N) og tumor (T) DNA par. Pile angiver de unormale bands. Bemærk, at vi ikke har overvejet muterede prøver, hvor unormale bands var meget svag (ligesom i BLM
og BAX
gener af tumor prøve 30P). På grund af tendensen hos Taq polymerase at tilføje en ekstra nukleotid i slutningen af ​​de syntetiserede DNA-fragmenter, PCR produkter synes undertiden som dobbelt bånd. Med undtagelse af BAX
læserammeforskydning i tumor 69r, vises ingen anden mutation til at være homozygot. Men ved at kende forholdet mellem maligne celler i tumor prøve, har vi tidligere indikeret, at BLM
mutation i tumor 69r er også homozygot [24].
Rammeskift i andre CDR'er mikrosatellitter og forbindelser med BLM rammeforskydninger
det samme panel af MMP + tumorer blev også analyseret for tilstedeværelse af rammeskift i mikrosatellitter placeret i de kodende regioner af otte andre gener (tabel 2). Vi har fundet variation i sekvens længde i TGFp1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6
og BAX
gener, alle tidligere rapporteret skal ændres i MMP + GCS. Data om TGFp1-RII
status for otte (P serien i tabel 2) af de femten tumorer blev tidligere rapporteret [27]. De observerede mutation frekvenser var sammenlignelige med dem, der tidligere er rapporteret for alle disse gener, med undtagelse af IGFIIR,
som vi fandt en lav procentdel af rammeforskydninger (tabel 2). Interessant, i sammenligning med BLM
mutationer, kun TGFp1-RII
rammeforskydninger var hyppigere (60% vs. 27%, henholdsvis) og BAX
rammeforskydninger var samt hyppige (27%). Disse data antyder, at rammeskift i BLM
er almindelige ændringer i MMP + GC'er. En tendens i retning af en sammenhæng mellem mutationer i BLM
og mutationer i BAX
og hMSH3
og /eller hMSH6
blev observeret (Tabel 2) (P = 0,05 ved Fisher eksakt test).
Vi har også analyseret RecQL, WRN
og CBL
gener, som indeholder korte gentagelser i deres kodende regioner. De første to gener er medlemmer af samme helicase genfamilie som BLM
[36, 37]. Mens RecQL
ikke er forbundet med nogen human sygdom, mutationer i WRN
genet er årsag til Werner syndrom (WS; OMIM 277.700), en sjælden autosomal recessiv sygdom klinisk karakteriseret ved tidlig aldring og øget risiko for en række af neoplasmer, og genetisk karakteriseret ved genomisk ustabilitet. CBL
er en tyrosinkinasereceptor [38], hvis deregulering var forbundet med onkogenese [39]. Vi har fundet mutationer kun i CBL
genet (fig. 1). To prøver (69r og 14P) blev fundet at bære en 3 bp insertion i trinukleotid (ATG) 6 gentagelse af CBL
genet (data ikke vist). Som vi tidligere har rapporteret [24], da ingen læserammeforskydning produceres, ingen funktionel konsekvens kan udledes. Begge mutationer blev fundet i kræft viser også BLM
rammeforskydninger (tabel 2). Det er bemærkelsesværdigt, at denne undergruppe af tumorer viser en statistisk signifikant overskud af MSI i kodende regioner sammenlignet med MMP + undergruppen uden BLM
ændringer. (P < 0,001, ved Χ 2 test) (Tabel 2)
diskussion
Flere undersøgelser har dokumenteret, at alternative veje kan eksistere i mave-MMP + og MMP- kræftformer er karakteriseret ved forskellige sæt af ændrede gener [40]. En gradvis model af mutator mutationer ( "Den mutator der muterer den anden mutator") blev foreslået at definere mutator versus suppressor veje i gastrointestinale tumorer [41]. Ved at analysere timingen af ​​mutationshændelser i genetisk ustabil GC'er, blev det foreslået, at de første mål for fejlparringsreparationsmangel er mononukleotidbyggeblokken skrifter af TGFp1-RII
og BAX.
Den læserammeforskydningsmutationer af hMSH3
og hMSH6
synes at være sekundære mismatch reparation læsioner, som genererer mutationer i IGFIIR
[42]. Konstateringen af, at rammeskift mutationer ved TGFp1-RII
er den hyppigste og IGFIIR
er mindre hyppige i gastriske MMP + tumorer understøtter den model, hvor tidlige hændelser bør være til stede i de fleste tumorer og sene mutationer kun i en mindre fraktion [43]. Dette resultat bekræftes også i vores undersøgelse (tabel 2). BLM
rammeskift mutationer er associeret hyppigere med første og andet trin ændringer, der foreslås i denne model, hvilket antyder, at de er sekundære til fejlparringsreparation defekter (i hMSH3
og /eller hMSH6
) til stede i celler, der ikke undergå apoptose (muligvis som følge af BAX
inaktivering). Bemærkelsesværdigt, i tilfælde 3P, udover BLM,
de eneste rammeforskydninger blev fundet i BAX (se
figur 1) og p53
(data ikke vist) gener, hvilket tyder på, at i nogle tilfælde, BLM
ændring kan forekomme uden hMSH3
og /eller hMSH6
mutationer i celler med unormal p53-medieret vej af apoptotisk respons på DNA mismatch.
inddragelsen af ​​BLM
i tumorigenese udenfor BS patienter synes tænkeligt, eftersom dette gen ser ud til at fungere som en vicevært. BLM
mutationer er kendt for at forårsage en øget genomisk ustabilitet karakteriseret ved en forhøjet antal kromosomale pauser, mangler og omrokeringer og med et stort antal mutationer i både kodning og ikke-kodende regioner, sandsynligvis stammer fra ulige søster-kromatid udveksling, karakteristisk træk af Bloom syndrom [44, 45]. Derfor BS udviser en kombination af genomisk ustabilitet og forhøjet kræftrisiko, en forening også fundet i andre sygdomme forårsaget af defekter i vicevært gener (såsom HNPCC, WS, ataksi-telangiectasia og xeroderma pigmentosum). Svarende til mutationerne fundet i BS, der er beskrevet i GC'ers rammeskift afskaffe helicase funktion af BLM protein [24]. BLM protein har en dokumenteret DNA unwinding aktivitet [46] og kunne være involveret i processer, der forstyrres i maligne celler, såsom DNA-replikation, rekombination, kromosomsegregering, DNA-reparation og transkription. Faktisk fission gær BLM genet
homolog (radl2
+ /rqhl
+) blev vist at regulere S-fasen checkpoint og blev foreslået at koble kromosomal integritet med cellecyklusprogression [47, 48]. Men konstateringen af ​​BLM
mutationer i MMP + tumorer genererer et paradoks: BLM
mutationer forventes at generere kromosomal ustabilitet mens de fleste af de MMP + tumorer er diploid. Ikke desto mindre, nogle MMP + tumorer er aneuploid og BLM
tab-af-funktion mutationer kan have pleiotrope konsekvenser, muligvis påvirker også mikrosatellit ustabilitet vej, som foreslået af beskrivelsen af ​​en øget intra-genmutationer i Bloom syndrom [44, 45 ]. I suppoprt til vores forslag er det fund, at vi har fundet, at BLM
er muteret i LoVo cellelinje, en coloncancercellelinie med både mikrosatellit og kromosomale inatability [43]. Meget mere, det var for nylig rapporteret, at SGS1
genet, Saccharomyces cerevisiae
homolog af BLM
og WRN,
undertrykker genom ustabilitet og homeologe rekombination og er overflødig med DNA mismatch repair (MMR) for at undertrykke brutto kromosomale omlejringer og til undertrykkelse af rekombination mellem afvigende DNA-sekvenser [49].
konklusioner Salg Vores resultater viser, at BLM
rammeforskydninger er hyppige ændringer i GC'er og er specifikt forbundet med MMP + tumorer, der udviser mindst 2 ustabile mikrosatellitter. Mutationer i BLM
synes at være ofte forbundet med rammeskift i BAX
i hMSH6
og /eller hMSH3
og tumorer med BLM
ændringer præsentere en række ustabile mono- og trinukleotid gentagelser placeret i kodende regioner signifikant højere end hos MMP + tumorer uden BLM
rammeforskydninger. Vi foreslår, at BLM
tab af funktion af MSI i gastriske tumorer er et mellemprodukt mutations begivenhed, der kan øge ustabiliteten af ​​en præ-eksisterende ustabil genotype.
Metoder
tumorprøver
Halvtreds primære gastriske tumorer og deres normale parrede væv (blod eller normal gastrisk mucosa) blev udvalgt på grundlag af de foreliggende DNA fra et panel af 80 gastriske tumorer (27, Calin G og Negrini M upublicerede data). Når det er muligt, områder af tumorvæv med minimale inflammatoriske celler eller minimal stroma eller begge, blev udvalgt til opnåelse af en neoplastisk celle belastning større end 50%. Alle sager blev identificeret histopatologisk som adenokarcinomer. Histotype (ifølge Laurens klassifikation) [28] og iscenesættelse (ifølge TNM klassifikation) [29] var kendt for 47 ud af 50 tilfælde (94%) (tabel 1). Tredive-to sager var af intestinal histotype og 15 tilfælde af diffuse eller blandet type. Tyve tumorer blev iscenesat I eller II, mens 27 var i stadium III eller IV. Med hensyn til lymfeknuderne status, atten sager NO og 29 var N-positive. Ingen af ​​patienterne havde udviklet en cancer i en tidlig alder, og ingen havde en familiehistorie antyder genetisk anlæg for cancer. Højmolekylære DNA blev isoleret ved hjælp af etablerede procedurer [30]
Vurdering af MSI
MSI blev afsløret med to sæt anonyme markører på loci:. (I) D11S1778, D11S1328, D11S922
og D11S1318
[24] eller (ii) D2S177, D3S1076, D5S433, D11S904, D17S796
og D18S59
[27]. Primerne for disse dinukleotid mikrosatellit loci blev opnået fra oplysninger tilgængelige via Genome DataBase. PCR-amplifikationer blev udført som beskrevet tidligere [24, 27]. For alle prøver BAT25
BAT26
mikrosatellitter blev analyseret ved PCR-amplifikation som beskrevet [31]. MSI blev vurderet, om en mobilitetsforskydning af PCR-produkter fra tumor-DNA sammenlignet med den normale modpart blev identificeret. tumorer kun med mindst 2 MSI (> 30% af de testede mikrosatellitter). blev anset MMP +
Amplifikation af mikrosatellitter i BLM og i andre kodende regioner (CDR'er)
(A) 9 mikrosatellit lokaliseret i position 1610- 1618 af BLM
cDNA-sekvens blev analyseret for alle parrede prøver. Kort fortalt blev mikrosatellit amplificeret ved PCR under anvendelse af 50 ng template-DNA, 1 uM af hver primer, 1,5 mM af MgC12, 50 pM af hver af dATP, dGTP og dTTP og 5,0 uM af dCTP, 0,1 enhed Taq-DNA-polymerase, og 1 ^ Ci [α33P] dCTP i 10 pi reaktion volumen. PCR-reaktioner blev udført i en cyklus på 94 ° C i 5 minutter efterfulgt af 35 cykler ved 94 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s. PCR-produkter fra tumor og tilsvarende kontrol-DNA'er blev påsat parallelt på 6% acrylamid sekventeringsgeler og udsat for visualisering ved autoradiografi på Kodak X-AR-film. Påvisning af mutationer i mikrosatellitter placeret i CDR fra otte andre gener (den (A) 10 i TGFp1-RII,
den (G) 8 i IGFIIR,
(G) 8 i BAX,
(A) 8 i hMSH3,
den (C) 8 i hMSH6,
(A) 9 i RecQL,
(A) 8 i WRN,
og (ATG) 6 i CBL
) blev udført som beskrevet tidligere [14, 16, 17, 24, 32]. Til verifikation blev hver PCR gentaget mindst to gange. En muteret allel var repræsenteret ved en båndforskydning på 1 til 3 bp fra normale bånd med intensitet sammenlignelig eller større end den for vildtype-båndet (fig. 1).
Sekventering af unormale produkter Salg Genomisk DNA-fragmenter udviser band skift blev reamplificeret under de samme betingelser med undtagelse af udeladelse af mærket dCTP. Før sekventering blev PCR-produkterne oprenset enten direkte eller efter separation i en 2% agarosegel under anvendelse af Qiagen rensning kits. Begge DNA-strenge blev sekventeret under anvendelse af PCR-primere og et automatiseret Applied Biosystem 377 sekventering station. Nukleotidsekvenser blev analyseret under anvendelse af Wisconsin (GCG) programmet pakkeversion Unix-8.1.
Statistisk analyse
Den statistiske analyse af resultaterne blev udført under anvendelse af Χ 2 test eller Fishers eksakte test. AP
værdi. ≪ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant
erklæringer
Kvittering
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) og dels fra EF BIOMED kontrakt BMH4-CT95-0914. GC blev støttet af en IARC Forskeruddannelse Fellowship.
Forfattere 'originale filer indsendt til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12863_2001_18_MOESM1_ESM.png Forfatternes oprindelige fil til figur 1

• Abdominal migræne hos børn: sammenhæng mellem gastrisk motilitet parametre og kliniske karakteristika
• Mavesårshæmmende aktivitet af roden bark ekstrakt af den afrikanske guldregn "Cassia sieberiana" og dens virkning på den antioxidant forsvarssystem i rats