mutations du cadre de lecture somatique dans le gène du syndrome de Bloom BLM sont fréquents dans les carcinomes gastriques sporadiques avec microsatellite mutator phénotype

mutations du cadre de lecture Somatic dans le gène du syndrome BLM Bloom sont fréquents dans les carcinomes gastriques sporadiques avec microsatellite mutator phénotype
Résumé de l'arrière-plan
instabilité génomique a été rapporté à des secteurs de microsatellites dans quelques séquences codantes. Nous avons montré que le gène du syndrome BLM Bloom peut être une cible de microsatelliteinstability (MSI) dans une répétition de poly-adénine courte situé dans sa région codante. Pour caractériser davantage la participation des
BLM dans la tumorigenèse, nous avons étudié les mutations dans neuf gènes contenant microsatellites de codage dans microsatellite mutator phénotype (MMP) carcinomes gastriques positifs et négatifs (GCS).
Méthodes
Nous avons analysé 50 gastrique carcinomes (SCG) pour des mutations dans le poly (A) des voies de aswell du BLM comme dans les microsatellites de codage du TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6, BAX, WRN, RECQL
et les gènes CBL de.
Résultats
BLM de les mutations ont été trouvées dans 27% des MMP + GCS (4/15 cas), mais pas dans l'un des glucocorticoïdes négatifs MMP (0/35 cas). La fréquence des mutations dans les régions codantes huit autres microsatellites est le suivant: TGFβ1-RII
(60%) (27%) de BAX (20%) de hMSH6, hMSH3
(13 %), CBL
(13%), (7% de IGFIIR) (0% de RECQL) et WRN
(0%). Des mutations dans BLM
semblent être plus souvent associée à des déphasages en BAX
et hMSH6
et /ou Tumeurs hMSH3. Avec BLM de les altérations présentent une fréquence plus élevée de mono- instable et trinucléotides répétitions situées dans les régions de codage par rapport aux tumeurs mutator phénotype sans BLM de les déphasages.
Conclusions
BLM de les déphasages sont fréquentes modifications dans GCS spécifiquement associés à MMP + tumeurs. Nous suggérons que BLM de la perte de la fonction MSI peut augmenter l'instabilité génétique d'un génotype instable préexistante dans les tumeurs gastriques.
Contexte
Le cancer est une maladie génétique progressive caractérisée par une accumulation progressive de mutations dans les deux codage et des séquences non codantes [1]. répétitions de séquences simples ou microsatellites sont très instables dans certains néoplasmes humains, l'identification d'une classe de tumeurs avec le microsatellite mutator phénotype (MMP +) (pour revue voir [2]). MMP + ve état est défini par l'instabilité dans plus de 30% des microsatellites analised, comprenant au moins un mononucléotide (tel que BAT26 ou BAT25) [3]. l'instabilité des microsatellites (MSI) a été décrit comme une altération génétique fréquente dans diverses tumeurs solides humaines, y compris les carcinomes gastriques sporadiques et familiaux (GCS). Dans presque tous les patients atteints de cancer héréditaire sans polypose colorectal (HNPCC), les études moléculaires ont montré que MSI est causée par des mutations germinales dans les gènes codant pour des protéines nécessaires à la mismatch repair (MMR) [4]. Les gènes tels que hMSH2, hMLH1, PMS1, PMS2
et hMSH6 /GTBP
[5-8], ont été définis comme des «gardiens» parce que, quand perturbé, ils favorisent l'acquisition de mutations à haute fréquence dans plusieurs gènes, y compris oncogènes et gènes suppresseurs de tumeur [9]. Cependant, une fraction importante de la MMP sporadique + tumeurs, l'analyse de mutation n'a pas permis l'identification des gènes responsables de la MSI [2, 10], ce qui suggère que, dans de tels cas, MSI peut être provoqué par des mécanismes épigénétiques. En fait, silençage génique par le promoteur hypermethylation a été récemment montré pour le gène de la hMLH1 [11-13].
L'importance de MSI dans la tumorigenèse a été soutenu par la démonstration que l'instabilité génétique caractérisant MMP + cancers gastro-intestinaux peut cibler à court voies répétitives au sein de la région codante de gènes importants pour la survie et la prolifération cellulaire. des mutations d'insertion /délétion ont été trouvés dans les gènes codant pour le récepteur de croissance transformant de type facteur-bêta II (TGFβ1-RII
), le récepteur de type facteur de croissance analogue à l'insuline II (IGFIIR
), les gènes non-concordance de réparation de l'ADN hMSH3
et hMSH6,
le pro-apoptotique BAX gène
et le facteur de transcription E2F-4
[14-18]. Dans tous les cas, à l'exception de l'E2F-4, nucléotides of the insertion /délétion conduit à des mutations du cadre de lecture et de protéines troncature. Bien que l'importance biologique de ces altérations ne sont pas totalement établi, il a été proposé que l'absence de récepteurs TGFβ1-IIR à partir de la surface des cellules épithéliales gastro-intestinales pourrait éliminer le contrôle négatif de croissance du TGF-β, conduisant à une croissance cellulaire incontrôlée [19]. IGFIIR a un rôle dans la suppression de la croissance par la liaison et l'activation du complexe récepteur TGFβ1 et par la médiation de l'intériorisation, avec une dégradation subséquente du facteur de croissance IGF-II [20, 21]. BAX
favorise l'apoptose et il a été rapporté que BAX de l'inactivation conduit à une croissance rapide de la tumeur [22]. Les gènes humains hMSH3
et hMSH6
sont homologues au gène des MutS bactériennes dont les produits se lier inadéquations d'ADN pour initier la réparation spécifique de brin d'erreurs de réplication de l'ADN [23]. Somatique et germinale mutations dans hMSH6
étaient associées sporadiques MMP + carcinomes colorectaux et HNPCC [6].
Nous avons trouvé précédemment que le gène de BLM peut également être une cible de MSI [24]. Les déphasages, trouvés dans une répétition de poly-adénine court, ont été prévus pour générer une protéine BLM tronquée et non fonctionnelle. mutations homozygotes ou hétérozygotes composites au gène de la BLM ont été montrées pour provoquer le syndrome de Bloom (BS; OMIM 210900), une condition pré-maligne caractérisée par une instabilité chromosomique et taux de mutation augmenté. les patients atteints de BS sont prédisposés à une grande variété de néoplasmes diagnostiqués à un âge précoce. Il convient de noter, parmi les 100 néoplasmes enregistrées dans le registre de BS, 19 étaient gastro-intestinal (œsophage, estomac et du côlon) et seulement deux ont été diagnostiqués après l'âge de 40 ans [25]. Ces données indiquent que des mutations dans le gène de la BLM peuvent promouvoir la tumorigenèse
Pour mieux définir le rôle de
BLM dans la tumorigenèse gastro-intestinal nous avons projeté un panel de MMP + et les carcinomes gastriques MMP (SCG) pour:. A) déphasages dans la région codante du microsatellite du BLM et les résultats de b) pour d'éventuelles associations avec d'autres intragéniques déphasages.
statut MSI
pour la présente étude, notre panel de 50 GCS contient 15 MMP + tumeurs avec MSI au deux ou plusieurs locus (Tableau 2) et 35 une altération GCS MMP à une microsatellites (4 tumeurs) ou sans MSI (31 tumeurs). Tous les MMP + cas étaient BAT 26 positifs, et BAT 25 instabilité a été trouvée dans 13 cas sur 15 (sauf cas 67R et 27P). Les caractéristiques clinico-pathologiques de MMP + tumeurs sont décrites dans le tableau 1. Le phénotype MMP + a été étroitement associée à une étape de pTNM bas et avec métastases ganglionnaires moins répandues (p = 0,02 et p = 0,001 au test exact de Fisher, respectivement, par rapport à
MMP-tumeurs). Au sein du groupe MMP +, un excès de tumeurs à des stades précoces et sans métastases ganglionnaires a été trouvé (10/15 cas vs 10/32 cas de MMP cas, p = 0,02 et 11/15 cas vs 7/32 cas de cas MMP, p = 0,001, respectivement), les données qui soutiennent la meilleure pronostique proposée de GCS MMP + [33, 34]. Il convient de noter, aucun excès de type intestinal chez MMP + tumeurs n'a été observée (12/15
cas par rapport 20/32 des cas MMP) (tableau 1), les données conformément à des études récentes qui montrent aucune différence significative dans la fréquence de MSI au type intestinal et de type diffus carcinomes [26, 35] .Tableau 1 histotype et mise en scène des paramètres associés au phénotype MMP dans notre GCSA
variable
Nombre de
P patients valeurB
total (%)
MMP + (%)
MMP - (%)
histotype
Intestinal
32 (68,0)
12 (37,5)
20 (62,5)
diffuse +
Mixed 15 (32,0)
3 (20,0)
12 (80,0)
NSc
T (profondeur de la paroi infiltration)
T1 + T2
12 (25,5)
6 (50,0)
6 (50,0)
T3 + T4
35 (74,5 )
9 (25,7)
26 (74,3)
NS
N (lymphe statut de nœud)
N0
18 (38,3)
11 (78,5) 7
(21,5)
N +
29 (61,7)
4 (12.1)
25 (87,9)
= 0,001
M (métastases)
M0
40 (85,1 )
14 (35,0)
26 (65,0) M +

7 (14,9)
1 (14.2)
6 (85,8) NS

Staging
I + II
20 (42,5)
10 (58,8)
10 (41,2)
III + IV
27 (57,5)
5 (16.6)
22 ( 83,4)
= 0,02
Totala
47
15
32
a - données étaient disponibles pour 47 des 50 cas b - au test exact de Fisher c - NS = non statistiquement significative
Tableau 2 Statut des microsatellites de codage au sein de BLM, WRN, RECQL, CBL, hMSH6, hMSH3, IGFIIR, TGF-βRII
et les gènes BAX de la série des carcinomes gastriques avec microsatellite mutator phénotype.
Case

Histotypea

Stagingb


BLM

WRN

REQL

CBL

hMSH6

hMSH3

IGFIIR

TGF-βRII

BAX

No.



MSIc

(A)9

(A)8

(A)9

(ATG)6

(C)8

(A)8

(G)8

(A)10

(G)8

31R
I
I(T2N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
57R
I
IV(T3N1M1)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
63R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
+
-
-
+
+
67R
I
I(T2N0M0)
4/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
69R
D
II(T3N0M0)
4/5
+
-
-
+
+
+
-
+
+
79R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3P
I
II(T3N0M0)
4/7
+
-
-
-
-
-
-
-
+
11P
I
III(T3N1M0)
3/7
+
-
-
-
-
+
+
+
-
14P
M
II(T3N0M0)
6/7
+
-
-
+
+
-
-
+
+
17P
I
II(T3N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
19P
D
III(T3N1M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
27P
I
IV(T4N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
30P
I
I(T2N0M0)
3/6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
37P
I
I(T2N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
38P
I
III(T3N2M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
%
present étude (nombre de cas)
27%
0% 0%

13%
20%
13%
7%
60%
27 %
(4/15)
(0/15)
(0/15)
mutations (2/15)
(3/15)
(2 /15)
(1/15)
(9/15)
(4/15)
rapporté dans la littérature (en GCS) d
-
- -
- 22-52%
19-64%
19-24%
42-83%
15-64%
a - I = type intestinal; D = type diffus; M = type mixte b - selon la classification TNM (Sobin et Wittekind, 1997) c - nombre total testé microsatellites /instables d - données compilées à partir des références: [17,27,42,50,51,52]
BLM frameshifts
PCR amplification de microsatellites du BLM a révélé des bandes anormales, absents dans les ADN appariés normaux, dans 4 des 15 MMP + tumeurs (27%) (Fig. 1). Nous avons confirmé par séquençage que les bandes anormales sont dues à une délétion d'un résidu d'adénine dans le tractus poly-adénine (réduction de neuf à huit adénines), comme indiqué précédemment [24]. La fréquence de mutation dans
BLM peut être une estimation basse, parce que nous avons exclu les cas où des bandes anormales dans les ADN de tumeur étaient nettement plus faibles que les normales, peut-être à la suite d'une grande contamination de la tumeur avec des cellules non malignes ou d'un faible partie des cellules malignes présentant l'anomalie (Fig. 1). Comme aucune
mutation BLM a été observée dans les tumeurs MMP, mutations de dans le gène de la BLM semblent être spécifiquement associés à MMP + tumeurs gastriques (probabilité de P < 0,01 à test exact de Fisher), similaire à la précédente bien modifications documentées dans TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6
et BAX de gènes [14, 16, 17, 32]. Par conséquent, les données d'élargir le répertoire des gènes modifiés associés à des carcinomes gastriques MMP +. Figure 1 Des exemples représentatifs de mutations détectées dans microsatellites au niveau des régions de gènes codant. Le nombre de cas sont présentés ci-dessus chaque normale correspondant (N) et de la tumeur (T) paires d'ADN. Les flèches indiquent les bandes anormales. Notez que nous n'avons pas examiné des échantillons mutés où des bandes anormales étaient très faibles (comme dans le
BLM et les gènes BAX de tumeur de l'échantillon 30P). En raison de la tendance de la Taq polymérase pour ajouter un nucleotide supplémentaire à l'extrémité des fragments d'ADN synthétisés, des produits de PCR apparaissent parfois sous forme de bandes doubles. À l'exception de BAX de la tumeur dans le cadre de lecture 69R, aucune autre mutation semble être homozygote. Toutefois, en connaissant le rapport de cellules malignes dans l'échantillon de la tumeur, nous avons indiqué précédemment que la mutation du BLM en 69R de la tumeur est également homozygote [24].
Déphasages dans d'autres CDR microsatellites et les relations avec déphasages BLM
le même panel de MMP + tumeurs a également été analysée pour la présence de déphasages dans microsatellites situés dans les régions codantes de huit autres gènes (tableau 2). Nous avons trouvé la variation de longueur de la séquence dans TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6
et les gènes BAX de tous signalé précédemment être modifié en MMP + GCS. Les données sur l'état de l'TGFβ1-RII pour huit (série P dans le tableau 2) des quinze tumeurs ont été précédemment rapportés [27]. Les fréquences de mutations observées sont comparables à ceux rapportés précédemment pour l'ensemble de ces gènes, à l'exception de IGFIIR,
pour lesquels nous avons constaté un faible pourcentage de déphasages (tableau 2). Fait intéressant, en comparaison avec
mutations BLM, les déphasages de seulement TGFβ1-RII étaient plus fréquentes (60% contre 27%, respectivement) et BAX de les déphasages étaient aussi bien que fréquente (27%). Ces données suggèrent que des déphasages dans
BLM sont des altérations communes dans MMP + GCS. Une tendance vers une association entre des mutations dans
BLM et des mutations dans BAX
et hMSH3
et /ou hMSH6
a été observée (tableau 2) (P = 0,05 à test exact de Fisher).
Nous avons également analysé la RecQL, WRN
et CBL de gènes qui contiennent des répétitions courtes dans leurs régions codantes. Les deux premiers gènes sont des membres de la même famille de gènes que l'hélicase BLM
[36, 37]. Bien que RecQL
est pas associé à une maladie humaine, des mutations dans le gène WRN
sont la cause du syndrome de Werner (WS, OMIM 277700), un trouble récessif autosomique rare caractérisée cliniquement par un vieillissement prématuré et un risque accru pour une variété des néoplasmes, et caractérisé génétiquement par l'instabilité génomique. CBL
est un récepteur tyrosine kinase [38], dont la dérégulation est associée à l'oncogenèse [39]. Nous avons identifié des mutations uniquement dans le gène de la CBL (Fig. 1). Deux échantillons (69R) et 14P ont été trouvées pour effectuer une insertion de 3 pb dans le trinucleotide (ATG) 6 répétition du gène de la CBL (données non présentées). Comme nous l'avons signalé précédemment [24], car aucun déphasage est produit, aucune conséquence fonctionnelle peut être déduit. Les deux mutations ont été trouvées dans les cancers présentant également des déphasages de
BLM (tableau 2). Il est à noter que ce sous-ensemble de tumeurs montrent un excès statistiquement significatif de MSI dans les régions de codage par rapport au sous-ensemble MMP + sans les modifications de BLM. (P < 0,001, à Χ 2 test) (tableau 2)
Discussion
Plusieurs études ont démontré que des voies alternatives peuvent exister dans gastrointestinal MMP + et MMP cancers caractérisés par différents ensembles de gènes modifiés [40]. Un modèle progressif des mutations mutateurs ( «le mutateur qui mute l'autre mutateur") a été proposé de définir le mutateur par rapport aux voies de suppresseurs de tumeurs gastro-intestinales [41]. En analysant le calendrier des événements mutationnels génétiquement instables GCS, il a été proposé que les premières cibles de déficit de réparation des appariements sont les secteurs de mononucléotide de TGFβ1-RII
et BAX.
Les mutations du cadre de lecture de hMSH3
et hMSH6
semblent être des lésions de réparation des mésappariements secondaires, qui génèrent des mutations dans IGFIIR
[42]. La constatation que les mutations de chez TGFβ1-RII
sont les plus fréquents et IGFIIR
sont moins fréquentes dans MMP + tumeurs gastriques soutient le modèle dans lequel les événements précoces devraient être présents dans la majorité des tumeurs et mutations tardives seulement dans une fraction mineure [43]. Cette constatation est également confirmée dans notre étude (tableau 2). mutations de de BLM sont associées plus fréquemment avec des première et deuxième altérations étape proposées dans ce modèle, ce qui suggère qu'ils sont secondaires à désadaptation défauts de réparation (en hMSH3
et /ou hMSH6
) présent dans les cellules qui ne sont pas subir une apoptose (peut-être en conséquence de l'inactivation de Bax). Il convient de noter, dans le cas où 3P, en plus de BLM,
les seuls déphasages ont été trouvés dans BAX (voir
figure 1) et p53
(données non présentées) des gènes, ce qui suggère que, dans certains cas, BLM
altération peut se produire sans hMSH3
et /ou de hMSH6 des mutations dans les cellules avec la voie anormale de p53 induite par la réponse apoptotique à l'ADN non-concordance.
L'implication de
BLM dans la tumorigenèse à l'extérieur des patients BS semble concevable, puisque ce gène semble agir comme un gardien. BLM de les mutations sont connues pour provoquer une instabilité génomique accrue caractérisée par un nombre élevé de cassures chromosomiques, des lacunes et des réarrangements et par un nombre excessif de mutations dans les deux régions codantes et non codantes, probablement originaire par l'échange inégal chromatides sœurs, caractéristique du syndrome de Bloom [44, 45]. En conséquence, BS présente une combinaison de l'instabilité génomique et le risque élevé de cancer, une association trouve aussi dans d'autres maladies causées par des défauts dans les gènes de gardien (comme HNPCC, WS, ataxie télangiectasie et xeroderma pigmentosum). Comme pour les mutations trouvées dans BS, les déphasages décrits dans GCS abolissent la fonction hélicase de la protéine BLM [24]. la protéine BLM a une activité de déroulage d'ADN éprouvé [46] et pourrait être impliqué dans les processus qui sont perturbés dans les cellules malignes, telles que la réplication de l'ADN, la recombinaison, la ségrégation des chromosomes, réparation de l'ADN et la transcription. En effet, le gène fission levure BLM
homologue (de radl2
+ /rqhl
+) a été montré pour réguler le point de contrôle S-phase et a été proposé à l'intégrité chromosomique de couple avec la progression du cycle cellulaire [47, 48]. Cependant, la découverte de BLM de mutations dans les MMP + tumeurs génère un paradoxe: BLM de les mutations sont prévus pour générer une instabilité chromosomique alors que la plupart des MMP + tumeurs sont diploïdes. Néanmoins, certains MMP + tumeurs sont aneuploïdes et les mutations de perte de fonction de BLM peuvent avoir des conséquences pléiotropiques, affectant éventuellement la voie microsatellite d'instabilité, comme le suggère la description d'une augmentation des mutations intra-gène dans le syndrome de Bloom [44, 45 ]. Dans suppoprt à notre suggestion est la constatation que nous avons constaté que
BLM est muté dans la lignée cellulaire LoVo, une lignée de cellules de cancer du côlon à la fois microsatellite et chromosomique inatability [43]. Bien plus, il a été récemment rapporté que le gène SGS1 de, l'homologue de la Saccharomyces cerevisiae de
BLM et WRN,
supprime l'instabilité du génome et la recombinaison homéologues et est redondant avec mismatch repair (MMR) pour supprimer réarrangements chromosomiques bruts et pour la suppression de la recombinaison entre des séquences d'ADN divergentes [49]. Conclusions de
Nos résultats indiquent que BLM de les déphasages sont fréquentes modifications en CG et sont spécifiquement associés à MMP + tumeurs présentant au moins 2 microsatellites instables. Des mutations dans BLM
semblent être fréquemment associés à des déphasages dans BAX
et en hMSH6
et /ou hMSH3,
et les tumeurs avec BLM de les altérations présenter un certain nombre de mono- et trinucléotides répétitions instables situés dans des régions nettement plus élevé que celui observé dans MMP + tumeurs sans BLM de les déphasages de codage. Nous suggérons que BLM de la perte de la fonction par MSI dans les tumeurs gastriques est un événement mutationnel intermédiaire, ce qui peut accroître l'instabilité d'un génotype instable préexistante.
Méthodes
échantillons tumoraux
Cinquante tumeurs gastriques primaires et leurs tissus appariés normaux (de sang ou de la muqueuse gastrique normale) ont été sélectionnés sur la base de l'ADN disponible à partir d'un panel de 80 tumeurs gastriques (27, Calin G et Negrini M données non publiées). Lorsque cela est possible, les zones de tissu tumoral avec un minimum de cellules inflammatoires ou stroma minimale, ou les deux, ont été sélectionnés pour obtenir une charge de cellules néoplasiques supérieure à 50%. Tous les cas ont été identifiés comme histopathologique adénocarcinomes. Histotype (selon la classification de Lauren) [28] et la mise en scène (selon la classification TNM) [29] a été connu pour les cas 47 sur 50 (94%) (tableau 1). Trente-deux cas étaient de histotype intestinale et 15 cas de diffus ou de type mixte. Vingt tumeurs ont été organisées I ou II, alors que 27 étaient au stade III ou IV. En ce qui concerne le statut des ganglions lymphatiques, dix-huit cas étaient NO et 29 étaient N-positif. Aucun des patients avaient développé un cancer à un âge précoce, et aucun n'a eu une histoire familiale suggestive d'une prédisposition génétique au cancer. ADN de poids moléculaire élevé a été isolé en utilisant des procédures établies [30] de l'évaluation du MSI
MSI a été révélé avec deux ensembles de marqueurs anonymes à des loci:. (I) D11S1778, D11S1328, D11S922
et D11S1318
[24] ou (ii) D2S177, D3S1076, D5S433, D11S904, D17S796
et D18S59
[27]. Les amorces pour ces dinucléotide loci microsatellites ont été obtenus à partir d'informations disponibles sur le DataBase Genome. Les amplifications PCR ont été effectuées comme décrit précédemment [24, 27]. Pour tous les échantillons du BAT25
et les microsatellites BAT26 de ont été analysés par amplification par PCR comme décrit [31]. MSI a été évalué si un changement de mobilité des produits de PCR à partir d'ADN de la tumeur par rapport à la contrepartie normale a été identifié. Tumeurs Seulement avec au moins 2 MSI (> 30% des microsatellites testés). Amplification de MMP ont été considérés comme + de microsatellites dans BLM et dans d'autres régions codantes (CDR)
La (A) 9 microsatellite situé à la position 1610- 1618 de la séquence d'ADNc de BLM a été analysé pour tous les échantillons appariés. En bref, le microsatellite a été amplifié par PCR en utilisant 50 ng d'ADN matrice, 1 uM de chaque amorce, 1,5 mM de MgC12, 50 uM de chacun des dATP, dGTP et dTTP et 5,0 uM de dCTP, 0,1 unité de Taq ADN polymérase, et 1 uCi de [α33P] dCTP dans 10 ul de volume réactionnel. Les réactions PCR ont été effectuées pour un cycle de 94 ° C pendant 5 minutes suivie de 35 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s. Les produits de PCR à partir de la tumeur et les ADN témoins correspondants ont été chargés sur parallèle sur 6% de gels de séquençage d'acrylamide et exposés pour la visualisation par autoradiographie sur des films Kodak X-AR. La détection de mutations dans les microsatellites situés dans les CDR de huit autres gènes (le (A) 10 à TGFβ1-RII,
le (G) 8 à IGFIIR,
le (G) 8 à BAX,
la (A) 8 à hMSH3,
(C) 8 à hMSH6,
(A) 9 à RecQL,
(A) 8 à WRN,
et (ATG) 6 CBL
) a été effectuée comme décrit précédemment [14, 16, 17, 24, 32]. Pour la vérification, chaque produit de PCR a été répétée au moins deux fois. Un allèle muté est représenté par un changement de bande de 1 à 3 pb de la bande normale avec une intensité comparable ou supérieure à celle de la bande de type sauvage (Fig. 1).
Le séquençage des produits anormaux
fragments d'ADN génomique présentant des décalages de bande ont été réamplifiés dans les mêmes conditions, à l'exception de l'omission de dCTP marqué. Avant le séquençage, les produits de PCR ont été purifiés, soit directement, soit après séparation dans un gel d'agarose à 2%, en utilisant des kits de purification Qiagen. Les deux brins d'ADN ont été séquences en utilisant des amorces de PCR et d'une Biosystem 377 Station de séquençage automatisé. Les séquences nucléotidiques ont été analysées en utilisant le Wisconsin (GCG) version du package de programme Unix 8.1.
analyse statistique
L'analyse statistique des résultats a été réalisée en utilisant le Χ 2 essai ou test exact de Fisher. AP de la valeur de <. La reconnaissance de déclarations de 0,05 a été considérée comme statistiquement significative
Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) et en partie du contrat CE BIOMED BMH4-CT95-0914. GC a été soutenu par une bourse de formation du CIRC recherche.
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