Somatske premikom bralnega okvirja v sindrom BLM gena Bloom so pogoste v občasnih želodčnih karcinomov z mikrosatelitskih mutator phenotype

somatskih premikom bralnega okvirja v cvet sindrom BLM
gena so pogoste v občasnih želodčnih karcinomov z mikrosatelitskih mutator fenotipa
Abstract
Ozadje
Genomska nestabilnost so poročali pri mikrosatelitskih letakov v nekaj kodiranje zaporedij. Pokazali smo, da lahko cvet sindrom BLM
gen tarča microsatelliteinstability (MSI) v kratkem poli-adenin ponovitev na njenem kodirni regiji. Za nadaljnjo opredelitev sodelovanja BLM
v tumorigeneze, smo raziskovali mutacije v devetih genov, ki vsebujejo kodirane Mikrosateliti v mikrosatelitskih mutator fenotipa (MMP), pozitivni in negativni želodčni karcinomi (GK).
Metode
smo analizirali 50 želodca karcinomov (GCS) za mutacije v bLM
poli (A) trakta kot dobro, kot v kodiranja mikrosateliti v TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6, BAX, WRN, RECQL
in CBL
genov.
Rezultati
bLM
mutacij so našli v 27% MMP + GK (4/15 primerov), vendar ne v katerem koli od negativnih GK MMP (0/35 primerov). Pogostost mutacij v drugem osem kodirajo regij mikrosatelita je bila naslednja: TGFβ1-RII
(60%), BAX
(27%), hMSH6
(20%), hMSH3
(13 %), CBL
(13%), IGFIIR
(7%), RECQL
(0%) in WRN
(0%).
pojavijo mutacije BLM se pogosteje povezana z bralnega okvira v BAX
in hMSH6
in /ali hMSH3.
Tumorji z BLM
spremembe predstavljajo višjo frekvenco nestabilnih mono- in trinukleotidno ponavlja se nahajajo v kodirnih regij v primerjavi s mutator fenotip tumorji brez bLM
bralnega okvira.
sklepe
bLM
bralnega okvira so pogoste spremembe v GK posebej povezani z MMP + tumorjev. Predlagamo, da se lahko BLM
izguba funkcije, ki jih MSI poveča genetsko nestabilnost predhodno obstoječe nestabilno genotip v želodcu tumorjev.
Ozadje
raka je napredujoča genetska bolezen, ki povzroči postopno kopičenje mutacij v obeh kodiranje in sekvence nekodiran [1]. Enostavno zaporedje ponavlja ali mikrosateliti so zelo nestabilne v nekaterih človeških novotvorbe, ki označuje razred tumorjev z mikrosatelitskih mutator fenotipa (MMP +) (za pregled glej [2]). MMP + ve položaj določata nestabilnosti v več kot 30% analised mikrosateliti, ki vključuje vsaj en mononukleotida (kot BAT26 ali BAT25) [3]. Mikrosatelitskih nestabilnost (MSI) je bil opisan kot pogoste genetske spremembe v različnih človeških čvrstimi tumorji, vključno z občasnimi in družinskih želodčne karcinomov (GCS). V skoraj vseh bolnikih z dednim nonpolyposis kolorektalnega raka (HNPCC), so molekularne študije pokazale, da je MSI ga reproduktivnih mutacij, povzročenih v genih, ki kodirajo proteine, ki so potrebni za DNA popravljanja neujemanja (MMR) [4]. Geni kot hMSH2, hMLH1, PMS1, PMS2
in hMSH6 /GTBP
[8/5], so bile opredeljene kot "skrbniki", ker, ko moten, se spodbuja pridobivanje mutacij na visoke frekvence v različnih genov, vključno onkogeni in tumor zaviralni geni [9]. Vendar pa je v velikem deležu sporadične MMP + tumorjev, analiza mutacija ni dovoljeno identifikacijo genov, ki so odgovorni za MSI [2, 10], kar kaže, da v takih primerih, MSI bi jih epigenetskih mehanizmov povzroča. V resnici je bil gen utišanje s promotorja hypermethylation nedavno pokazala za hMLH1
gena [11-13].
Pomen MSI v tumorigeneze je podprt s prikazom, da lahko genska nestabilnost karakterizacijo MMP + prebavilih raka usmerjeni kratko ponavljajoče predele v kodirni regiji gena pomembne za preživetje celic in proliferacijo. Vstavljanje /izbris mutacije so bile ugotovljene v genih za II receptor transformirajočega rastnega faktorja, tip-beta (TGFβ1-RII
), receptor inzulinu podoben tip rastni faktor II (IGFIIR
), na DNA neskladje, popravila genov hMSH3
in hMSH6
na proapoptotičnih gen Bax
in transkripcijski faktor E2F-4
[14-18]. V vseh primerih, z izjemo E2F-4
vstavitev nukleotidi /izbris povzročilo premikom bralnega okvirja in beljakovin krajšanje. Čeprav je biološki pomen teh sprememb ni povsem ugotovljeno je bilo predlagano, da bi odsotnost TGFβ1-RII receptorjev na površini gastrointestinalnih epitelnih celic odpravila negativno kontrolo rasti TGF-P, ki vodi do nekontrolirano celično rastjo [19]. IGFIIR ima vlogo pri zatiranju rasti z vezavo in aktiviranje receptorjev kompleks TGFβ1 in po posredovanju internalizacijo, z nadaljnjo razgradnjo, v rastnega faktorja IGF-II [20, 21]. BAX
spodbuja apoptozo in so poročali, da BAX
deaktivacijo vodi do hitre rasti tumorja [22]. Potrebe po človeških genov hMSH3
in hMSH6
so homologne bakterijske mutS
gena, katerih proizvodi se veže DNK neustreznih za začetek sklopa specifične popravila replikacije DNA napak [23]. Somatske in zarodne mutacije hMSH6
ki so bili povezani z občasnimi MMP + debelega karcinomov in HNPCC [6].
Ugotovili smo že, da lahko tudi v BLM
gen tarča MSI [24]. Je bralnega okvira, ki se nahajajo v kratkem poli-adenin ponavljanje bilo predvideno, da ustvari okrnjen in nefunkcionalne BLM protein. Homozigotnim ali sestavljenih heterozigotnih mutacij na BLM
gena so pokazale, da povzroči Bloom sindrom (BS; OMIM 210.900), pre-maligno stanje je značilna kromosomsko nestabilnost in povečane mutacijsko mero. bolniki BS so nagnjeni k različnih neoplams znano že v zgodnjem otroštvu. Omembe vredne med 100 novotvorb, evidentiranih v registru BS, 19 je bilo v prebavilih (požiralnik, želodec in debelega črevesa) in so diagnosticirali le dve po starosti 40 let [25]. Ti podatki kažejo, da lahko mutacije in v BLM
gena spodbujanje tumorigeneze
Da bi bolje opredeliti vlogo BLM
v prebavnem tumorigeneze smo pregledani na plošči MMP + in MMP- želodca karcinomov (GCS) za: a.) bralnega okvira v bLM
kodiranja regije mikrosatelita in b) za morebitne združenja z drugimi intragenic bralnega okvira.
Rezultati
MSI stanja
za te študije, naša plošča 50 GK vsebuje 15 MMP + tumorjev MSI na dva ali več lokusov (tabela 2) in 35 GK MMP- s spremembo na enem mikrosatelita (4 tumorji) ali brez MSI (31 tumorji). Vse MMP + primeri so bili BAT 26 pozitivnih in BAT 25 nestabilnost je bilo v 13 od 15 primerov (razen v primerih 67R in 27P). V klinično-patološke značilnosti MMP + tumorjev so opisani v tabeli 1. MMP + fenotip je bil tesno povezan z nizko stopnjo pTNM in z manj razširjena vozliščih metastaz (p = 0,02 in p = 0,001 pri Fisher točno testa, v tem zaporedju, v primerjavi z
MMP-tumorji). V skupini MMP +, je bilo ugotovljeno, presežek tumorjev v zgodnji fazi in brez bezgavkah metastaze (10/15 primere vs 10/32 primere MMP- primerih, p = 0,02 in 11/15 primere vs 7/32 primerov MMP- primerih, p = 0,001, in sicer), podatki, ki podpirajo predlagani boljši napovedni GCS MMP + [33, 34]. Pomembno je omeniti, je bilo ugotovljeno, ni presežek črevesne vrste med MMP + tumorjev (12/15 primerov v primerjavi
20/32 za MMP- primere) (tabela 1), podatki v skladu z nedavnimi študijami, ki kažejo nobene pomembne razlike v pogostosti MSI v črevesju tipa in difuzno tipa karcinomov [26, 35] .table 1 Histotype in počivališča parametre, povezane s fenotipa MMP v naši GCsa
Variable

Število bolnikov
P VALUE mrd
Skupaj (%)
MMP + (%)
MMP - (%)
Histotype
črevesnih
32 (68,0)
12 (37,5)
20 (62,5)
difuzna + Mešani
15 (32,0)
3 (20,0)
12 (80,0)
NSC
T (globina stene infiltracije)
T1 + T2
12 (25,5)
6 (50,0)
6 (50,0)
T3 + T4
35 (74,5 )
9 (25,7)
26 (74,3)
NS
N (status vozlišča limfa)
N0
18 (38,3)
11 (78,5)
7 (21.5)
N +
29 (61,7)
4 (12,1)
25 (87,9)
= 0,001
m (metastaze)
M0
40 (85.1 )
14 (35,0)
26 (65,0)
M +
7 (14,9)
1 (14,2)
6 (85,8)
NS
Uprizoritev
I + II
20 (42,5)
10 (58,8)
10 (41,2)
III + IV
27 (57,5)
5 (16,6)
22 ( 83.4)
= 0.02
Totala
47
15
32
a - so bili na voljo za 47 od 50 primerov b podatkov - na Fisher točno testni c - NS = ni statistično značilna
Tabela 2 Stanje kodiranje mikrosateliti v BLM, WRN, RECQL, CBL, hMSH6, hMSH3, IGFIIR, TGF-βRII
in Bax
geni v seriji želodca karcinomov z mikrosatelitskih mutator fenotipa.
Case

Histotypea

Stagingb


BLM

WRN

REQL

CBL

hMSH6

hMSH3

IGFIIR

TGF-βRII

BAX

No.



MSIc

(A)9

(A)8

(A)9

(ATG)6

(C)8

(A)8

(G)8

(A)10

(G)8

31R
I
I(T2N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
57R
I
IV(T3N1M1)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
63R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
+
-
-
+
+
67R
I
I(T2N0M0)
4/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
69R
D
II(T3N0M0)
4/5
+
-
-
+
+
+
-
+
+
79R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3P
I
II(T3N0M0)
4/7
+
-
-
-
-
-
-
-
+
11P
I
III(T3N1M0)
3/7
+
-
-
-
-
+
+
+
-
14P
M
II(T3N0M0)
6/7
+
-
-
+
+
-
-
+
+
17P
I
II(T3N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
19P
D
III(T3N1M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
27P
I
IV(T4N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
30P
I
I(T2N0M0)
3/6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
37P
I
I(T2N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
38P
I
III(T3N2M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
%
present Študija (število primerov)
27%
0%
0%
13%
20%
13%
7%
60%
27 %
mutacije
(4/15)
(0/15)
(0/15)
(2/15)
(3/15)
(2 /15)
(1/15)
(9/15)
(4/15)
poročajo v literaturi (v GK) d
- -
- -
22-52%
19-64%
19-24%
42-83%
15-64%
a - I = črevesne tipa; D = difuzna tipa; M = mešan tip b - v skladu s klasifikacijo TNM (Sobin in Wittekind, 1997) c - število nestabilnih /skupnih testirali mikrosateliti d - podatke, zbrane iz referenc: [17,27,42,50,51,52]
bLM bralnega okvira
PCR pomnoževanje v bLM
mikrosatelita pokazala nenormalno pasove, odsotne v normalnih ujema DNA, pri 4 od 15 MMP + tumorjev (27%) (sl. 1). Potrdili smo sekvenciranje da so nenormalne pasovi z izbrisom ene adenin ostanka v poli-adenin trakta (zmanjšanje od devet do osem adenine) povzročili, kot je bilo predhodno prikazano [24]. Pogostost mutacije v BLM
lahko nizko oceno, ker smo izključeni primeri, v katerih so bili nenormalni pasovi v tumorskih DNK opazno šibkejša od običajnih tistih, morda kot posledica velikega onesnaženja tumorja z nemaligna celic ali nizka del malignih celic, ki prikazujejo nenormalnost (sl. 1). Ker ni bila BLM
mutacije videli v MMP- tumorjev, se zdi premikom bralnega okvirja in v BLM
gena, ki se posebej povezana z želodčnih MMP + tumorji (verjetnost P < 0,01 na Fisher točno testa), podoben prejšnjemu dobro dokumentirane spremembe v TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6
in Bax
genov [14, 16, 17, 32]. Zato so naši podatki razširiti repertoar spremenjenih genov, povezanih z MMP + želodčnih karcinomov. Slika 1 predstavnik primere mutacij, odkritih v mikrosateliti na gena regijah. Primerov številke so prikazane drug nad ujemanje normalno (N) in tumorja (T) DNA parov. Puščice kažejo nenormalne pasove. Upoštevajte, da smo ne šteje mutiral vzorce, če so bili nenormalni trakovi zelo šibek (kot v BLM
in Bax
genov tumorskega vzorca 30P). Zaradi tendence Taq polimeraza bi dodali dodatne nukleotid konec sintetiziranih fragmentov DNA, PCR produkti pojavljajo včasih kot dvojne pasovih. Z izjemo Bax
premik okvirja v tumorja 69R, se zdi, da je homozigotna nobena druga mutacija. Vendar pa je s poznavanjem razmerje malignih celic v tumorski vzorcu, ki smo jih že navedli, da je s BLM
mutacija tumorja 69R tudi homozigotna [24].
Bralnega okvira v drugih CDR mikrosateliti in odnosov z BLM bralnega okvira
enako panel MMP + tumorjev smo analizirali tudi prisotnost bralnega okvira v mikrosateliti, ki se nahajajo v kodirnih regijah osmih drugih genov (tabela 2). Ugotovili smo razlike v dolžini zaporedno v TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6
in Bax
genov, vsi smo že poročali, da je treba spremeniti v MMP + GK. Podatki o TGFβ1-RII
statusa za osem (serije P v tabeli 2) od petnajstih tumorjev so že poročali [27]. Opažene frekvence mutacij so bile primerljive s tistimi, o katerih so poročali pri vseh teh genov, z izjemo IGFIIR
, za katere smo ugotovili nizek odstotek bralnega okvira (tabela 2). Zanimivo je, da so bili v primerjavi z BLM
mutacijami na katerih je samo TGFβ1-RII
bralnega okvira pogostejša (60% proti 27%, v tem zaporedju) in Bax
bralnega okvira so bili tudi pogosti (27%). Ti podatki kažejo, da so bralnega okvira v BLM
pogoste spremembe v MMP + GK. Opazili Trend povezavo med mutacijami BLM
in mutacij v BAX
in hMSH3
in /ali hMSH6
(tabela 2) (P = 0,05 pri Fisher točno testu).
smo analizirali tudi RecQL, WRN
in CBL
genov, ki vsebujejo kratke ponavlja v svojih kodiranje regijah. Prva dva gena so člani iste helikaza družini genov kot BLM
[36, 37]. Medtem ko je RecQL
ni povezan z nobenim bolezni pri ljudeh, mutacije v WRN
gena so vzrok za Werner syndrome (WS; OMIM 277.700), redka avtosomno recesivna bolezen klinično značilno, prezgodnje staranje in poveča tveganje za številne neoplazme, in gensko označen s genomske nestabilnosti. CBL
je receptor tirozin kinaze [38], katerega deregulacija je bila povezana z onkogenezo [39]. Ugotovili smo mutacije le na CBL
gena (sl. 1). Dva vzorca (69R in 14P) smo ugotovili, da nosijo vstavljanja 3 bp v trinukleotidno (ATG) 6 ponovitev CBL
gen (podatki niso prikazani). Kot smo že poročali [24], ker se ne premika bralnega okvira proizvodnje, ne funkcionalno posledica mogoče sklepati. Oba mutacije so bile ugotovljene v raka, ki prikazujejo tudi BLM
bralnega okvira (tabela 2). Omeniti je treba, da je ta podskupina tumorjev kažejo statistično značilno presežek MSI v kodiranja regijah v primerjavi z MMP + podskupini brez BLM
sprememb. (P < 0,001, na Χ 2 test) (tabela 2)
Pogovor
Več študij je dokumentirano, da lahko obstajajo alternativne poti v prebavnem MMP + in MMP- raka značilne različne sklope spremenjenih genov [40]. Postopno model mutator mutacij (v nadaljevanju "mutator da mutira drugo mutator") je predlagala, da se opredeli mutator primerjavi s poti za zaviranje v gastrointestinalnih tumorjev [41]. Z analizo časovnega okvira mutacijskih dogodkov v genetsko nestabilnih GK, je bilo predlagano, da so prve tarče pomanjkanja neusklajeno popravilo mononukleotida trakti za TGFβ1-RII
in BAX.
Premikom bralnega okvirja za hMSH3
in hMSH6
zdi, da so sekundarne neusklajenost popravilo poškodbe, ki ustvarjajo mutacije IGFIIR
[42]. Ugotovitev, da premikom bralnega okvirja v TGFβ1-RII
so najpogostejši in IGFIIR
so manj pogoste v želodčnih MMP + tumorjev podpira z modelom, v katerem mora biti prisotna v večini tumorjev in poznih mutacije zgodnjih dogodki le v manjšem deležu [43]. Ta ugotovitev je potrjena tudi v naši raziskavi (tabela 2). BLM
premikom bralnega okvirja pogosteje povezana s prvo in drugo stopnjo sprememb, predlaganih v tem modelu, kar kaže, da so drugotnega pomena neusklajenosti napak popravila (v hMSH3
in /ali hMSH6
) prisoten v celicah, ki ne poteče apoptoza (verjetno kot posledico Bax
inaktivacijo). Omeniti velja, v primeru, 3P, poleg BLM
bili edini bralnega okvira so v BAX (glej
sliko 1) in p53
(podatki niso prikazani) geni, ki kažejo, da v nekaterih primerih, BLM
sprememba se lahko zgodi brez hMSH3
in /ali hMSH6
mutacij, v celicah z nenormalno-p53 posredovana poti od apoptoze odgovor neujemanja DNA.
sodelovanje bLM
v tumorigeneze zunaj bolnikih BS zdi razumljivo, saj se zdi ta gen, da deluje kot hišnik. BLM
mutacije je znano, da povzroča povečano genomske nestabilnosti označen z zvišano število prelomov kromosomskih, vrzeli in prerazporeditve in preveliko število mutacij v obeh kodiranja in nekodirano regijah, verjetno nastal neenakomerno izmenjavo sestra-kromatidnega, značilnost sindroma Bloom [44, 45]. V skladu s tem, BS kaže kombinacija genomske nestabilnosti in povečano tveganje za raka, združenje najdemo tudi pri drugih boleznih, ki jih napak v Hišni genov (kot HNPCC, WS, ataksija, telangiektazije in pigmentne kseroderme) povzročajo. Podobno kot mutacije najdemo v BS, da bralnega okvira so opisane v GK odpravijo funkcijo helikaza za BLM beljakovin [24]. BLM protein ima razreševanje aktivnost dokazano DNA [46] in se lahko vključi v postopke, ki jih moti pri malignih celic, kot so podvajanje DNA, rekombinacije, ločevanje kromosomov, popravilo DNA in prepisovanje. Dejansko je BLM cepitev kvas gene
homolog (radl2
+ /rqhl
+), se je izkazalo za urejanje S-fazni kontrolno točko na in je predlagala, da se celovitost kromosomov par z napredovanju celičnega ciklusa [47, 48]. Vendar pa je ugotovitev BLM
mutacij v MMP + tumorjev ustvarja paradoks: BLM
mutacije predvidoma ustvariti kromosomsko nestabilnost, medtem ko je večina + tumorjev MMP so diploidna. Kljub temu pa nekateri MMP + tumorji so Aneuploiden in BLM
mutacije izpadu funkcije imajo lahko pleiotropični posledice, morda vplivalo tudi mikrosatelitskih nestabilnosti pot je, kot je opis povečano znotraj genskih mutacij v Bloom sindrom [44, 45 predlagal ]. V suppoprt na naš predlog je ugotovitev, da smo ugotovili, da je BLM
mutiral v celični liniji Lovo, celično linijo raka debelega črevesa z obema mikrosatelita in kromosomsko inatability [43]. Veliko več, je bilo pred kratkim poročali, da SGS1
gen, v Saccharomyces cerevisiae
homolog BLM
in WRN
zavira genomsko nestabilnost in homeologous rekombinacijo in je odveč z DNA neusklajeno popravila motornih vozil (MMR) za zatiranje Bruto kromosomske preureditve in za zatiranje rekombinacije med različnih zaporedjih DNK [49].
Sklepi
Naši rezultati kažejo, da so bLM
bralnega okvira pogoste spremembe v GK in so posebej povezana z MMP + tumorji, ki kažejo vsaj 2 nestabilne mikrosateliti.
pojavijo mutacije BLM se pogosto povezuje z bralnega okvira v BAX
in v hMSH6
in /ali hMSH3,
in tumorjev z BLM
spremembe predstavljajo število nestabilnih mono- in trinukleotidnih ponovitev nahaja v kodirnih regij bistveno višje, kot pri MMP + tumorjev brez bLM
bralnega okvira. Predlagamo, da je BLM
izguba funkcije, ki jih MSI v želodčnih tumorjev vmesni mutacijsko dogodek, ki lahko poveča nestabilnost predhodno obstoječe nestabilno genotip.
Metode
bula Vzorci Poslovni
petdeset primarne želodčnih tumorjev in njihove normalne paru tkiva (krvi in ​​normalno želodčne sluznice) so bili izbrani na podlagi razpoložljivih DNK iz plošče 80 želodčnih tumorjev (27, Calin G in Negrini M neobjavljeni podatki). Kadar je to mogoče, so bili izbrani področja tumorskega tkiva z minimalnimi vnetnih celic ali minimalno strome, ali oboje, da dobimo neoplastične celice obremenitev večjo od 50%. Vsi primeri so bili histopathologically opredeljena kot adenokarcinome. Histotype (po klasifikaciji Lauren) [28] in uprizoritev (v skladu s klasifikacijo TNM) [29] je bil znan za 47 od 50 primerov (94%) (tabela 1). Dvaintrideset primerov so bile črevesne histotype in 15 primerov razširjene ali mešanega tipa. Dvajset tumorji so potekali I ali II, medtem ko 27 sta v fazi III ali IV. Glede statusa bezgavk, je bilo osemnajst primerih ni in 29 so N-pozitiven. Nihče od bolnikov je razvil rak že zelo zgodaj, in nobena ni imela družinsko zgodovino sugestivno genetske predispozicije za raka. Visoke DNA molekulsko maso smo izolirali z uporabo uveljavljenih postopkov [30]
Ocena MSI
MSI je pokazala z dvema sklopoma anonimnih markerjev na lokusih. (I) D11S1778, D11S1328, D11S922
in D11S1318
[24] ali (ii) D2S177, D3S1076, D5S433, D11S904, D17S796
in D18S59
[27]. Primerji za te dinukleotid mikrosatelitnih lokusov so bili pridobljeni iz razpoložljivih podatkov prek genoma bazi podatkov. PCR ojačitve so bile izvedene kot je bilo predhodno opisano [24, 27]. Pri vseh vzorcev BAT25
in BAT26
mikrosateliti smo analizirali s PCR, kot je opisano v [31]. MSI je bila ocenjena, če premik mobilnost produktov PCR iz tumorja DNA v primerjavi s ugotovitvi normalno kolega. Samo tumorjev z vsaj 2 MSI (> 30% testiranih mikrosateliti)., So bile obravnavane MMP +
Pomnoževanje mikrosateliti v BLM in drugih kodirajo regije (CDR)
(A) 9 mikrosatelitskih nahaja na položaju 1610- 1618 od bLM
cDNA zaporedja smo analizirali za vse odvisne vzorce. Na kratko smo mikrosatelitni pomnožili s PCR z uporabo 50 ng matrične DNA, 1 um vsakega temeljnega premaza, 1,5 mM MgC12, 50 um vsakega od dATP, dGTP in dTTP in 5,0 um dCTP, 0,1 enoto polimerazo Taq DNA, in 1 μCi [α33P] dCTP v 10 ul od reakcijskega volumna. PCR reakcije smo izvedli za en cikel 94 ° C za 5 minut, čemur sledi 35 ciklov 94 ° C za 30 sekund, 60 ° C za 30 sekund in 72 ° C za 30 sekund. PCR izdelki iz tumorja in ustreznimi kontrolnimi DNA so bili naloženi na vzporedno na 6% akrilamida zaporedja geli in izpostavljena za vizualizacijo z avtoradiografijo na Kodak X-AR filmov. Odkrivanje mutacij v mikrosateliti, ki se nahajajo v KOP iz osmih drugih genov ((A) 10 v TGFβ1-RII
je (G) 8 v IGFIIR,
je (G) 8 v BAX,
(A), 8 v hMSH3,
(C) 8 v hMSH6,
je (A) 9 v RecQL,
je (A) 8 v WRN,
in (ATG) 6, CBL
) je bilo izvedeno kot je opisano predhodno [14, 16, 17, 24, 32]. Pri preverjanju je vsak PCR ponoviti vsaj dvakrat. Mutiran alel je predstavljal premik pasu od 1 do 3 bp iz normalnega pasu z intenzivnostjo primerljivo ali večja kot je divjega tipa pasu (sl. 1).
Sekvenciranje nenormalnih izdelkov
Genomska DNA fragmente kažejo pasu premiki so bili ponovno pomnožili pod enakimi pogoji, razen za opustitev oznako dCTP. Pred sekvenciranje so bili PCR produkti očistimo bodisi neposredno ali po ločitvi v 2% agaroznem gelu z uporabo Qiagen prečiščevanja kompletov. Oba trakova DNK so sekvenco s pomočjo PCR, in avtomatiziran Applied Biosystem 377 zaporedja postajo. Nukleotidna zaporedja, ki so bili analizirani s pomočjo Wisconsin (GCG) Program paket različico Unix-8.1.
Statistična analiza
Statistična analiza rezultatov je bila izvedena s pomočjo Χ testno 2 ali Fisherjev natančni test. AP
vrednost. ≪ 0.05 smo imeli statistično značilno
deklaracij
Potrditev
Ta dela je podprta s sredstvi iz Associazione Italiana per la ricerca sul Cancro (AIRC) in delno iz pogodbe ES Biomed BMH4-CT95-0914. GC je bila podprta z IARC raziskovalno usposabljanje Fellowship.
Avtorjev originalnih predloženi datoteke za slike
Spodaj so povezave do avtorjev prvotna predloženih spisov za slike. 12863_2001_18_MOESM1_ESM.png izvirno datoteko avtorjev na sliki 1

• Trebuhu migrena pri otrocih: povezava med želodca parametre gibljivosti in kliničnih značilnosti
• Anti-ulkusnih aktivnost ekstrakta korenski lubja afriškega negnoj "Cassia sieberiana" in njen vpliv na obrambni sistem antioksidant pri podganah