Соматические мутации в сдвигом рамки гена BLM синдром Блума часто встречаются в спорадических желудочных карцином с микросателлитная мутаторный фенотипа

Соматические мутации в сдвигом рамки цветения Синдром BLM
гена часто встречаются в спорадических желудочных карцином с микросателлитная мутаторный фенотипа
Аннотация
Фон
геномных нестабильности сообщается на микросателлитных трактов в нескольких кодирующих последовательностей. Мы показали, что расцветом Синдром BLM
ген может быть мишенью microsatelliteinstability (MSI) в коротком поли-аденин повтор, расположенный в его кодирующей области. Для дальнейшей характеристики участия BLM
в онкогенеза, мы исследовали мутации в девяти генов, содержащих кодирующие микроспутников в микросателлитная мутаторный фенотипа (ММР) положительные и отрицательные желудочных карцином (ГКС).
Методы
Мы проанализировали 50 желудка карцином (ГКС) для мутаций в BLM
Aswell поли (а) тракта, как в микроспутников кодирующих TGF 1-РИИ, IGFIIR, hMSH3, hMSH6, BAX, WRN, RECQL
и CBL
генов.
Результаты
BLM
мутации были обнаружены у 27% ММР + ГКС (4/15 случаев), но ни в одном из негативных ШС ММР (0/35 случаев). Частота мутаций в других восьми кодирующих областей микроспутника был следующим: TGF 1-РИИ
(60%), Вах
(27%), hMSH6
(20%), hMSH3
(13 %), CBL
(13%), IGFIIR
(7%), RECQL
(0%) и ПРПЖД
(0%). Мутации в BLM
по всей видимости, чаще ассоциируется с БАКСА в рамки считывания
и в hMSH6
и /или hMSH3.
Опухоли с BLM
изменения представляют более высокую частоту нестабильного моно- и тринуклеотида повторы, расположенные в области кодирования по сравнению с мутаторного фенотипа опухолей без BLM
.
рамки считывания Выводы
BLM
рамки считывания частые изменения в ШС конкретно связанные с ММР + опухолей. Мы полагаем, что BLM
потеря функции от MSI может увеличить генетическую нестабильность в предсуществующем нестабильного генотипа в опухолях желудка.
Фона
Рак является прогрессивным генетическое заболевание характеризуется прогрессирующим накоплением мутаций в обоих кодирования и некодирующие последовательности [1]. Простая последовательность повторяется или микроспутников очень нестабильны в некоторых человеческих опухолей, определение класса опухолей с микросателлитная мутаторный фенотипа (ММР +) (для обзора см [2]). ММР + ве статус определяется нестабильностью в более чем 30% микроспутников Проанализированы, в том числе, по меньшей мере один мононуклеотида (например, BAT26 или BAT25) [3]. Микросателлитная нестабильность (MSI) была описана как часто генетические изменения в различных солидных опухолях человека, включая спорадических и семейных желудочных карцином (ГКС). Почти у всех пациентов с наследственной раком ободочной и прямой неполипозным (HNPCC), молекулярные исследования показали, что MSI вызвано зародышевых мутации в генах, кодирующих белки, необходимые для рассогласование репарации ДНК (MMR) [4]. Гены, такие как hMSH2, hMLH1, PMS1, PMS2
и hMSH6 /GTBP
[5-8], были определены как «смотрителей», потому что, когда нарушается, они выступают за приобретение мутаций на высокой частоте в течение нескольких генов, включая онкогены и гены-супрессоры опухолей [9]. Тем не менее, в значительной части спорадического ММР + опухолей, анализ мутаций не позволил идентифицировать гены, ответственные за MSI [2, 10], предполагая, что в таких случаях, MSI может быть вызвана эпигенетическими механизмами. На самом деле, ген глушителей промоутер гиперметилированием недавно было показано для hMLH1
гена [11-13].
Значимость MSI в онкогенеза было поддержано демонстрацией того, что генетическая нестабильность, характеризующая ММР + рака желудочно-кишечного тракта могут предназначаться коротким повторяющиеся тракты в пределах кодирующей области генов, имеющих важное значение для выживания и пролиферации клеток. Вставки /удаления мутации были обнаружены в генах, для II рецептора трансформирующего фактора роста-бета (TGF 1 типа-РИИ
), рецептор инсулиноподобного фактора роста типа II (IGFIIR
), ДНК генов рассогласование-ремонт hMSH3
и hMSH6,
проапоптотический ген BAX
и фактора транскрипции E2F-4
[14-18]. Во всех случаях, за исключением E2F-4,
Нуклеотиды вставки /удаления приводит к мутации со сдвигом рамки и белка усечением. Хотя биологическое значение этих изменений не полностью установлено, было предложено, что отсутствие рецепторов TGF 1-РИИ с поверхности желудочно-кишечного тракта эпителиальных клеток может исключить отрицательный контроль роста TGF-бета, что приводит к неконтролируемым ростом клеток [19]. IGFIIR играет определенную роль в подавлении роста путем связывания и активации комплекса рецептор TGF 1 и по посреднической интернализации, с последующей деградации, фактора роста IGF-II [20, 21]. БАКСА
стимулирует апоптоз и сообщалось, что Вах
инактивация приводит к быстрому росту опухоли [22]. Человеческие гены hMSH3
и hMSH6
гомологичные бактериальной Muts
ген, продукты которого связывают несовпадения ДНК, чтобы инициировать нити конкретных исправление ошибок репликации ДНК [23]. Соматические и зародышевые мутации в hMSH6
были связаны с спорадических ММР + колоректальных карцином и HNPCC [6].
Мы обнаружили ранее, что BLM
ген также может быть целью MSI [24]. В рамки считывания, найденные в коротком поли-аденин повтора, были предсказаны, чтобы сформировать усеченный и нефункциональные BLM белка. Гомозиготным или сложные гетерозиготные мутации в гене BLM
было показано, что причиной синдрома Блума (BS; OMIM 210900), предварительно злокачественное состояние, характеризующееся хромосомной нестабильности и повышенной мутационной скорости. пациенты BS предрасположены к широкому кругу neoplams диагностированных в раннем возрасте. Обращает на себя внимание, в том числе 100 зарегистрированных новообразований в реестре BS, 19 были желудочно-кишечного тракта (пищевода, желудка и толстой кишки) и только два были диагностированы после того, как в возрасте 40 лет [25]. Эти данные указывают на то, что мутации в гене BLM
может способствовать туморогенез
Чтобы лучше определить роль BLM
в желудочно-онкогенеза мы экранированного панель ММР + и MMP- желудочных карцином (ГКС) для:. А) рамки считывания в BLM
кодирующей области микроспутника и б) для возможных ассоциаций с другими внутригенных.
рамки считывания Результаты
MSI Статус
для настоящего исследования, наша панель 50 ШС содержит 15 ММР + опухоли с MSI на два или более локусов (таблица 2) и 35 ШС MMP- с изменением в одном микросателлитных (4 опухоли) или без MSI (31 опухолей). Все MMP + случаи были BAT 26 положительными, и BAT 25 неустойчивость была обнаружена в 13 из 15 случаев (за исключением случаев 67R и 27P). Клинико-патологические особенности MMP + опухолей описаны в таблице 1. ММР + фенотип тесно связан со стадией низкой pTNM и с менее распространенными метастазов в лимфоузлы (р = 0,02 и р = 0,001 при точный критерий Фишера, соответственно, по сравнению
MMP-опухоли). В группе ММР +, избыток опухолей на ранних стадиях и без метастазов в лимфатических узлах был обнаружен (10/15 случаи vs. 10/32 случаи MMP- случаев, р = 0,02 и 11/15 случаев vs. 7/32 случаев MMP- случаев, р = 0,001, соответственно), данные, которые поддерживают предложенный лучше прогностическим ГКС MMP + [33, 34]. Следует отметить, что никакого избытка кишечного типа среди ММР + опухолей не было обнаружено (12/15 случаев против
20/32 из MMP- случаев) (таблица 1), данные в соответствии с последними исследованиями не показывая никаких существенных различий в частоте MSI в кишечном типа и диффузного типа карцином [26, 35] .table 1 Histotype и постановка параметров, связанных с фенотипа ММР в нашем GCsa
Переменная

количество пациентов

P

VALUE млрд Всего (%)
MMP + (%)
ММР - (%)
Histotype
<кишечной BR> 32 (68,0) 12
(37.5)
20 (62,5)
Диффузный + Mixed
15 (32,0)
3 (20,0)
12 (80,0)
NSC
T (глубина проникновения стенки)
T1 + T2
12 (25.5)
6 (50,0)
6 (50,0)
T3 + T4
35 (74,5 )
9 (25,7)
26 (74,3)
NS
N (состояние лимфатических узлов)
N0
18 (38,3)
11 (78,5)
7 (21.5)
N +
29 (61,7)
4 (12.1)
25 (87,9) = 0,001

M (метастазирование)
M0
40 (85,1 )
14 (35,0) 26
(65,0)
М +
7 (14,9)
1 (14.2)
6 (85,8) NS

Поэтапное <бр> I + II
20 (42,5) 10
(58,8)
10 (41,2)
III + IV
27 (57,5)
5 (16.6)
22 ( 83,4)
= 0.02
тотала
47
15
32
а - данные были доступны для 47 из 50 случаев б - в точный критерий Фишера с - NS = не является статистически значимым
Таблица 2 Статус микроспутников кодирования в пределах BLM, ПРПЖД, RECQL, CBL, hMSH6, hMSH3, IGFIIR, TGF-βRII
и Вах
гены в серии желудочных карцином с микросателлитная мутаторный фенотипа.
Case

Histotypea

Stagingb


BLM

WRN

REQL

CBL

hMSH6

hMSH3

IGFIIR

TGF-βRII

BAX

No.


<й>
MSIc

(A)9

(A)8

(A)9

(ATG)6

(C)8

(A)8

(G)8

(A)10

(G)8

31R
I
I(T2N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
57R
I
IV(T3N1M1)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
63R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
+
-
-
+
+
67R
I
I(T2N0M0)
4/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
69R
D
II(T3N0M0)
4/5
+
-
-
+
+
+
-
+
+
79R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3P
I
II(T3N0M0)
4/7
+
-
-
-
-
-
-
-
+
11P
I
III(T3N1M0)
3/7
+
-
-
-
-
+
+
+
-
14P
M
II(T3N0M0)
6/7
+
-
-
+
+
-
-
+
+
17P
I
II(T3N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
19P
D
III(T3N1M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
27P
I
IV(T4N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
30P
I
I(T2N0M0)
3/6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
37P
I
I(T2N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
38P
I
III(T3N2M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
%
present исследование (количество случаев)
27%
0% 0%

13%
20%
13%
7%
60%
27 %
мутации
(4/15)
(0/15)
(0/15)
(2/15)
(3/15)
(2 /15)
(1/15)
(9/15)
(4/15)
упоминался в литературе (в ШС) г
-
- Форум -
-
22-52%
19-64%
19-24%
42-83%
15-64%
а - I = типа кишечника; D = диффузный тип; M = смешанный тип б - в соответствии с классификацией TNM (Собина и Wittekind, 1997) с - числа нестабильных /всего испытания микроспутников d - данные, собранные из ссылок: [17,27,42,50,51,52] <Ьг> BLM
рамки считывания ПЦР-амплификации BLM
микроспутнике выявили аномальные полосы, отсутствующие в нормальных совпавших ДНК, в 4 из 15 ММР + опухолей (27%) (рис. 1). Мы подтвердили с помощью секвенирования, что аномальные полосы вызваны делецией одного аденин остатка в поли-аденин-кишечного тракта (сокращение от девяти до восьми аденинов), как было показано ранее [24]. Частота мутаций в BLM
может быть низкая оценка, потому что мы исключили случаи, в которых аномальные полосы в опухолевых ДНК были заметно слабее, чем нормальные, возможно, вследствие большого загрязнения опухоли с доброкачественных клеток или низкого часть злокачественных клеток, воспроизводящих ненормальность (рис. 1). Поскольку ни BLM мутации
не был замечен в MMP- опухоли, мутации в сдвигом рамки БЛМ
гена по всей видимости, в частности, связано с желудочным ММР + опухолей (вероятность P < 0,01 при точный критерий Фишера), аналогично предыдущему хорошо документированные изменения в TGF 1-РИИ, IGFIIR, hMSH3, hMSH6
и Вах
генов [14, 16, 17, 32]. Таким образом, наши данные расширить репертуар измененных генов, ассоциированных с ММР + желудочных карцином. Рисунок 1 Характерные примеры мутаций, обнаруженных в микроспутников в гене, кодирующем регионах. Номера случая показаны друг над соответствие нормальным (N) и опухоли (Т) пар ДНК. Стрелки указывают на аномальные полосы. Обратите внимание, что мы не рассматривали мутированные образцы, где аномальные полосы были очень слабыми (например, в BLM
и Вах
генов опухоли образца 30P). Из-за тенденции Taq-полимеразой, чтобы добавить дополнительный нуклеотид в конце синтезированных фрагментов ДНК, ПЦР-продукты появляются иногда в виде двойных полос. За исключением Bax
рамки считывания в опухоли 69R, никакая другая мутация не появится гомозиготным. Тем не менее, зная соотношение количества злокачественных клеток в образце опухоли, ранее мы показали, что BLM
мутации в опухоли 69R также гомозиготными [24].
Рамки считывания в других CDRs микроспутников и отношения с BLM
рамки считывания Та же панель ММР + опухолей также анализировали на наличие в рамки считывания микросателлитов, расположенных в кодирующих областях восьми других генов (таблица 2). Мы обнаружили изменение длины последовательности в TGF 1-РИИ, IGFIIR, hMSH3, hMSH6
и Вах
генов, все ранее сообщалось, может быть изменен в ММР + ШС. Данные о TGF 1-РИИ
статуса в течение восьми (P серии в таблице 2) из ​​пятнадцати опухолей сообщалось ранее [27]. Наблюдаемые частоты мутаций, были сопоставимы с теми, ранее сообщалось, для всех этих генов, за исключением IGFIIR,
для которых мы нашли низкий процент (рамки считывания таблица 2). Интересно отметить, что по сравнению с BLM
мутаций, только TGF 1-РИИ
рамки считывания были более частыми (60% против 27%, соответственно) и Вах
были рамки считывания также часто (27%). Эти данные свидетельствуют о том, что в рамки считывания BLM
общие изменения в ММР + ШС. наблюдалась тенденция к ассоциации между мутациями в BLM
и мутаций в БАКСА
и hMSH3
и /или hMSH6
(Таблица 2) (P = 0,05 при точный критерий Фишера).
Мы также проанализировали RecQL, WRN
и CBL
гены, которые содержат короткие повторы в их кодирующих областях. Первые два гена являются членами одного и того же геликазной семейства генов как BLM
[36, 37]. В то время как RecQL
не связан с какой-либо болезни человека, мутации в гене WRN
являются причиной синдрома Вернера (WS; OMIM 277700), редкое аутосомно-рецессивное заболевание, клинически характеризуется преждевременным старением и повышенный риск для различных новообразований, и генетически характеризуется геномной нестабильности. CBL
является тирозин-киназы рецептора [38], которого дерегулирование была связана с онкогенеза [39]. Мы обнаружили мутации только в гене CBL
(рис. 1). были найдены два образца (69R и 14P) осуществлять вставку 3 н.п. в тринуклеотида (ATG) 6 повторение CBL
гена (данные не показаны). Как мы уже сообщали ранее [24], поскольку ни одна не рамки считывания производится, никаких функциональных последствий не может быть выведено. Обе мутации были обнаружены в раковых заболеваний, отображающих также BLM
рамки считывания (таблица 2). Следует отметить, что это подмножество опухолей показывают статистически значимое превышение MSI в кодирующих областях по сравнению с ММР + подмножестве без BLM
изменений. (P &ЛТ; 0,001, при Х 2 тест) (Таблица 2)
Обсуждение
Ряд исследований документально подтверждено, что альтернативные пути могут существовать в желудочно-MMP + и MMP- рака, характеризующиеся различными наборами измененных генов [40]. Постепенное модель мутаторов мутаций (далее "мутаторного, что мутирует другой мутатор") было предложено определить мутатор по сравнению с супрессоров путей в желудочно-кишечных опухолей [41]. Анализируя сроки мутационных событий в генетически нестабильную ШС, было предложено, чтобы первые цели несоответствия ремонта дефицита являются мононуклеотидных участки TGF 1-РИИ
и Вах.
Мутации сдвига рамки hMSH3
и hMSH6
кажутся вторичными по ремонту рассогласование поражений, которые генерируют мутации в IGFIIR
[42]. Обнаружение того, что мутации в сдвигом рамки TGF 1-РИИ
являются наиболее частыми и IGFIIR
являются менее частыми в желудочном ММР + опухолей поддерживает модели, в которой ранние события должны присутствовать в большинстве опухолей и поздних мутаций только в незначительной фракции [43]. Этот вывод также подтверждается в нашем исследовании (таблица 2). BLM
мутации со сдвигом рамки связаны чаще с первого и второго этапа изменений, предложенных в этой модели, предполагая, что они являются вторичными по отношению к соответствую ремонта дефектов (в hMSH3
и /или hMSH6
) присутствует в клетках, которые не подвергаются апоптозу (возможно, в результате Вах
инактивация). Обращает на себя внимание, в случае 3P, в дополнение к BLM,
единственные рамки считывания были найдены в BAX (см
рисунок 1) и p53
(данные не показаны) гены, предполагая, что в некоторых случаях, BLM
изменение может происходить без hMSH3
и /или hMSH6
мутаций в клетках с аномальной p53-опосредованного пути апоптоза ответ на несовпадение ДНК.
вовлечение BLM
в онкогенеза вне пациентов BS кажется возможно, так как этот ген-видимому, действует в качестве сторожа. BLM
мутации как известно, вызывают повышенную нестабильность генома характеризуется повышенным количеством хромосомных разрывов, пробелов и перестроек и чрезмерным количеством мутаций в обоих кодирующих и некодирующих регионах, вероятно, возникла неравным сестра хроматид обмена, характерной особенностью синдрома Блума [44, 45]. Соответственно, BS демонстрирует сочетание нестабильности генома и повышенным риском развития рака, ассоциация нашли также в других заболеваний, вызванных дефектами в генах смотрителя (таких как HNPCC, WS, атаксии-телеангиэктазии и ксеродермией пигментная). По аналогии с мутациями, обнаруженных в БС, то рамки считывания, описанные в ШС отменить функцию хеликазную от BLM белка [24]. BLM белок обладает активностью разматывания доказанный ДНК [46] и могут быть вовлечены в процессы, которые возмущенных в злокачественных клетках, таких как репликация ДНК, рекомбинации хромосом, репарации ДНК и транскрипции. Действительно, ген делящихся дрожжей BLM
гомолога (radl2
+ /rqhl
+) было показано, регулирует S-фазы контрольной точки и было предложено целостности хромосомной пары с клеточного цикла [47, 48]. Тем не менее, нахождение BLM
мутаций в ММР + опухолей порождает парадокс: BLM
мутации предсказаны для генерирования хромосомной нестабильности в то время как большинство опухолей + ММР диплоидны. Тем не менее, некоторые MMP + опухоли являются анеуплоидными и BLM
с потерей функции мутации могут иметь плейотропных последствия, возможно, затрагивая также микроспутника неустойчивости пути, как это было предложено описание увеличенного мутаций внутри гена при синдроме Блума [44, 45 ]. В suppoprt к нашему предложению является вывод о том, что мы обнаружили, что BLM
мутирует в клеточной линии LoVo, линии клеток рака толстой кишки как с микроспутника и хромосомной inatability [43]. Гораздо больше, это недавно было сообщено, что SGS1
ген, в Saccharomyces CEREVISIAE
гомолог BLM
и WRN,
подавляет нестабильность генома и гомеологичных рекомбинации и является избыточным с ремонтом несовпадения ДНК (MMR) для подавления валовому хромосомных перестроек и для подавления рекомбинации между расходящихся последовательностей ДНК [49].
Выводы
Наши результаты показывают, что BLM
рамки считывания частые изменения в ШС и конкретно связаны с ММР + опухолями, отображающих, по меньшей мере 2 нестабильных микроспутников. Мутации в BLM
по всей видимости, часто ассоциируется с БАКСА в рамки считывания
и в hMSH6
и /или hMSH3,
и опухолей с BLM
изменения представляют ряд нестабильных моно- и тринуклеотидных повторами расположенный в области кодирования значительно выше, чем это наблюдалось в ММР + опухолей без BLM
рамки считывания. Мы полагаем, что BLM
потеря функции от MSI в опухолях желудка является промежуточным мутационный событием, которое может увеличить неустойчивость предсуществующем нестабильного генотипа.
Методы
Опухолевые Образцы
Пятьдесят первичные опухоли желудка и их нормальные парные ткани (кровь или нормальной слизистой оболочки желудка) были отобраны на основе имеющейся ДНК из панели 80 опухоли желудка (27, Калин G и Negrini M неопубликованные данные). Когда это возможно, области опухолевой ткани с минимальными воспалительными клетками или минимальной стромы, или оба, были выбраны для получения опухолевого Тензодатчика более чем на 50%. Все случаи были идентифицированы гистологически, как аденокарциномы. Histotype (в соответствии с классификацией Лорен) [28] и постановка (в соответствии с классификацией TNM) [29] был известен 47 из 50 случаев (94%) (таблица 1). Тридцать два случая были кишечной histotype и 15 случаев диффузного или смешанного типа. Двадцать опухолей были поставлены I или II, в то время как 27 были в стадии III или IV. Что касается состояния лимфатических узлов, восемнадцать случаев было NO и 29 были N-положительными. Ни один из пациентов не развился рак в раннем возрасте, и никто не имел семейную историю, напоминающих генетическую предрасположенность к раку. ДНК с высоким молекулярным весом выделяли с использованием установленных процедур [30]
Оценка MSI
MSI была выявлена ​​с двумя наборами анонимных маркеров в локусах:. (Я) D11S1778, D11S1328, D11S922
и D11S1318
[24] или (II) D2S177, D3S1076, D5S433, D11S904, D17S796
и D18S59
[27]. Праймеры для этих динуклеотидную микросателлитных локусов были получены из информации, доступной через базу данных генома. ПЦР-амплификацию проводили, как описано ранее [24, 27]. Для всех образцов BAT25
и BAT26
микросателлитами анализировали с помощью ПЦР-амплификации, как описано [31]. MSI оценивали, если подвижность сдвиг продуктов ПЦР с опухолевой ДНК по сравнению с нормальным аналогом был идентифицирован. Только опухоли, по меньшей мере, 2 MSI (> 30% тестируемых микроспутников). Были рассмотрены ММР +
Усиление микроспутников в BLM и в других регионах кодирования (CDR)
(А) 9 микроспутник находится в положении 1610- 1618 БЛМ
последовательности кДНК анализировали для всех парных образцов. В кратком изложении, микросателлитная амплифицировали с помощью ПЦР с использованием 50 нг матричной ДНК, 1 мкМ каждого праймера, 1,5 мМ MgC12, 50 мкМ каждого из дАТФ, дГТФ и дТТФ и 5,0 мкМ дЦТФ, 0,1 единицы Taq-ДНК-полимеразы, и 1 мкКи [α33P] дЦТФ в 10 мкл реакционного объема. Реакции ПЦР проводили в течение одного цикла при 94 ° С в течение 5 мин с последующими 35 циклами при 94 ° С в течение 30 с, 60 ° С в течение 30 с и 72 ° С в течение 30 с. ПЦР-продукты от опухоли и соответствующих контрольных ДНК были загружены на параллельно на 6% акриламид секвенирования гелей и экспонировали для визуализации с помощью авторадиографии на Kodak X-AR фильмов. Обнаружение мутаций в микроспутников, расположенных в CDR, из восьми других генов ((А) 10 в TGF 1-РИИ,
(G) в 8 в IGFIIR,
в (G) в BAX 8,
(A) 8 в hMSH3,
(с) 8 в hMSH6,
(а) 9 в RecQL,
(а) 8 в WRN,
и (ATG) 6 в CBL
) было сделано, как описано ранее [14, 16, 17, 24, 32]. Для проверки, каждый ПЦР повторяли по крайней мере дважды. Мутированный аллель был представлен сдвиг полосы от 1 до 3 пар оснований от нормального диапазона с интенсивностью, сравнимой или большей, чем у дикого типа полосы (рис. 1).
Секвенирование аномальных продуктов
Геномные фрагменты ДНК, проявляющие сдвиги полосы были реамплифицировали при тех же условиях, за исключением отсутствия меченого дЦТФ за исключением. Перед секвенирования ПЦР-продукты очищали либо непосредственно, либо после разделения в агарозном геле 2%, с использованием Qiagen комплекты для очистки. Обе нити ДНК секвенировали с использованием ПЦР-праймеров и автоматизированной Applied биосистем 377 секвенирования станции. Нуклеотидные последовательности были проанализированы с помощью Wisconsin (GCG) программного пакета версии Unix-8.1. Статистический анализ

Статистический анализ результатов проводили с использованием Х 2 тестовый или точный критерий Фишера. AP
значение &л;. 0,05 считали статистически значимыми
декларациях
Выражение признательности
Эта работа была поддержана грантами от Associazione Italiana в Ла-суль-Ricerca (AIRC Рак) и частично из договора ЕС BIOMED BMH4-CT95-0914. GC была поддержана IARC Research Training Fellowship.
Авторов оригинальные представленные файлы для изображений изображения Ниже приведены ссылки на авторов оригинала, представленных файлов для изображений. 12863_2001_18_MOESM1_ESM.png исходный файл Авторского на рисунке 1

• Брюшной мигрени у детей: связь между параметрами желудка моторики и клиническая characteristics
• Анти-ульцерогенное активность корня экстракта коры африканского Laburnum "Кассия sieberiana" и его влияние на систему…