frameshift mutazioni somatiche nel gene sindrome BLM Bloom sono frequenti nei carcinomi gastrici sporadici con microsatelliti mutator fenotipo

frameshift mutazioni somatiche nel Bloom sindrome BLM
gene sono frequenti nei carcinomi gastrici sporadici con microsatelliti mutator fenotipo
Abstract
sfondo
instabilità genomica stato segnalato a tratti microsatellite in poche sequenze codificanti. Abbiamo dimostrato che il Bloom sindrome BLM
gene può essere un obiettivo di microsatelliteinstability (MSI) in un breve repeat poli-adenina trova nella regione codificante. Per caratterizzare ulteriormente il coinvolgimento di
BLM nella tumorigenesi, abbiamo studiato le mutazioni in nove geni che contengono microsatelliti codifica in microsatellite mutator fenotipo (MMP) carcinomi gastrici positivi e negativi (GC).
Metodi
abbiamo analizzato 50 gastrico carcinomi (GCS) per mutazioni nel BLM
aswell poli (a) del tratto come nei microsatelliti codificanti del TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6, BAX, WRN, RECQL
e CBL
geni.
Risultati
BLM
mutazioni sono state trovate nel 27% dei MMP + GC (4/15 casi), ma non in nessuno dei GC negativi MMP (0/35 casi). La frequenza delle mutazioni in altri otto regioni codificanti microsatellite è stato il seguente: TGFβ1-RII
(60%), BAX
(27%), hMSH6
(20%), hMSH3
(13 %), CBL
(13%), IGFIIR
(7%), RECQL
(0%) e WRN
(0%). Le mutazioni in BLM
sembrano essere più frequentemente associata a frameshifts in BAX
e in hMSH6
e /o hMSH3.
Tumori con BLM
alterazioni presentare una più alta frequenza di mono- instabile e trinucleotide ripete situate in regioni codificanti rispetto ai tumori mutator fenotipo senza BLM
frameshifts.
Conclusioni
BLM
frameshifts sono alterazioni frequenti GC specificamente connessi con MMP + tumori. Suggeriamo che BLM
perdita di funzione da MSI può aumentare l'instabilità genetica di un genotipo instabile preesistente nei tumori gastrici.
Sfondo
Il cancro è una malattia genetica progressiva caratterizzata da progressivo accumulo di mutazioni in entrambe codifica e sequenze non codificanti [1]. Semplice sequenza si ripete o microsatelliti sono altamente instabili in alcune neoplasie umane, individuando una classe di tumori con il microsatellite mutator fenotipo (MMP +) (per recensione vedi [2]). MMP + ve stato è definita da instabilità in più del 30% di microsatelliti analised, includente almeno un mononucleotide (come BAT26 o BAT25) [3]. instabilità dei microsatelliti (MSI) è stata descritta come una alterazione genetica frequente in diversi tumori solidi umani, tra cui carcinomi gastrici sporadici e familiari (GCS). In quasi tutti i pazienti con tumore ereditario non associato a poliposi del colon-retto (HNPCC), studi molecolari hanno dimostrato che MSI è causata da mutazioni germinali nei geni che codificano le proteine ​​necessarie per la mancata corrispondenza di riparazione del DNA (MMR) [4]. I geni, come hMSH2, hMLH1, PMS1, PMS2
e hMSH6 /GTBP
[5-8], sono stati definiti come "custodi", perché, quando perturbato, favoriscono l'acquisizione di mutazioni ad alta frequenza in diversi geni, tra cui oncogeni e oncosoppressori [9]. Tuttavia, in una frazione significativa di sporadica MMP + tumori, analisi di mutazione non ha permesso l'identificazione dei geni responsabili per MSI [2, 10], suggerendo che, in tali casi, MSI potrebbe essere causato da meccanismi epigenetici. Infatti, silenziamento genico dal promotore ipermetilazione stato recentemente dimostrato per il hMLH1
gene [11-13].
Il significato di MSI nella tumorigenesi è stato sostenuto dalla dimostrazione che l'instabilità genetica che caratterizza MMP + tumori gastrointestinali può obiettivo a breve tratti ripetitivi all'interno della regione codificante di geni importanti per la sopravvivenza e la proliferazione cellulare. Inserzione /delezione mutazioni sono state trovate nei geni per la crescita trasformante-beta tipo fattore II receptor (TGFβ1-RII
), il recettore insulino-simile di tipo growth factor II (IGFIIR
), il DNA mancata corrispondenza di riparazione dei geni hMSH3
e hMSH6,
il proapoptotica gene BAX
e il fattore di trascrizione E2F-4
[14-18]. In tutti i casi, con l'eccezione del E2F-4,
l'inserimento nucleotidi /delezione provocato mutazioni frameshift e troncamento proteine. Sebbene il significato biologico di queste alterazioni non è completamente stabilito, è stato proposto che l'assenza di recettori TGFβ1-RII dalla superficie delle cellule epiteliali gastrointestinali potrebbe eliminare il controllo della crescita negativo del TGF-β, che porta alla crescita incontrollata delle cellule [19]. IGFIIR ha un ruolo nella soppressione della crescita legandosi ed attivando il complesso recettoriale TGFβ1 e mediando internalizzazione, con successiva degradazione, del fattore di crescita IGF-II [20, 21]. BAX
promuove l'apoptosi ed è stato riferito che BAX
inattivazione porta alla crescita tumorale rapida [22]. I geni umani hMSH3
e hMSH6 Quali sono omologo al MutS batteriche
gene la cui prodotti legarsi mismatch del DNA per avviare la riparazione specifici per ciocca di errori di replicazione del DNA [23]. Somatiche e germinali mutazioni in hMSH6
sono stati associati con sporadici MMP + carcinomi colorettali e HNPCC [6].
Abbiamo trovato in precedenza che la BLM
gene può anche essere un obiettivo di MSI [24]. I frameshifts, che si trova in un breve ripetizione poli-adenina, sono stati previsti per generare una proteina BLM troncata e non funzionale. mutazioni omozigoti o eterozigoti composte al BLM
gene hanno dimostrato di causare la sindrome di Bloom (BS; OMIM 210.900), una condizione pre-maligna caratterizzata da instabilità cromosomica e aumento della frequenza di mutazione. pazienti BS sono predisposti a una vasta gamma di neoplams diagnosticati in età precoce. Degno di nota, tra i 100 neoplasie registrate nel Registro di BS, 19 erano gastrointestinale (esofago, stomaco e colon) e solo due sono stati diagnosticati dopo i 40 anni [25]. Questi dati indicano che mutazioni nel gene BLM
possono promuovere tumorigenesi
Per definire meglio il ruolo di
BLM nella tumorigenesi gastrointestinale abbiamo proiettato un panel di MMP + e carcinomi gastrici MMP- (GC) per: a.) frameshifts della BLM
regione codificante microsatellite e b) per le eventuali associazioni con altre frameshifts intragenica
. Risultati
MSI stato
per il presente studio, il nostro gruppo di 50 CV contiene 15 MMP + tumori con MSI a due o più loci (Tabella 2) e 35 GC MMP- con alterazione ad un microsatellite (4 tumori) o senza MSI (31 tumori). Tutti i + casi MMP erano BAT 26 positivi, e BAT 25 instabilità è stato trovato in 13 su 15 casi (ad eccezione di casi 67R e 27P). Le caratteristiche clinico-patologiche di MMP + tumori sono descritti nella tabella 1. Il fenotipo MMP + è stato strettamente associato con un palco basso pTNM e con meno diffuse metastasi linfonodali (p = 0,02 ep = 0.001 al test esatto di Fisher, rispettivamente, contro
MMP-tumori). All'interno del gruppo MMP +, un eccesso di tumori in fasi iniziali e senza metastasi linfonodali è stato trovato (10/15 casi vs 10/32 casi di MMP- casi, p = 0,02 e 11/15 casi vs 7/32 casi di casi MMP-, p = 0.001, rispettivamente), i dati che supportano la migliore proposta prognostico di GC MMP + [33, 34]. Di nota, è stato trovato nessun eccesso di tipo intestinale tra MMP + tumori (12/15 casi vs.
20/32 di MMP- casi) (Tabella 1), i dati in accordo con gli studi recenti mostrano alcuna differenza significativa nella frequenza di MSI in intestinale-tipo e diffondere tipo carcinomi [26, 35] .table 1 istotipo e stadiazione parametri associati con il fenotipo MMP nel nostro GCsa
variabile
il numero delle camere pazienti
P valoreB
totale (%)
MMP + (%)
MMP - (%)
istotipo
intestinale
32 (68,0)
12 (37,5)
20 (62,5)
Diffuse +
Mixed 15 (32,0) Pagina 3 (20,0)
12 (80,0)
NSc
T (profondità di infiltrazione della parete)
T1 + T2
12 (25,5)
6 (50,0)
6 (50,0)
T3 + T4
35 (74,5 )
9 (25,7)
26 (74,3)
NS
N (linfa stato del nodo)
N0
18 (38,3)
11 (78,5)
7 (21,5)
N +
29 (61,7) Pagina 4 (12,1)
25 (87,9)
= 0,001
M (metastasi)
M0
40 (85.1 )
14 (35,0)
26 (65,0)
M +
7 (14,9)
1 (14.2)
6 (85,8)
NS
Staging
I + II
20 (42,5)
10 (58,8)
10 (41,2)
III + IV
27 (57,5)
5 (16,6)
22 ( 83,4)
= 0.02
totala
47
15
32
a - erano disponibili per 47 su 50 casi b dati - a Fisher test esatto c - NS = non statisticamente significativa
Tabella 2 Stato dei microsatelliti codifica all'interno BLM, WRN, RECQL, CBL, hMSH6, hMSH3, IGFIIR, TGF-βRII
e BAX
geni nella serie di carcinomi gastrici con microsatellite mutator fenotipo.
Case

Histotypea

Stagingb


BLM

WRN

REQL

CBL

hMSH6

hMSH3

IGFIIR

TGF-βRII

BAX

No.



MSIc

(A)9

(A)8

(A)9

(ATG)6

(C)8

(A)8

(G)8

(A)10

(G)8

31R
I
I(T2N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
57R
I
IV(T3N1M1)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
63R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
+
-
-
+
+
67R
I
I(T2N0M0)
4/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
69R
D
II(T3N0M0)
4/5
+
-
-
+
+
+
-
+
+
79R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3P
I
II(T3N0M0)
4/7
+
-
-
-
-
-
-
-
+
11P
I
III(T3N1M0)
3/7
+
-
-
-
-
+
+
+
-
14P
M
II(T3N0M0)
6/7
+
-
-
+
+
-
-
+
+
17P
I
II(T3N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
19P
D
III(T3N1M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
27P
I
IV(T4N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
30P
I
I(T2N0M0)
3/6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
37P
I
I(T2N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
38P
I
III(T3N2M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
%
present studio (numero di casi)
27%
0% 0%

13%
20%
13%
7%
60%
27 %
mutazioni
(4/15)
(0/15)
(0/15)
(2/15)
(3/15)
(2 /15)
(1/15)
(9/15)
(4/15)
riportato in letteratura (in GC) d -
- Francia - -
22-52%
19-64%
19-24%
42-83%
15-64%
a - I = tipo intestinale; D = tipo diffuso; M = tipo misto b - secondo la classificazione TNM (Sobin e Wittekind, 1997) c - numero di /totale testato microsatelliti instabili D - dati compilati dai riferimenti: [17,27,42,50,51,52]
BLM frameshifts
amplificazione PCR del BLM
microsatellite rivelato bande anomale, assenti nelle normali DNA abbinate, in 4 dei 15 MMP + tumori (27%) (Fig. 1). Abbiamo confermato tramite sequenziamento che le bande anomale sono causate da una delezione di un residuo adenina nel poli-adenina tratto (riduzione da nove a otto adenine), come precedentemente indicato [24]. La frequenza di mutazione in
BLM può essere una stima bassa, perché abbiamo escluso casi in cui bande anormali in DNA tumorali erano notevolmente più debole di quelli normali, possibilmente in conseguenza di una grande contaminazione del tumore con cellule non maligne o di una bassa porzione di cellule maligne che mostrano l'anomalia (Fig. 1). Dal momento che nessun BLM
mutazione è stata osservata in MMP- tumori, frameshift mutazioni nel gene BLM
sembrano essere specificamente associata con gastrica MMP + tumori (probabilità P < 0,01 al test esatto di Fisher), simile al ben precedente alterazioni documentate in TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6
e BAX
geni [14, 16, 17, 32]. Pertanto, i nostri dati espandere il repertorio di geni alterati associati MMP + carcinomi gastrici. Figura 1 Esempi rappresentativi di mutazioni rilevate nei microsatelliti in regioni geniche di codifica. numero di casi sono indicati sopra ogni corrispondenza normale (N) e coppie di DNA tumorale (T). Le frecce indicano le bande anomale. Si noti che non abbiamo considerato campioni mutati in cui le bande anomale erano molto debole (come nel
BLM e BAX
geni del campione di tumore 30P). A causa della tendenza di Taq polimerasi per aggiungere un nucleotide extra alla fine dei frammenti di DNA sintetizzati, prodotti di PCR volte appaiono come bande doppie. Con l'eccezione di BAX
frameshift nel tumore 69R, nessun altro la mutazione sembra essere omozigote. Tuttavia, conoscendo il rapporto tra cellule maligne in campione di tumore, abbiamo precedentemente indicato che la BLM
mutazione in 69R tumore è anche omozigote [24].
Frameshifts in altre CDR microsatelliti e relazioni con frameshifts BLM
lo stesso gruppo di MMP + tumori è stato anche analizzato per la presenza di frameshifts in microsatelliti situati nelle regioni codificanti di altri otto geni (Tabella 2). Abbiamo trovato variazione di lunghezza sequenza in TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6
e BAX
geni, tutti precedentemente segnalato per essere modificato in MMP + GC. I dati circa la TGFβ1-RII
stato per otto (serie P nella tabella 2) delle quindici tumori sono stati precedentemente segnalati [27]. Le frequenze di mutazione osservate erano confrontabili con quelli precedentemente riportati per tutti questi geni, con l'eccezione di IGFIIR,
che abbiamo trovato una bassa percentuale di frameshifts (Tabella 2). È interessante notare che, in confronto con
BLM mutazioni, solo TGFβ1-RII
frameshifts erano più frequenti (60% vs 27%, rispettivamente) e BAX
frameshifts erano così come frequente (27%). Questi dati suggeriscono che frameshifts in
BLM sono alterazioni comuni in MMP + GC. È stata osservata una tendenza verso un'associazione tra mutazioni in
BLM e mutazioni in BAX
e hMSH3
e /o hMSH6
(Tabella 2) (P = 0,05 al test esatto di Fisher).
Abbiamo anche analizzato l'RecQL, WRN
e CBL
geni, che contengono brevi ripete nelle loro regioni codificanti. I primi due geni sono membri della stessa famiglia del gene elicasi BLM come
[36, 37]. Mentre RecQL
non è associata ad alcuna malattia umana, mutazioni nel WRN
gene sono la causa della sindrome di Werner (WS; OMIM 277700), una rara malattia autosomica recessiva caratterizzata clinicamente da invecchiamento precoce e un aumento del rischio per una varietà di neoplasie, e geneticamente caratterizzati da instabilità genomica. CBL
è un recettore tirosin-chinasi [38], la cui liberalizzazione è stata associata con l'oncogenesi [39]. Abbiamo trovato mutazioni solo nel CBL
gene (Fig. 1). Due campioni (69R e 14P) sono stati trovati a portare un inserimento 3 bp nel trinucleotide (ATG) 6 ripetizione del CBL
gene (dati non riportati). Come abbiamo riportato in precedenza [24], dal momento che nessun frameshift viene prodotto, nessuna conseguenza funzionale può dedurre. Entrambe le mutazioni sono stati trovati in tumori che mostrano anche frameshifts
BLM (Tabella 2). È interessante notare che questo sottogruppo di tumori presenta un eccesso statisticamente significativo di MSI in regioni codificanti rispetto al sottoinsieme MMP + senza BLM
alterazioni. (P < 0.001, a Χ 2 test) (Tabella 2)
Discussione
diversi studi hanno documentato che possono esistere vie alternative in gastrointestinale MMP + e MMP- tumori caratterizzati da diversi set di geni alterati [40]. Un modello progressivo di mutazioni mutator ( "il mutatore che muta l'altra mutator") è stato proposto di definire il mutator contro i percorsi soppressori di tumori gastrointestinali [41]. Analizzando la tempistica degli eventi mutazionali in geneticamente instabili GC, è stato proposto che i primi obiettivi di carenza di mismatch repair sono i tratti mononucleotide di TGFβ1-RII
e BAX.
Le mutazioni frameshift di hMSH3
e hMSH6
sembrano essere secondarie lesioni mancata corrispondenza di riparazione, che generano mutazioni in IGFIIR
[42]. La constatazione che le mutazioni frameshift a TGFβ1-RII Quali sono i più frequenti e la IGFIIR Quali sono i meno frequenti in gastrici MMP + tumori supporta il modello in cui eventi precoci dovrebbero essere presenti nella maggior parte dei tumori e mutazioni in ritardo solo in una frazione minore [43]. Questo dato è confermato anche nel nostro studio (Tabella 2). BLM
frameshift mutazioni sono associate più frequentemente con primi e secondi alterazioni step proposti in questo modello, suggerendo che essi sono secondari a disadattamento difetti di riparazione (in hMSH3
e /o hMSH6
) presente nelle cellule che non lo fanno apoptosi (possibilmente in conseguenza di BAX
inattivazione). Degno di nota, nel caso in cui 3P, oltre a BLM,
gli unici frameshifts sono stati trovati in BAX (vedi
figura 1) e p53
(dati non riportati) geni, suggerendo che, in alcuni casi, BLM
alterazione può verificarsi senza hMSH3
e /o hMSH6
mutazioni, in cellule con anormale pathway p53-mediata della risposta apoptotica di mancata corrispondenza del DNA.
Il coinvolgimento di
BLM nella tumorigenesi fuori pazienti BS sembra concepibile, poiché questo gene sembra agire come un custode. BLM
mutazioni sono noti per causare un aumento della instabilità genomica caratterizzata da un elevato numero di rotture cromosomiche, le carenze e riarrangiamenti e da un numero eccessivo di mutazioni in entrambe le regioni codificanti e non codificanti, probabilmente originate da scambio ineguale cromatidi fratelli, caratteristica della sindrome Bloom [44, 45]. Di conseguenza, BS presenta una serie di instabilità genomica e rischio di cancro elevata, un'associazione trova anche in altre malattie causate da difetti nei geni custode (come HNPCC, WS, atassia telangiectasia-e xeroderma pigmentoso). Simile alle mutazioni trovate nelle BS, le frameshifts descritte nel GC abolire la funzione elicasi della proteina BLM [24]. proteina BLM ha una comprovata attività DNA svolgimento [46] e potrebbe essere coinvolta nei processi che vengono disturbati nelle cellule maligne, come la replicazione del DNA, la ricombinazione, la segregazione dei cromosomi, la riparazione del DNA e la trascrizione. In effetti, il lievito di fissione BLM gene omologo
(radl2
+ /rqhl
+) è stato dimostrato che regolano il checkpoint fase S ed è stato proposto di integrità cromosomica coppia con progressione del ciclo cellulare [47, 48]. Tuttavia, il ritrovamento di BLM
mutazioni in MMP + tumori genera un paradosso: BLM
mutazioni si prevede di generare instabilità cromosomica, mentre la maggior parte delle MMP + tumori sono diploide. Tuttavia, alcuni MMP + tumori sono aneuploid e BLM
perdita-di-funzione mutazioni possono avere conseguenze pleiotropici, possibilmente che interessano anche il percorso microsatellite instabilità, come suggerito dalla descrizione di un aumento mutazioni all'interno del gene nella sindrome di Bloom [44, 45 ]. In suppoprt al nostro suggerimento è la constatazione che abbiamo scoperto che
BLM è mutato in linea cellulare LoVo, una linea di cellule di cancro al colon sia con microsatelliti e cromosomico inatability [43]. Molto di più, è stato recentemente riportato che SGS1
gene, il Saccharomyces cerevisiae
omologo di
BLM e WRN,
sopprime genoma instabilità e ricombinazione homeologous ed è ridondante con mismatch repair del DNA (MMR) per la soppressione riarrangiamenti cromosomici lordi e per la soppressione ricombinazione tra sequenze di DNA divergenti [49].
Conclusioni
nostri risultati indicano che BLM
frameshifts sono alterazioni frequenti GC e sono specificamente associati con MMP + tumori che presentavano almeno 2 microsatelliti instabili. Le mutazioni in BLM
sembrano essere frequentemente associata con frameshifts in BAX
e in hMSH6
e /o hMSH3,
e tumori con BLM
alterazioni presentare una serie di instabili mono- e trinucleotide ripete situato in regioni codificanti significativamente superiore a quello osservato in MMP + tumori senza BLM
frameshifts. Suggeriamo che BLM
perdita di funzione da MSI nei tumori gastrici è un evento mutazionale intermedia, che può aumentare l'instabilità di un genotipo instabile preesistente.
Metodi
tumorali Campioni
Cinquanta tumori gastrici primari e loro tessuti accoppiati normali (sangue o normale mucosa gastrica) sono stati selezionati sulla base di DNA disponibile da un pannello di 80 tumori gastrici (27, Calin G e Negrini M dati non pubblicati). Quando possibile, zone di tessuto tumorale con cellule infiammatorie minime o stroma minima, o entrambi, sono stati selezionati per ottenere un carico cellula neoplastica superiore al 50%. Tutti i casi sono stati identificati come istopatologico adenocarcinomi. Istotipo (secondo la classificazione di Lauren) [28] e la messa in scena (secondo la classificazione TNM) [29] è stato conosciuto per 47 su 50 casi (94%) (Tabella 1). Trentadue casi erano di istotipo intestinale e 15 casi di diffusa o di tipo misto. Venti tumori sono stati in scena I o II, mentre il 27 erano in stadio III o IV. Per quanto riguarda lo stato dei linfonodi, diciotto casi c'erano ed erano 29 N-positivi. Nessuno dei pazienti ha sviluppato un cancro in tenera età, e nessuno aveva una storia familiare suggestiva di predisposizione genetica al cancro. Alte DNA peso molecolare è stato isolato utilizzando procedure stabilite [30]
Valutazione della MSI
MSI è stato rivelato con due set di marcatori anonimi in loci:. (I) D11S1778, D11S1328, D11S922
e D11S1318
[24] o (ii) D2S177, D3S1076, D5S433, D11S904, D17S796 Comprare e D18S59
[27]. I primer per questi dinucleotide loci microsatelliti sono stati ottenuti dalle informazioni disponibili attraverso la banca dati del genoma. amplificazioni di PCR sono stati eseguiti come precedentemente descritto [24, 27]. Per tutti i campioni del BAT25
e BAT26
microsatelliti sono stati analizzati mediante PCR, come descritto [31]. MSI è stato valutato se uno spostamento mobilità dei prodotti PCR da DNA tumorale rispetto alla controparte normale è stato identificato. Solo tumori con almeno 2 MSI (> 30% dei microsatelliti testati). Sono stati considerati MMP +
amplificazione di microsatelliti in BLM e in altre regioni codificanti (CDR)
La (A) 9 microsatellite trova nella posizione 1610- 1618 di BLM
sequenza di cDNA è stato analizzato per tutti i campioni appaiati. Brevemente, il microsatellite è stato amplificato mediante PCR utilizzando 50 ng di DNA stampo, 1 mM di ciascun primer, 1,5 mM di MgC12, 50 mM ciascuno di dATP, dGTP, e dTTP e 5,0 mM di dCTP, 0,1 unità di Taq DNA polimerasi, e 1 pCi [α33P] dCTP in 10 pl di volume di reazione. Le reazioni di PCR sono state effettuate per un ciclo di 94 ° C per 5 min seguita da 35 cicli di 94 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 30 s. I prodotti di PCR da tumore e corrispondenti DNA di controllo sono stati caricati su paralleli, il 6% gel di acrilammide sequenziamento ed esposti per la visualizzazione mediante autoradiografia su film Kodak X-AR. Individuazione di mutazioni in microsatelliti situati nei CDR da altri otto geni (il (A) 10 in TGFβ1-RII,
la (G) 8 in IGFIIR,
la (G) 8 in BAX,
la (a) 8 in hMSH3,
il (C) 8 in hMSH6,
(a) 9 in RecQL,
(a) 8 in WRN,
e la (ATG) 6 CBL
) è stato fatto come precedentemente descritto [14, 16, 17, 24, 32]. Per la verifica, ciascuna PCR è stata ripetuta almeno due volte. Un allele mutato era rappresentata da uno spostamento di banda da 1 a 3 bp dalla banda normale con intensità paragonabile o superiore a quella del nastro wild-type (Fig. 1).
Sequenziamento di prodotti anormali
frammenti genomici DNA espongono turni bande sono stati riamplificati nelle stesse condizioni eccetto per l'omissione di etichetta dCTP. Prima di sequenziamento, i prodotti di PCR sono stati purificati direttamente o dopo la separazione in un gel di agarosio al 2%, utilizzando kit Qiagen purificazione. Entrambi i filamenti di DNA sono stati sequenziati usando primer PCR e un sistema automatico Applied Biosystem 377 stazione di sequenza. sequenze nucleotidiche sono stati analizzati utilizzando il Wisconsin (GCG) versione del pacchetto del programma Unix 8.1.
Analisi statistica
L'analisi statistica dei risultati è stata effettuata utilizzando il Χ 2 test o il test esatto di Fisher. AP
valore. ≪ 0.05 è stato considerato statisticamente significativo
dichiarazioni
Riconoscimento
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) e in parte dal contratto CE BIOMED BMH4-CT95-0914. GC è stato sostenuto da una borsa di formazione IARC Research.
Autori fascicoli presentati originali per
di seguito sono riportati i link ai file degli autori originali inviati per le immagini. 12863_2001_18_MOESM1_ESM.png file originale degli autori per la figura 1

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