mutações frameshift somáticas no gene BLM síndrome de Bloom são frequentes nos carcinomas gástricos esporádicos com microssatélites modificador phenotype

mutações frameshift somáticas no gene da Bloom síndrome BLM Quais são frequentes nos carcinomas gástricos esporádicos com fenótipo microssatélite modificador da arte abstracta
Fundo
instabilidade genômica tem sido relatada em vias de microssatélites em poucas sequências codificadoras. Nós mostrámos que o gene da síndrome de Bloom BLM
pode ser um alvo de microsatelliteinstability (MSI) num curto espaço de repetição poli-adenina localizado na sua região de codificação. Para caracterizar ainda mais o envolvimento de
BLM na tumorigênese, investigamos mutações em nove genes contendo microssatélites de codificação no fenótipo microssatélite modificador (MMP) carcinomas gástricos positivos e negativos (GCs).
Métodos
Nós analisados ​​50 gástrica carcinomas (GCs) para mutações no BLM
cabeceira de poli (a) do aparelho como nos microssatélites de codificação do TGF-p1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6, BAX, WRN, RECQL Comprar e CBL
genes.
Resultado
BLM
mutações foram encontradas em 27% dos GCs MMP + (4/15 casos), mas não em qualquer um dos GCs negativos MMP (0/35 casos). A freqüência de mutações nos outros oito regiões codificantes de microssatélites foi a seguinte: TGF-p1-RII
(60%), BAX
(27%), hMSH6
(20%), hMSH3
(13 %), CBL
(13%), IGFIIR
(7%), RECQL
(0%) e WRN
(0%). Mutações no BLM
parecem estar mais frequentemente associado com quadro de leitura em BAX
e hMSH6
e /ou hMSH3.
Tumores com BLM
alterações apresentam maior frequência de mono instável e trinucleotide repete localizadas em regiões codificadoras, em comparação com tumores modificador fenótipo sem BLM
quadro de leitura.
Conclusões
BLM
quadro de leitura são alterações freqüentes em GCs especificamente associados com tumores de MMP +. Sugerimos que BLM
perda de função da MSI pode aumentar a instabilidade genética de um genótipo instável pré-existente em tumores gástricos.
Fundo
O cancro é uma doença genética progressiva caracterizada pela progressiva acumulação de mutações em ambos codificação e as sequências não codificantes [1]. simples sequência repete ou microssatélites são altamente instáveis ​​em algumas neoplasias humanas, identificando uma classe de tumores com o fenótipo microssatélite modificador (MMP +) (para revisão ver [2]). MMP + ve estado é definido por uma instabilidade em mais de 30% dos microssatélites analisados, incluindo, pelo menos, um mononucleótido (tais como BAT26 ou BAT25) [3]. instabilidade microssatélite (MSI) tem sido descrita como uma alteração genética frequente em vários tumores sólidos humanos incluindo carcinomas gástricos esporádica e familiar (GCs). Em quase todos os pacientes com cancro não poliposo hereditário colorretal (HNPCC), estudos moleculares mostraram que MSI é causada por mutações da linha germinativa em genes que codificam as proteínas necessárias para a reparação de emparelhamentos incorrectos do ADN (MMR) [4]. Genes como hMSH2, hMLH1, PMS1, PMS2 Comprar e hMSH6 /grupo gTBP
[5-8], foram definidos como "cuidadores", porque, quando perturbado, favorecem a aquisição de mutações em alta frequência em vários genes, incluindo oncogenes e genes supressores de tumor [9]. No entanto, numa fracção significativa de MMP esporádica + tumores, análise de mutação não permitiu a identificação de genes responsáveis ​​pela MSI [2, 10], sugerindo que, em tais casos, MSI pode ser causada por mecanismos epigenética. Na verdade, o silenciamento do gene por hipermetilação do promotor foi recentemente mostrado para o gene hMLH1
[11-13].
A importância da MSI na tumorigênese tem sido apoiado pela demonstração de que a instabilidade genética caracterizando + cancros gastrointestinais MMP pode ter como alvo curta tractos repetitivas dentro da região codificadora de genes importantes para a sobrevivência e proliferação celular. mutações de inserção /deleção foram encontrados nos genes para o receptor de crescimento transformante tipo factor beta II (TGF-p1-RII
), o receptor semelhante à insulina tipo II do factor de crescimento (IGFIIR
), os genes de DNA mismatch-reparação hMSH3 Comprar e hMSH6, in the pró-apoptótica BAX gene
eo fator de transcrição E2F-4
[14-18]. Em todos os casos, com a excepção de a de E2F-4, of the nucleótidos de inserção /deleção resultou em mutações frameshift e da proteína truncada. Apesar de a importância biológica dessas alterações não está totalmente estabelecida, propôs-se que a ausência dos receptores de TGF-p1-RII a partir da superfície de células epiteliais gastrointestinais poderia eliminar o controlo de crescimento negativo de TGF-β, levando a um crescimento descontrolado de células [19]. IGFIIR tem um papel na supressão do crescimento por ligação e activação do receptor de TGF-p1 a complexa e mediando a internalização, com degradação subsequente, do factor de crescimento IGF-II [20, 21]. BAX promove a apoptose
e foi relatado que a BAX
inactivação conduz ao crescimento do tumor rápida [22]. Os genes humanos hMSH3 Comprar e hMSH6
são homólogas gene as MutS bacterianas
cujos produtos se ligam descasamentos de ADN para iniciar a reparação específica do fio de erros de replicação de ADN [23]. mutações somáticas e germinativas em hMSH6
foram associados com + carcinomas colorretais esporádicos MMP e HNPCC [6].
Temos encontrado anteriormente que o gene da BLM
também pode ser um alvo da MSI [24]. Os frameshifts, encontrados em um curto de repetição de poli-adenina, foram previstos para gerar uma proteína truncada BLM e não funcional. mutações heterozigóticas homozigotos ou compostos no gene BLM
foram mostrados para causar a síndrome Bloom (BS; OMIM 210900), uma condição pré-maligna caracterizada pela instabilidade cromossômica e aumento da taxa de mutação. BS doentes estão predispostos a uma ampla variedade de neoplasias diagnosticado numa idade precoce. Digno de nota, entre 100 neoplasias registradas no Registro BS, 19 eram gastrointestinal (esôfago, estômago e cólon) e apenas dois foram diagnosticados após a idade de 40 [25]. Estes dados indicam que as mutações no gene da BLM
pode promover tumorigênese
Para melhor definir o papel do
BLM na tumorigênese gastrointestinal nós analisamos um painel de MMP + e carcinomas gástricos MMP (GCs) para:. A) quadro de leitura no BLM
codificação microssatélites região e b) para possíveis associações com outras quadro de leitura intragênicos.
resultados
estatuto MSI
para o presente estudo, o nosso painel de 50 GCs contém 15 MMP tumores + com MSI no dois ou mais loci (Tabela 2) e 35 GCs MMP com alteração em um microssatélite (4 tumores) ou sem MSI (31 tumores). Todos os casos de MMP + foram BAT 26 positivo e BAT 25 instabilidade foi encontrado em 13 dos 15 casos (exceto casos 67R e 27P). As características clínico-patológicas de tumores MMP + estão descritos na Tabela 1. A MMP + fenótipo estava intimamente associado com um estágio de baixa pTNM e com menos prevalentes metástases ganglionares (p = 0,02 e p = 0,001 pelo teste exato de Fisher, respectivamente, vs.
MMP-tumores). Dentro do grupo MMP +, um excesso de tumores nos estádios iniciais e sem linfonodo metástases foi encontrado (10/15 casos versus 10/32 casos de MMP casos, p = 0,02 e 11/15 casos versus 7/32 de casos casos MMP, p = 0,001, respectivamente), dados que suportam a proposta de melhor prognóstico da GCs MMP + [33, 34]. De nota, não há excesso de tipo intestinal entre os tumores de MMP + foi encontrado (12/15 casos vs.
20/32 de MMP casos) (Tabela 1), os dados de acordo com estudos recentes que mostram não haver diferença significativa na freqüência de MSI no intestinal-tipo e difusa do tipo carcinomas [26, 35] parâmetros .table 1 histotipo e de paragem associados com o fenótipo MMP na nossa GCSA
Número de pacientes
P valorB
total (%)
MMP + (%)
MMP - (%)
histotipo
intestinal
32 (68,0)
12 (37,5)
20 (62,5)
difusa + Mixed
15 (32,0) Sims 3 (20,0)
12 (80,0)
NSC
T (profundidade de infiltração parede)
T1 + 12 (25,5)
6 (50,0) T2
6 (50,0)
T3 + T4
35 (74,5 )
9 (25,7)
26 (74,3)
NS
N (linfa status do nó)
N0
18 (38,3)
11 (78,5)
7 (21,5)
N +
29 (61,7) página 4 (12.1)
25 (87,9)
= 0,001
M (metástases)
M0
40 (85,1 )
14 (35,0)
26 (65,0)
M +
7 (14,9)
1 (14,2)
6 (85,8)
NS
Staging
I + II
20 (42,5)
10 (58,8)
10 (41,2)
III + IV
27 (57,5)
5 (16,6)
22 ( 83,4)
= 0,02
Totala
47
15
32
a - dados estavam disponíveis para 47 de 50 casos b - pelo teste exato de Fisher c - NS = não significativa estatisticamente
Tabela 2 status dos microssatélites codificantes dentro de BLM, WRN, RECQL, CBL, hMSH6, hMSH3, IGFIIR, TGF-βRII Comprar e BAX
genes na série de carcinomas gástricos com fenótipo microssatélite modificador.
Case

Histotypea

Stagingb


BLM

WRN

REQL

CBL

hMSH6

hMSH3

IGFIIR

TGF-βRII

BAX

No.



MSIc

(A)9

(A)8

(A)9

(ATG)6

(C)8

(A)8

(G)8

(A)10

(G)8

31R
I
I(T2N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
57R
I
IV(T3N1M1)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
63R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
+
-
-
+
+
67R
I
I(T2N0M0)
4/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
69R
D
II(T3N0M0)
4/5
+
-
-
+
+
+
-
+
+
79R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3P
I
II(T3N0M0)
4/7
+
-
-
-
-
-
-
-
+
11P
I
III(T3N1M0)
3/7
+
-
-
-
-
+
+
+
-
14P
M
II(T3N0M0)
6/7
+
-
-
+
+
-
-
+
+
17P
I
II(T3N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
19P
D
III(T3N1M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
27P
I
IV(T4N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
30P
I
I(T2N0M0)
3/6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
37P
I
I(T2N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
38P
I
III(T3N2M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
%
present estudo (número de casos)
27%
0% 0%

13%
20%
13%
7%
60%
27 %
mutações
(4/15)
(0/15)
(0/15)
(2/15)
(3/15)
(2 /15)
(1/15)
(9/15)
(4/15)
relatado na literatura (em GCs) d
- - Restaurant -
- 22-52%
19-64%
19-24%
42-83%
15-64%
a - I = tipo intestinal; D = tipo difuso; M = tipo misto b - de acordo com a classificação TNM (Sobin e Wittekind, 1997) c - número total testado microssatélites instáveis ​​/D - dados compilados a partir das referências: [17,27,42,50,51,52]
BLM frameshifts
amplificação por PCR do BLM
microssatélites revelou bandas anormais, ausente no ADN correspondentes normais, em 4 dos 15 tumores de MMP + (27%) (Fig. 1). Temos confirmada por sequenciação de que as bandas anormais são causadas por uma deleção de um resíduo de adenina no tracto poli-adenina (redução de nove para oito adeninas), como mostrado anteriormente [24]. A frequência de mutação em BLM
pode ser uma estimativa baixa, pois foram excluídos os casos em que bandas anormais em DNAs de tumor foram notavelmente mais fraca do que os normais, possivelmente em consequência de uma grande contaminação do tumor com células não-malignas ou de um baixo porção de células malignas que indicam a anormalidade (Fig. 1). Uma vez que nenhuma mutação
BLM foi observada em tumores MMP, mutações frameshift no gene BLM
parecem ser especificamente associada com tumores gástricos MMP + (probabilidade p < 0,01 pelo teste exacto de Fisher), semelhante ao anterior, bem alterações documentadas em TGF-p1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6 Comprar e BAX
genes [14, 16, 17, 32]. Por conseguinte, os nossos dados de expandir o repertório de genes alterados associados a carcinomas gástricos MMP +. Figura 1 Exemplos representativos de mutações detectadas em microssatélites em regiões de codificação de genes. o número de casos são mostrados por cima de cada pares de ADN de tumor (T) normais correspondentes (N) e. As setas indicam as bandas anormais. Note-se que não consideramos amostras mutantes onde bandas anormais eram muito fraco (como no
BLM e BAX
genes de tumor 30P amostra). Devido à tendência de Taq polimerase para adicionar um nucleótido extra no final dos fragmentos de ADN sintetizados, produtos de PCR por vezes aparecem como bandas duplas. Com a excepção de BAX
frameshift no tumor 69R, nenhuma outra mutação parece ser homozigótica. No entanto, por saber a razão de células malignas em amostra de tumor, que tenha indicado previamente que o BLM
mutação em 69R tumor também é homozigoto [24].
Quadro de leitura em outros microssatélites CDRs e relações com quadro de leitura BLM
o mesmo painel de tumores MMP + também foi analisada para a presença de quadro de leitura dos microssatélites localizados nas regiões de codificação de oito outros genes (Tabela 2). Encontramos variação no comprimento seqüência em TGF-p1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6 Comprar e BAX
genes, todos previamente relatado a ser alterado no GCs MMP +. Dados sobre o TGF-p1-RII
status para oito (série P na Tabela 2) dos quinze tumores foram relatado anteriormente [27]. As frequências de mutação observados foram comparáveis ​​com os anteriormente relatados para todos estes genes, com exceção de IGFIIR, Compra de que encontramos um baixo percentual de quadro de leitura (Tabela 2). Curiosamente, em comparação com as mutações
BLM, apenas a TGF-p1-RII
quadro de leitura foram mais frequentes (60% vs 27%, respectivamente) e BAX
quadro de leitura foram assim como frequentes (27%). Estes dados sugerem que quadro de leitura em
BLM são alterações comuns em MMP + GCs. A tendência para uma associação entre mutações no BLM
e mutações em BAX Comprar e hMSH3
e /ou hMSH6
foi observada (Tabela 2) (P = 0,05 pelo teste exato de Fisher).
Nós também analisaram o RecQL, WRN Comprar e CBL
genes, que contêm repetições curtas em suas regiões de codificação. Os dois primeiros genes são membros da mesma família de genes da helicase como BLM
[36, 37]. Enquanto RecQL
não está associada com qualquer doença humana, as mutações no gene WRN
são causa da síndrome de Werner (WS, OMIM 277700), um distúrbio autossómico recessivo rara caracterizada clinicamente por envelhecimento prematuro e um risco aumentado para uma variedade das neoplasias, e geneticamente caracterizado pela instabilidade genômica. CBL
é um receptor tirosina-quinase [38], cuja desregulação foi associada com a oncogénese [39]. Encontraram-se mutações apenas no gene CBL
(Fig. 1). Duas amostras (69R e 14P) foram encontrados para transportar uma inserção de 3 pb no trinucleótido (ATG) 6 repetição do gene CBL
(dados não mostrados). Como já relatados anteriormente [24], uma vez que não é produzido de frameshift, qualquer consequência funcional pode ser inferida. Ambas as mutações foram encontradas em cancros que exibem também frameshifts
BLM (Tabela 2). É de salientar que este subconjunto de tumores mostram um excesso estatisticamente significativa da MSI em regiões de codificação quando comparado com o subconjunto MMP + sem BLM
alterações. (P < 0,001, em Χ 2 test) (Tabela 2)
Discussão
Vários estudos documentaram que vias alternativas podem existir em gastrointestinal MMP + e MMP-cancros caracterizados por diferentes conjuntos de genes alterados [40]. Um modelo gradual de mutações mutantes ( "o mutador que transforma o outro modificador") foi proposto para definir o mutador contra as vias supressores de tumores gastrointestinais em [41]. Ao analisar o calendário de eventos de mutação em GCs geneticamente instável, foi proposto que os primeiros alvos de deficiência de reparo incompatível são as extensões mononucleotídicos de TGF-p1-RII Comprar e BAX.
As mutações frameshift de hMSH3 Comprar e hMSH6
parecem ser lesões de reparação incompatibilidade secundárias, que geram mutações em IGFIIR
[42]. A constatação de que mutações frameshift no TGF-p1-RII Quais são as mais frequentes eo IGFIIR Quais são os menos frequentes em gástricas tumores MMP + suporta o modelo em que os eventos precoces deve estar presente na maioria dos tumores e mutações final única numa fracção menor [43]. Esta conclusão também é confirmada em nosso estudo (Tabela 2). BLM
mutações frameshift estão associados mais frequentemente com primeira e segunda alterações da etapa propostas neste modelo, sugerindo que eles são secundárias a incompatibilidade reparar defeitos (em hMSH3
e /ou hMSH6
) presente nas células que não fazer apoptose (possivelmente em consequência de BAX
inactivação). Digno de nota, no caso de 3P, além de BLM,
os únicos quadro de leitura foram encontrados em BAX (ver
figura 1) e p53
(dados não mostrados) genes, o que sugere que, em alguns casos, BLM
alteração pode ocorrer sem hMSH3
e /ou hMSH6
mutações, em células com via mediada por p53 anormal de resposta apoptótica a incompatibilidade DNA.
O envolvimento de BLM
na tumorigênese fora pacientes BS parece concebível, uma vez que este gene parece actuar como um guarda. BLM
mutações são conhecidos por causar uma instabilidade genômica aumentada caracteriza-se por um elevado número de quebras cromossômicas, lacunas e rearranjos e por um número excessivo de mutações em ambas as regiões codificantes e não codificantes, provavelmente originado por troca de cromátide irmã desigual, característica do síndrome de Bloom [44, 45]. Por conseguinte, a BS exibe uma combinação de instabilidade genómica e elevado risco de câncer, uma associação encontrados também em outras doenças causadas por defeitos em genes tais como portaria (HNPCC, WS, ataxia-telangiectasia e xeroderma pigmentosum). Semelhante às mutações encontradas em BS, os descritos no quadro de leitura GCs suprimir a função helicase da proteína BLM [24]. proteína BLM tem uma actividade de desenrolamento de DNA comprovada [46] e pode estar envolvida em processos que são perturbados nas células malignas, tais como a replicação do ADN, a recombinação, segregação cromossoma, a reparação do ADN e a transcrição. Com efeito, o gene de levedura de fissão BLM
homólogo (radl2
+ /rqhl
+) foi mostrada para regular o checkpoint da fase S e foi proposto para acoplar integridade cromossómico com a progressão do ciclo celular [47, 48]. No entanto, a descoberta de BLM
mutações em tumores MMP + gera um paradoxo: BLM
mutações são previstos para gerar instabilidade cromossômica, enquanto a maioria dos tumores MMP + são diplóides. No entanto, alguns tumores de MMP + são aneuploidia e de BLM
mutações de perda de função pode ter conseqüências pleiotrópicos, possivelmente afetando também a via de instabilidade de microssatélites, como sugerido pela descrição de um aumento mutações intra-gene na síndrome de Bloom [44, 45 ]. Em suppoprt a nossa sugestão é a constatação de que temos verificado que BLM
é mutado na linha de células LoVo, uma linha de células do cancro do cólon com ambos os microssatélites e cromossômica inatability [43]. Muito mais, foi relatado recentemente que gene SGS1
, a Saccharomyces cerevisiae
homólogo de
BLM e WRN,
suprime a instabilidade do genoma e recombinação homeologous e é redundante com o reparo do DNA mismatch (MMR) para suprimir rearranjos cromossômicos bruta e para suprimir a recombinação entre sequências de DNA divergentes [49].
Conclusões
Nossos resultados indicam que BLM
quadro de leitura são alterações freqüentes em GCs e seja especificamente associado a tumores MMP + exibindo pelo menos 2 microssatélites instáveis. Mutações no BLM
parecem estar frequentemente associada ao quadro de leitura em BAX Comprar e em hMSH6
e /ou hMSH3,
e tumores com BLM
alterações apresentar uma série de instáveis ​​mono e trinucleotídeos repete localizados em regiões significativamente mais elevadas do que a observada em tumores de MMP sem + BLM
quadro de leitura de codificação. Sugerimos que BLM
perda de função da MSI em tumores gástricos é um evento mutacional intermediário, o que pode aumentar a instabilidade de um genótipo instável pré-existente.
Métodos
amostras tumorais
Cinquenta tumores gástricos primários e seleccionaram-se os seus tecidos normais emparelhadas (sangue ou mucosa gástrica normal) sobre a base de ADN disponível a partir de um painel de 80 tumores gástricos (27, Calin G e M Negrini dados não publicados). Quando possível, as áreas de tecido tumoral com células inflamatórias mínimas ou estroma mínima, ou ambos, foram seleccionadas para se obter uma carga de células neoplásicas superior a 50%. Todos os casos foram identificados histopatologicamente como adenocarcinomas. Histotipo (segundo a classificação de Lauren) [28] e estadiamento (de acordo com a classificação TNM) [29] era conhecido por 47 de 50 casos (94%) (Tabela 1). Trinta e dois casos foram de histotipo intestinal e 15 casos de difuso ou tipo misto. Vinte tumores foram encenadas I ou II, enquanto 27 estavam em estágio III ou IV. Em relação ao estado dos linfonodos, dezoito casos houve e 29 N-positivo. Nenhum dos pacientes tinham desenvolvido um câncer em uma idade adiantada, e nenhum tinha uma história familiar sugestiva de predisposição genética para o câncer. ADN de elevado peso molecular foi isolado utilizando procedimentos estabelecidos [30] Avaliação da MSI

MSI foi revelado com dois conjuntos de marcadores anónimos em loci:. (I) D11S1778, D11S1328, D11S922 e D11S1318

[24] ou (ii) D2S177, D3S1076, D5S433, D11S904, D17S796 Comprar e D18S59
[27]. Os iniciadores para estes dinucleótido locos de microssatélites foram obtidos a partir de informações disponíveis na base de dados do genoma. As amplificações de PCR foram realizadas como anteriormente descrito [24, 27]. Para todas as amostras o BAT25
e BAT26
microssatélites foram analisadas por amplificação por PCR, como descrito [31]. MSI foi avaliado se um desvio de mobilidade dos produtos de PCR a partir do ADN do tumor em comparação com a contrapartida normal foi identificado. Somente os tumores com pelo menos dois MSI (> 30% de microssatélites testados). Foram considerados MMP +
Amplificação de microssatélites em BLM e em outras regiões de codificação (CDR)
O (A) 9 microssatélite localizados na posição 1610- 1618 de BLM
sequência de cDNA foi analisada em todas as amostras emparelhadas. Resumidamente, o microssatélite foi amplificado por PCR utilizando 50 ng de ADN molde, 1 jiM de cada iniciador, 1,5 mM de MgC12, 50 uM de cada dATP, dGTP, e dTTP e 5,0 uM de dCTP, 0,1 unidades de polimerase de ADN de Taq, e 1 uCi [α33P] dCTP em 10 ul de volume de reacção. As reacções de PCR foram realizadas para um ciclo de 94 ° C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s. Os produtos de PCR a partir de ADN correspondentes de controlo do tumor e foram carregados em paralelo, em 6% de gel de acrilamida e de sequenciação expostos para visualização por autorradiografia em filmes Kodak X-AR. A detecção de mutações em microssatélites localizados nas CDR de oito outros genes (a (A) 10 em TGF-p1-RII, of the (L) 8 em IGFIIR de viajantes a (L) 8 em Bax, of the (a) 8 em hMSH3, of the (C) 8 em hMSH6, in the (a) 9 em RecQL, in the (a) 8 em WRN,
eo (ATG) 6 em CBL
) foi realizado como previamente descrito [14, 16, 17, 24, 32]. Para a verificação, cada PCR foi repetida pelo menos duas vezes. Um alelo mutado foi representada por um desvio de bandas de 1 a 3 pb da faixa normal com intensidade comparável ou maior do que a da banda de tipo selvagem (Fig. 1). A sequenciação de produtos
anormais
fragmentos de DNA genómico exibindo deslocamentos de bandas foram novamente amplificados sob as mesmas condições, excepto pela omissão de dCTP marcado. Antes de sequenciação, os produtos de PCR foram purificados directamente ou após separação num gel de agarose a 2%, utilizando kits de purificação de Qiagen. Ambas as cadeias de DNA foram sequenciadas usando os iniciadores de PCR e uma estação de sequenciamento automatizado Applied Biosystem 377. As sequências de nucleótidos foram analisados ​​utilizando o Wisconsin (GCG) pacote de programas versão Unix-8.1.
análise estatística
A análise estatística dos resultados foi realizada utilizando o Χ 2 ou teste exato de Fisher. AP
valor. ≪ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
declarações
Reconhecimento
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) e em parte do contrato CE BIOMED BMH4-CT95-0914. GC foi apoiada por um IARC Research Training Fellowship.
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