mutaciones de cambio somáticas en el gen del síndrome de Bloom BLM son frecuentes en los carcinomas gástricos esporádicos con fenotipo mutador de microsatélites

mutaciones de cambio somáticas en el síndrome de Bloom BLM
gen son frecuentes en los carcinomas gástricos esporádicos con fenotipo mutador de microsatélites
Resumen Antecedentes

La inestabilidad genómica ha informado en vías de microsatélites en algunas secuencias de codificación. Hemos demostrado que el síndrome de Bloom BLM
gen puede ser un objetivo de microsatelliteinstability (MSI) en un corto de repetición de poli-adenina situado en su región de codificación. Para caracterizar mejor la implicación de BLM
en la tumorigénesis, hemos investigado las mutaciones en los genes que contienen nueve microsatélites de codificación en el fenotipo mutador de microsatélites (MMP) carcinomas gástricos positivos y negativos (GC).
Métodos Se analizaron 50
gástrica carcinomas (GCS) para mutaciones en el BLM
aswell tracto poli (a) como en los microsatélites codificantes del TGFß1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6, BAX, WRN, RECQL Opiniones y CBL
genes.
resultados
BLM
se encontraron mutaciones en el 27% de los GC MMP + (4/15 casos), pero no en cualquiera de los GC negativos de MMP (0/35 casos). La frecuencia de mutaciones en el otro ocho regiones codificantes de microsatélites fue el siguiente: TGFß1-RII gratis (60%), BAX gratis (27%), hMSH6 gratis (20%), hMSH3 gratis (13 %), CBL gratis (13%), IGFIIR gratis (7%), RECQL gratis (0%) y WRN gratis (0%). Las mutaciones en el BLM
parecen estar asociados con mayor frecuencia con el marco de lectura en BAX Opiniones y en hMSH6
y /o hMSH3.
Tumores con BLM
alteraciones presentar una mayor frecuencia de mono inestable y trinucleótidos repeticiones ubicadas en las regiones de codificación en comparación con los tumores mutator fenotipo sin BLM
marco de lectura.
Conclusiones
BLM
marco de lectura son alteraciones frecuentes en los GC específicamente asociadas a tumores MMP +. Sugerimos que BLM
pérdida de la función de MSI puede aumentar la inestabilidad genética de un genotipo inestable preexistente en los tumores gástricos.
Antecedentes
cáncer es una enfermedad genética progresiva caracterizada por la acumulación progresiva de mutaciones tanto en la codificación y secuencias no codificantes [1]. simple secuencia se repite o microsatélites son muy inestables en algunas neoplasias humanas, la identificación de una clase de tumores con el microsatélite mutator fenotipo (MMP +) (para revisión ver [2]). MMP + ve estado se define por la inestabilidad en más de 30% de los microsatélites analizado condiciona, incluyendo al menos un mononucleótido (tales como BAT26 o BAT25) [3]. Inestabilidad de microsatélites (MSI) se ha descrito como una alteración genética frecuente en varios tumores sólidos humanos, incluyendo carcinomas gástricos esporádicos y familiares (GCS). En casi todos los pacientes con cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC), los estudios moleculares han demostrado que MSI es causado por mutaciones germinales en los genes que codifican proteínas necesarias para la reparación de genes de ADN (MMR) [4]. Los genes tales como hMSH2, hMLH1, PMS1, PMS2 Opiniones y hMSH6 /GTBP
[5-8], se definieron como "cuidadores", ya que, cuando falla, favorecen la adquisición de mutaciones en alta frecuencia en varios genes, incluyendo oncogenes y genes supresores de tumores [9]. Sin embargo, en una fracción significativa de MMP esporádica + tumores, análisis de la mutación no ha permitido la identificación de los genes responsables de MSI [2, 10], lo que sugiere que, en tales casos, MSI podría ser causado por mecanismos epigenéticos. De hecho, el silenciamiento de genes por el promotor hipermetilación se demostró recientemente para el hMLH1
genes [11-13]. Francia El significado de MSI en la tumorigénesis ha sido apoyada por la demostración de que la inestabilidad genética que caracteriza MMP + cánceres gastrointestinales se pueden orientar a corto tractos repetitivas dentro de la región de codificación de genes importantes para la supervivencia y la proliferación celular. mutaciones de inserción /deleción fueron encontrados en los genes para el receptor de factor de crecimiento transformante de tipo beta-II (TGFß1-RII
), el receptor de insulina como factor de crecimiento de tipo II (IGFIIR
), el ADN genes reparadores de desajustes hMSH3 Opiniones y hMSH6, España el gen proapoptótico BAX
y el factor de transcripción E2F-4
[14-18]. En todos los casos, con la excepción de la E2F-4, Francia El nucleótidos de inserción /deleción dio lugar a mutaciones de cambio y el truncamiento de proteínas. Aunque la importancia biológica de estas alteraciones no se ha establecido completamente, se propuso que la ausencia de receptores TGFß1-RII de la superficie de las células epiteliales gastrointestinales podría eliminar el control de crecimiento negativo de TGF-β, dando lugar a un crecimiento celular incontrolado [19]. IGFIIR tiene un papel en la supresión del crecimiento mediante la unión y la activación del complejo receptor TGFß1 y por mediación de la internalización, con la degradación posterior, del factor de crecimiento IGF-II [20, 21]. BAX
promueve la apoptosis y se informó de que BAX
inactivación conduce a un crecimiento rápido del tumor [22]. Los genes humanos hMSH3 y hMSH6
¿Cuáles son homólogas a las MutS bacteriana
genes cuyos productos se unen los desajustes de ADN para iniciar la reparación específica de cadena de errores en la replicación del ADN [23]. Las mutaciones somáticas y germinales en hMSH6
se asociaron con + carcinomas colorrectales esporádicos y MMP HNPCC [6].
Hemos encontrado previamente que la BLM
gen también puede ser un objetivo de MSI [24]. Los desplazamientos del marco, que se encuentran en una repetición corta poli-adenina, se predijo para generar una proteína BLM truncado y no funcional. mutaciones homocigotas o heterocigotas compuestas en el gen BLM
, se mostró a hacer que el síndrome de Bloom (BS; OMIM 210900), una condición pre-maligna caracterizada por la inestabilidad cromosómica y una mayor tasa de mutación. pacientes BS están predispuestos a una amplia variedad de neoplasias diagnosticados en edad temprana. Cabe destacar, entre 100 neoplasias registradas en el Registro BS, 19 eran gastrointestinal (esófago, estómago y colon) y sólo dos fueron diagnosticados después de los 40 años [25]. Estos datos indican que las mutaciones en el gen BLM
pueden promover la tumorigénesis
a definir mejor el papel de la BLM
en la tumorigénesis gastrointestinal que examinaron un grupo de MMP + y carcinomas gástricos MMP (GC) para: a.) desplazamientos del marco de la BLM
codificación de microsatélites región y b) para posibles asociaciones con otros desplazamientos del marco intragenic
. resultados
MSI estado
para el presente estudio, nuestro panel de 50 GC contiene 15 MMP + tumores con MSI al dos o más loci (Tabla 2) y 35 GCs MMP con la alteración en uno de microsatélites (4 tumores) o sin MSI (31 tumores). Todos los casos fueron MMP + BAT 26 positivos, 25 y BAT inestabilidad se encontró en 13 de los 15 casos (excepto en los casos 67R y 27P). Las características clínico-patológicas de los tumores de MMP + se describen en la Tabla 1. El fenotipo MMP + estaba estrechamente asociado con una etapa de baja pTNM y con metástasis ganglionares menos prevalentes (p = 0,02 yp = 0,001 en la prueba exacta de Fisher, respectivamente, frente a
MMP-tumores). Dentro del grupo de MMP +, se encontró un exceso de tumores en etapas tempranas y sin metástasis en los ganglios linfáticos (10/15 casos vs. 10/32 casos de MMP-casos, p = 0,02 y 11/15 casos frente a 7/32 casos de MMP casos, p = 0,001, respectivamente), datos que apoyan la propuesta de mejor pronóstico de los GC MMP + [33, 34]. Es de destacar que no se encontró más de tipo intestinal entre los tumores de MMP + (12/15 casos vs.
20/32 de MMP-casos) (Tabla 1), los datos de acuerdo con estudios recientes que muestran ninguna diferencia significativa en la frecuencia de MSI en el tipo intestinal y de tipo difuso carcinomas [26, 35] parámetros .Tabla 1 histotype y puesta en escena asociados con el fenotipo de MMP en nuestra GCSA
variable
Número de pacientes
P valorB
total (%)
MMP + (%)
MMP - (%)
histotype
intestinal
32 (68,0) página 12 (37,5)
20 (62,5)
difusa + Mixed
15 (32,0) página 3 (20,0) página 12 (80,0)
NSc
T (profundidad de la infiltración de la pared)
T1 + T2 página 12 (25,5) página 6 (50,0) página 6 (50,0)
T3 + T4
35 (74,5 ) página 9 (25,7)
26 (74,3)
NS
N (ganglios linfáticos)
N0
18 (38,3) página 11 (78,5) página 7 (21.5)
N +
29 (61,7) página 4 (12,1) (87,9
25) guía
= 0,001 M (metástasis)
M0
40 (85,1 ) página 14 (35,0)
26 (65,0)
M + página 7 (14,9)
1 (14.2) página 6 (85,8)
NS
Staging
I + II
20 (42,5)
10 (58,8)
10 (41,2)
III + IV
27 (57,5) página 5 (16,6)
22 ( 83,4) = 0,02

Totala
47
15
32
a - estaban disponibles para 47 de los 50 casos b - los datos en la prueba exacta de Fisher c - NS = no significativo estadísticamente
Cuadro 2 Situación de los microsatélites de codificación dentro de BLM, WRN, RECQL, CBL, hMSH6, hMSH3, IGFIIR, TGF-βRII Opiniones y BAX
genes en la serie de los carcinomas gástricos con fenotipo mutador de microsatélites.
Case

Histotypea

Stagingb


BLM

WRN

REQL

CBL

hMSH6

hMSH3

IGFIIR

TGF-βRII

BAX

No.



MSIc

(A)9

(A)8

(A)9

(ATG)6

(C)8

(A)8

(G)8

(A)10

(G)8

31R
I
I(T2N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
57R
I
IV(T3N1M1)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
63R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
+
-
-
+
+
67R
I
I(T2N0M0)
4/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
69R
D
II(T3N0M0)
4/5
+
-
-
+
+
+
-
+
+
79R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3P
I
II(T3N0M0)
4/7
+
-
-
-
-
-
-
-
+
11P
I
III(T3N1M0)
3/7
+
-
-
-
-
+
+
+
-
14P
M
II(T3N0M0)
6/7
+
-
-
+
+
-
-
+
+
17P
I
II(T3N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
19P
D
III(T3N1M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
27P
I
IV(T4N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
30P
I
I(T2N0M0)
3/6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
37P
I
I(T2N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
38P
I
III(T3N2M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
%
present estudio (número de casos): perfil del 27%
0% 0%

13%
20% 13%
página 7%
60%
27 %
mutaciones
(4/15) gratis (0/15) gratis (0/15) gratis (2/15) gratis (3/15) gratis (2 /15) gratis (1/15) gratis (9/15) gratis (4/15)
reportado en la literatura (en GC) d CD - CD - CD - -
22-52% 19-64%

19-24% 42-83%

15-64%
a - I = tipo intestinal; D = tipo difuso; M = tipo mixto b - según la clasificación TNM (Sobin y Wittekind, 1997) c - número de inestabilidad de microsatélites /probado Total D - datos compilados a partir de las referencias: [17,27,42,50,51,52]
BLM frameshifts
PCR de amplificación de la BLM
microsatélites reveló bandas anormales, ausentes en los ADN pareados normales, en 4 de los 15 tumores de MMP + (27%) (Fig. 1). Hemos confirmado por secuenciación que las bandas anormales son causados ​​por una deleción de un residuo de adenina en el tracto poli-adenina (reducción de nueve a ocho adeninas), como se muestra anteriormente [24]. La frecuencia de mutaciones en el BLM
puede ser una estimación a la baja, ya que se han excluido los casos en los que las bandas anormales en los ADN de tumor eran notablemente más débil que los normales, posiblemente como consecuencia de una gran contaminación del tumor con células no malignas o de un bajo porción de las células malignas que muestran la anomalía (Fig. 1). Puesto que ningún
BLM mutación se observa en MMP tumores, las mutaciones de cambio en el gen BLM
parecen asociarse específicamente con tumores gástricos (MMP + probabilidad de P < 0,01 en la prueba exacta de Fisher), similar a la anterior bienestar alteraciones documentadas en TGFß1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6 Opiniones y BAX
genes [14, 16, 17, 32]. Por lo tanto, nuestros datos amplían el repertorio de genes alterados asociados a carcinomas gástricos MMP +. Figura 1 Ejemplos representativos de las mutaciones detectadas en los microsatélites en regiones codificantes de genes. El número de casos se muestran encima de cada juego normales (N) y pares de ADN tumoral (T). Las flechas indican las bandas anormales. Tenga en cuenta que no hemos considerado muestras mutadas donde las bandas anormales eran muy débiles (como en el BLM Opiniones y BAX
genes de 30P muestra de tumor). Debido a la tendencia de Taq polimerasa para añadir un nucleótido adicional en el extremo de los fragmentos de ADN sintetizados, los productos PCR a veces aparecen como bandas dobles. Con la excepción de BAX
desplazamiento del marco en el tumor 69R, ninguna otra mutación parece ser homocigótico. Sin embargo, conociendo la relación de células malignas en la muestra de tumor, hemos indicado anteriormente que la BLM
mutación en 69R tumor también es homocigotos [24].
Marco de lectura en otros microsatélites y las relaciones con los desplazamientos del marco de BLM
CDRs el mismo panel de tumores de MMP + también se analizó para la presencia de marco de lectura en los microsatélites localizados en las regiones codificantes de otros ocho genes (Tabla 2). Hemos encontrado variación en la longitud de la secuencia en TGFß1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6 Opiniones y BAX
genes, toda informó anteriormente que ser alterado en los GC MMP +. Los datos acerca de la TGFß1-RII
estado para ocho (serie P en la Tabla 2) de los quince tumores se informó anteriormente [27]. Las frecuencias de mutación observados fueron comparables con los reportados previamente para todos estos genes, con la excepción de IGFIIR, España para que nos pareció un bajo porcentaje de desplazamientos del marco (Tabla 2). Curiosamente, en comparación con
mutaciones BLM, solamente TGFß1-RII
marco de lectura fueron más frecuentes (60% vs. 27%, respectivamente) y BAX
marco de lectura eran así como frecuente (27%). Estos datos sugieren que el marco de lectura en BLM ¿Cuáles son alteraciones comunes en MMP + GC. Se observó una tendencia hacia una asociación entre las mutaciones en el BLM
y mutaciones en BAX Opiniones y hMSH3
y /o hMSH6 gratis (Tabla 2) (P = 0,05 en la prueba exacta de Fisher).
también hemos analizado la RECQL, WRN Opiniones y CBL
genes, que contienen repeticiones cortas en sus regiones codificantes. Los dos primeros genes son miembros de la misma familia de genes helicasa como BLM
[36, 37]. Mientras RECQL
no está asociado con ninguna enfermedad humana, las mutaciones en el gen WRN
son causa del síndrome de Werner (WS, OMIM 277700), un trastorno autosómico recesivo poco frecuente clínicamente caracterizado por el envejecimiento prematuro y aumento del riesgo de una variedad de las neoplasias, y genéticamente caracterizado por la inestabilidad genómica. CBL
es un receptor tirosina quinasa [38], cuya desregulación se asoció con la oncogénesis [39]. Hemos encontrado mutaciones sólo en el CBL
gen (Fig. 1). Se encontraron dos muestras (69R y 14P) para realizar una inserción de 3 pb en el trinucleótido (ATG) 6 repetición de la CBL
gen (datos no mostrados). Como hemos informado anteriormente [24], ya que no se produce ningún desplazamiento de marco, no tiene importancia funcional se puede inferir. Ambos se encontraron mutaciones en los cánceres que presentan también
desplazamientos del marco de BLM (Tabla 2). Es de destacar que este subconjunto de tumores muestran un exceso estadísticamente significativo de MSI en las regiones de codificación en comparación con el subconjunto MMP + sin BLM
alteraciones. (P < 0,001, en Χ prueba 2) (Tabla 2)
Discusión
Varios estudios han documentado que pueden existir vías alternativas en gastrointestinal MMP + y MMP-cánceres caracterizados por diferentes conjuntos de genes alterados [40]. Se propuso un modelo gradual de mutaciones de mutador ( "el mutador que muta el otro mutator") para definir el mutator frente a las vías de supresores de tumores gastrointestinales [41]. Mediante el análisis del tiempo de los eventos mutacionales en los GC genéticamente inestables, se propuso que los primeros objetivos de la deficiencia de reparación de genes son los tractos de mononucleótidos de TGFß1-RII Opiniones y BAX. México La mutaciones de cambio de hMSH3 Opiniones y hMSH6
parecen ser las lesiones de reparación desajuste secundarias, las cuales generan mutaciones en IGFIIR
[42]. El hallazgo de que las mutaciones de cambio en TGFß1-RII ¿Cuáles son los más frecuentes y la IGFIIR ¿Cuáles son las menos frecuentes en los tumores gástricos MMP + es compatible con el modelo en el que los primeros eventos deben estar presentes en la mayoría de los tumores y mutaciones finales de los años solamente en una fracción menor [43]. Este hallazgo se confirma también en nuestro estudio (Tabla 2). BLM
mutaciones frameshift están asociados más frecuentemente con alteraciones primer y segundo pasos propuestos en este modelo, lo que sugiere que son secundarias para los desfases de defectos de reparación (en hMSH3
y /o hMSH6
) presente en las células que no lo hacen someterse a la apoptosis (posiblemente como consecuencia de BAX
inactivación). Digno de mención, en el caso 3P, además de BLM, España el único marco de lectura se encuentran en BAX (ver
figura 1) y p53 gratis (datos no mostrados) los genes, lo que sugiere que, en algunos casos, BLM
alteración puede ocurrir sin hMSH3
y /o hMSH6
mutaciones, en células con p53 vía anormal mediada por apoptosis respuesta a la falta de coincidencia de ADN.
La participación de BLM
en la tumorigénesis fuera de los pacientes parece BS concebible, ya que este gen parece actuar como un cuidador. BLM
mutaciones son conocidos por causar un aumento de la inestabilidad genómica que se caracteriza por un elevado número de roturas cromosómicas, brechas y reordenamientos y por un excesivo número de mutaciones en ambas regiones codificantes y no codificantes, probablemente originadas por el intercambio de cromátidas hermanas desigual, rasgo característico del síndrome de Bloom [44, 45]. En consecuencia, BS exhibe una combinación de inestabilidad genómica y el riesgo elevado de cáncer, una asociación encuentra también en otras enfermedades causadas por defectos en los genes de vigilancia de inmuebles (como HNPCC, WS, la ataxia-telangiectasia y xeroderma pigmentoso). De manera similar a las mutaciones encontradas en BS, los desplazamientos del marco descritos en GCs abolir la función de la helicasa de la proteína BLM [24]. proteína BLM tiene un ADN probada anulación actividad [46] y podría estar implicado en procesos que están perturbados en las células malignas, como la replicación del ADN, la recombinación, la segregación de cromosomas, la reparación del ADN y la transcripción. De hecho, el gen de la levadura de fisión BLM
homólogo (radl2
+ /rqhl
+) fue demostrado que regulan la fase S de control y fue propuesto a la integridad cromosómica par con la progresión del ciclo celular [47, 48]. Sin embargo, el hallazgo de BLM
mutaciones en los tumores de MMP + genera una paradoja: BLM
mutaciones se prevé que genere inestabilidad cromosómica, mientras que la mayoría de los tumores son MMP + diploide. Sin embargo, algunos tumores de MMP + son aneuploides y BLM
mutaciones de pérdida de función pueden tener consecuencias pleiotrópicos, afectando posiblemente también la vía de la inestabilidad de microsatélites, como sugiere la descripción de un aumento de mutaciones dentro de genes en el síndrome de Bloom [44, 45 ]. En suppoprt a nuestra sugerencia es la constatación de que se ha encontrado que BLM
está mutado en la línea celular LoVo, una línea celular de cáncer de colon con dos microsatélites y inatability cromosómica [43]. Mucho más, se informó recientemente que SGS1
gen, la Saccharomyces cerevisiae
homólogo de BLM y WRN
, España suprime la inestabilidad del genoma y la recombinación homeologous y es redundante con la reparación de ADN no coinciden (MMR) para suprimir reordenamientos cromosómicos brutos y para la supresión de la recombinación entre secuencias de ADN divergentes [49].
Conclusiones
Nuestros resultados indican que la BLM
marco de lectura son alteraciones frecuentes en los GC y se asocian específicamente con tumores MMP + que muestran al menos 2 inestabilidad de microsatélites. Las mutaciones en el BLM
parecen estar asociados con frecuencia con el marco de lectura en BAX Opiniones y en hMSH6
y /o hMSH3, España y los tumores con BLM
alteraciones presentar una serie de repeticiones de trinucleótidos mono y inestables situado en regiones significativamente mayor que la observada en los tumores de MMP + sin BLM
marco de lectura de codificación. Sugerimos que BLM
pérdida de la función por MSI en tumores gástricos es un evento mutacional intermedia, lo que puede aumentar la inestabilidad de un genotipo inestable preexistente.
Métodos
muestras tumorales
Cincuenta tumores gástricos primarios y se seleccionaron los tejidos normales emparejados (sangre o mucosa gástrica normal) sobre la base de ADN a disposición de un panel de 80 tumores gástricos (27, Calin G y M Negrini datos no publicados). Cuando sea posible, las áreas de tejido tumoral con células inflamatorias o mínimos estroma mínimo, o ambos, fueron seleccionados para obtener una carga de la célula neoplásica mayor que 50%. Todos los casos se identificaron histológicamente como adenocarcinomas. Histotype (según la clasificación de Lauren) [28] y puesta en escena (según la clasificación TNM) [29] fue conocido por 47 de los 50 casos (94%) (tabla 1). Treinta y dos casos eran de histotype intestinal y 15 casos de difuso o de tipo mixto. Veinte tumores se organizaron I o II, mientras que 27 se encontraban en estadio III o IV. En cuanto al estado de los ganglios linfáticos, dieciocho casos hubo y 29 fueron N-positivo. Ninguno de los pacientes había desarrollado un cáncer a una edad temprana, y ninguno tenía un historial familiar sugerente de la predisposición genética al cáncer. Los ADN de alto peso molecular se aisló utilizando los procedimientos establecidos [30]
Evaluación de MSI
MSI se reveló con dos conjuntos de marcadores anónimos en loci:. (I) D11S1778, D11S1328, D11S922 y D11S1318

[24] o (ii) D2S177, D3S1076, D5S433, D11S904, D17S796 y D18S59

[27]. Los cebadores para estos loci microsatélites dinucleótido se obtuvieron a partir de la información disponible a través de la Base de Datos del Genoma. Las amplificaciones por PCR se llevaron a cabo como se describe anteriormente [24, 27]. Para todas las muestras el BAT25
y BAT26
microsatélites se analizaron mediante amplificación por PCR como se describe [31]. MSI se evaluó si un cambio de la movilidad de los productos de PCR a partir de ADN tumoral en comparación con se identificó el homólogo normal. Sólo los tumores con al menos 2 MSI (> 30% de los microsatélites analizados). Se consideraron MMP +
La amplificación de los microsatélites en BLM y en otras regiones codificantes (CDR) México La (A) 9 microsatélites ubicados en la posición 1610- 1618 de BLM
secuencia de ADNc se analizó para todas las muestras pareadas. En pocas palabras, el microsatélite se amplificó por PCR usando 50 ng de ADN plantilla, 1 M de cada cebador, 1,5 mM de MgC12, 50 mM cada uno de dATP, dGTP, y dTTP y 5.0 M de dCTP, 0,1 unidades de Taq ADN polimerasa, y 1 Ci [α33P] dCTP en 10 l de volumen de reacción. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo para un ciclo de 94 ° C durante 5 min seguido de 35 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s. Los productos PCR de ADN correspondientes de control del tumor y se cargaron en paralelo el 6% en geles de secuenciación de acrilamida y se expusieron durante la visualización por autorradiografía en películas Kodak X-AR. La detección de mutaciones en los microsatélites localizados en las CDR de otros ocho genes (la (A) 10 en TGFß1-RII, Francia El (G) 8 en IGFIIR, España el (G) 8 en BAX, España el (a) 8 en hMSH3, Francia el (C) 8 en hMSH6, España (a) 9 en RECQL, España (a) 8 en WRN, España y el (ATG) en 6 CBL
) se llevó a cabo como se describe anteriormente [14, 16, 17, 24, 32]. Para la verificación, cada PCR se repitió al menos dos veces. Un alelo mutado se representa por un desplazamiento de banda de 1 a 3 pares de bases de la banda normal con intensidad comparable o mayor que la de la banda de tipo salvaje (Fig. 1).
Secuenciación de los productos anormales
fragmentos de ADN genómico que presentan cambios de la banda se reamplificaron en las mismas condiciones excepto por la omisión de dCTP marcado. Antes de la secuenciación, los productos de PCR fueron purificados ya sea directamente o después de la separación en un gel de agarosa al 2%, utilizando kits de purificación de Qiagen. Ambas hebras de ADN se secuenciaron usando los cebadores de PCR y una estación de secuenciación automatizado Applied Biosystem 377. Las secuencias de nucleótidos fueron analizados utilizando el Wisconsin (GCG) versión de paquete de programas Unix 8.1. Se realizó análisis estadístico
Francia El análisis estadístico de los resultados usando el Χ 2 o la prueba exacta de Fisher. AP valor de
. ≪ 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Declaraciones
Reconocimiento
Este trabajo fue apoyado por becas de la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) y en parte por el contrato CE BIOMED BMH4-CT95-0914. GC fue apoyado por una beca de Formación de Investigación de la IARC.
Los autores originales presentados archivos de imágenes
A continuación se presentan los enlaces a los archivos de los autores presentados original para imágenes. 12863_2001_18_MOESM1_ESM.png archivo original de los autores de la figura 1

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