Somatiske rammeskifte mutasjoner i Bloom syndrom BLM genet er hyppige i sporadiske magekreft med mikro mutator fenotype

Somatiske rammeskifte mutasjoner i Bloom syndrom BLM
genet er hyppige i sporadiske magekreft med mikro mutator fenotype
Abstract
Bakgrunn
Genomisk ustabilitet har blitt rapportert på mikro traktater i noen sekvenser. Vi har vist at Bloom syndromet BLM
gen kan være et mål for microsatelliteinstability (MSI) i en kort poly-adenin gjenta befinner seg i sin kodende region. For ytterligere å karakterisere involvering av BLM
i tumorigenesis, har vi undersøkt mutasjoner i ni gener som inneholder koder mikro i mikro mutator fenotype (MMP) positive og negative mage karsinom (GCer).
Metoder
Vi analyserte 50 gastric Kreftsvulster (GCS) for mutasjoner i BLM
poly (A) kanalen så vel som i de kodende mikro av TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6, BAX, WRN, RECQL Hotell og CBL
gener. Search Results
BLM
mutasjoner ble funnet i 27% av MMP + GCer (4/15 tilfeller), men ikke i noen av MMP negative GCer (0/35 tilfeller). Frekvensen av mutasjoner i de andre åtte kodende områder mikro var følgende: TGFβ1-RII product: (60%), BAX plakater (27%), hMSH6 plakater (20%), hMSH3 plakater (13 %), CBL plakater (13%), IGFIIR plakater (7%), RECQL product: (0%) og WRN product: (0%). Mutasjoner i BLM
synes å være oftere assosiert med frameshifts i BAX
og i hMSH6 Hotell og /eller hMSH3.
Svulster med BLM
endringer presentere en høyere frekvens av ustabile mono- og trinucleotide gjentar ligger i koding regioner sammenlignet med mutator fenotype svulster uten BLM
frameshifts.
Konklusjoner
BLM
frameshifts er hyppige endringer i GCer spesifikt knyttet til MMP + svulster. Vi foreslår at BLM
tap av funksjon av MSI kan øke genetisk ustabilitet av en pre-eksisterende ustabil genotype i mage svulster.
Bakgrunn
Kreft er en progressiv genetisk sykdom karakterisert ved progressiv opphopning av mutasjoner i både koding og ikke-kodende sekvenser [1]. Enkel sekvensen gjentas eller mikro er svært ustabil i noen menneskelige svulster, identifisere en klasse av svulster med mikro mutator fenotype (MMP +) (for oversikt se [2]). MMP + ve status er definert ved ustabilitet i mer enn 30% av mikro analised, inkludert minst en mononukleotid (for eksempel BAT26 eller BAT25) [3]. Mikrosatelitt ustabile (MSI) er blitt beskrevet som en hyppig genetisk endring i forskjellige humane solide svulster inkludert sporadiske og familiære gastrisk karsinom (GCS). I nesten alle pasienter med arvelig nonpolyposis tykktarmskreft (HNPCC), har molekylære studier vist at MSI er forårsaket av germline mutasjoner i gener som koder for proteiner som kreves for DNA mismatch reparasjon (MMR) [4]. Gener som hMSH2, hMLH1, PMS1, PMS2 Hotell og hMSH6 /GTBP product: [5-8], ble definert som "vaktmester" fordi når forstyrret, de favoriserer kjøp av mutasjoner ved høy frekvens i flere gener inkludert onkogener og tumorsuppressorgener [9]. Imidlertid, i en betydelig del av sporadisk MMP + tumorer, mutasjonsanalyse er ikke tillatt identifikasjon av gener som er ansvarlige for MSI [2, 10], som tyder på at i slike tilfeller kan MSI være forårsaket av epigenetiske mekanismer. Faktisk ble genet Slå av arrangøren hypermethylation nylig vist for hMLH1
genet [11-13].
Betydningen av MSI i tumorigenesis har vært støttet av demonstrasjonen at den genetiske ustabiliteten karakter MMP + gastrointestinale kreftformer kan målrette kort repeterende traktene innenfor den kodende regionen av gener som er viktige for celle overlevelse og proliferasjon. Innsetting /delesjonsmutasjoner ble funnet i genene for den transformerende vekstfaktor-beta type II reseptor (TGFβ1-RII
), insulin-lignende vekstfaktor type II reseptor (IGFIIR
), DNA mismatch-reparasjonsgener hMSH3 Hotell og hMSH6, etter apoptosiske genet BAX Hotell og transkripsjonsfaktoren E2F-4 product: [14-18]. I alle tilfeller, med unntak av E2F-4,
nukleotidene innsetting /sletting resulterte i rammeskiftmutasjoner og protein avkutting. Selv om den biologiske betydning av disse endringene ikke er fullt etablert, ble det foreslått at fravær av TGFβ1-RII-reseptorer fra overflaten av gastrointestinale epitel-celler kunne eliminere den negative vekstkontroll av TGF-β, noe som fører til ukontrollert cellevekst [19]. IGFIIR har en rolle i veksthemming ved å binde og aktivere TGFβ1 reseptor-komplekset og ved formidling av internalisering, med påfølgende nedbrytning av det vekstfaktor IGF-II [20, 21]. BAX
fremmer apoptose, og det ble rapportert at BAX
inaktivering fører til rask tumorvekst [22]. De menneskelige gener hMSH3 Kjøpe og hMSH6
er homologe til de bakterielle muts
gen hvis produkter binde DNA uoverensstemmelser for å starte tråd spesifikke reparasjon av DNA replikering feil [23]. Somatiske og germline mutasjoner i hMSH6
ble assosiert med sporadiske MMP + kolorektal karsinom og HNPCC [6].
Vi har funnet tidligere at BLM
genet kan også være et mål for MSI [24]. De frameshifts, som finnes i en kort poly-adenin repeat, ble spådd å generere en avkortet og ikke-fungerende BLM protein. Homozygot eller compound heterozygote mutasjoner på BLM
genet ble vist å føre til at Bloom syndrom (BS, OMIM 210900), en pre-ondartet tilstand karakterisert ved kromosom ustabilitet og økt mutasjonshastigheten. BS pasientene er disponert for en rekke neoplams diagnostisert i tidlig alder. Verdt å merke seg, blant 100 svulster registrert i BS registeret, 19 var gastrointestinale (spiserør, mage og tykktarm) og bare to ble diagnostisert etter fylte 40 [25]. Disse data indikerer at mutasjoner i genet BLM
kan fremme tumorigenesis
For bedre å definere rolle BLM
i gastrointestinal tumorigenesis vi vist et panel av MMP + og MMP- gastriske karsinomer (GCer) for: a.) frameshifts i BLM
kodende region mikro og b) for mulige sammenhenger med andre intragenic frameshifts.
Resultater
MSI status
for denne studien, vårt panel av 50 GCer inneholder 15 MMP + svulster med MSI på to eller flere loci (tabell 2) og 35 GCer MMP- med forandring i den ene mikro (4 tumorer) eller uten MSI (31 tumorer). Alle MMP + tilfellene var BAT 26 positive, og BAT 25 ustabilitet ble funnet i 13 av 15 tilfeller (unntatt tilfeller 67R og 27P). De klinisk-patologiske trekk ved MMP + tumorer, er beskrevet i tabell 1. Den MMP + fenotypen var nært knyttet til en lav pTNM trinn og med en mindre utbredte nodal metastaser (p = 0,02 og p = 0,001 ved Fisher eksakte test, respektivt, sammenlignet med
MMP-svulster). Innenfor MMP + gruppen ble et overskudd av svulster i tidlige stadier og uten lymfeknutemetastase funnet (10/15 tilfeller vs 10/32 tilfeller av MMP- tilfeller, p = 0,02 og 11/15 tilfeller vs 7/32 tilfeller av MMP- tilfeller, p = 0,001, henholdsvis), data som støtter den foreslåtte bedre prognostisk av GCer MMP + [33, 34]. Av notatet, ble det ikke utover intestinal typen blant MMP + svulster funnet (12/15 tilfeller vs.
20/32 av MMP- tilfeller) (tabell 1), data i henhold til nyere studier viser ingen signifikant forskjell i hyppigheten av MSI i intestinal-type og diffuse-type karsinom [26, 35] .table en Histotype og iscenesettelse parametere knyttet til MMP fenotype i vår GCsa
Variable <.no> Antall pasienter
P valueB
Totalt (%)
MMP + (%)
MMP - (%)
Histotype
Tarm
32 (68,0)
12 (37,5)
20 (62,5)
Diffuse + Blandet
15 (32,0)
3 (20,0)
12 (80,0)
NSC
T (dybde på veggen infiltrasjon)
T1 + T2
12 (25,5)
6 (50,0)
6 (50,0)
T3 + T4
35 (74.5 )
9 (25,7)
26 (74,3)
NS
N (lymfeknute status)
N0
18 (38,3)
11 (78,5)
7 (21.5)
N +
29 (61,7)
fire (12,1)
25 (87,9)
= 0,001
M (metastaser)
M0
40 (85,1 )
14 (35,0)
26 (65,0)
M +
7 (14,9)
1 (14,2)
6 (85,8)
NS
Staging
I + II
20 (42,5)
10 (58,8)
10 (41,2)
III + IV
27 (57,5)
5 (16,6)
22 ( 83,4)
= 0.02
totala
47
15
32
a - data var tilgjengelige for 47 av 50 tilfeller b - på Fisher eksakt test c - NS = ikke statistisk signifikant
Tabell 2 Status for koding mikro innenfor BLM, WRN, RECQL, CBL, hMSH6, hMSH3, IGFIIR, TGF-βRII Hotell og BAX
gener i serien av magekreft med mikro mutator fenotype.
Case

Histotypea

Stagingb


BLM

WRN

REQL

CBL

hMSH6

hMSH3

IGFIIR

TGF-βRII

BAX

No.



MSIc

(A)9

(A)8

(A)9

(ATG)6

(C)8

(A)8

(G)8

(A)10

(G)8

31R
I
I(T2N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
57R
I
IV(T3N1M1)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
63R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
+
-
-
+
+
67R
I
I(T2N0M0)
4/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
69R
D
II(T3N0M0)
4/5
+
-
-
+
+
+
-
+
+
79R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3P
I
II(T3N0M0)
4/7
+
-
-
-
-
-
-
-
+
11P
I
III(T3N1M0)
3/7
+
-
-
-
-
+
+
+
-
14P
M
II(T3N0M0)
6/7
+
-
-
+
+
-
-
+
+
17P
I
II(T3N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
19P
D
III(T3N1M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
27P
I
IV(T4N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
30P
I
I(T2N0M0)
3/6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
37P
I
I(T2N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
38P
I
III(T3N2M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
%
present studie (antall tilfeller)
27%
0%
0%
13%
20%
13%
7%
60%
27 %
mutasjoner
(4/15) product: (0/15) product: (0/15) product: (2/15) product: (3/15) plakater (2 /15) plakater (1/15) product: (9/15) product: (4/15)
rapportert i litteraturen (i GCer) d -
-
- -
22-52%
19-64%
19-24%
42-83%
15-64%
a - I = intestinal type; D = diffus type; M = blandet type b - i henhold til TNM klassifisering (Sobin og Wittekind, 1997) c - antall ustabile /total testet mikro d - data samlet fra referansene: [17,27,42,50,51,52]
BLM frameshifts
PCR-amplifikasjon av BLM
mikro viste unormale band, fraværende i de normale matchet DNA, i fire av de 15 MMP + tumorer (27%) (fig. 1). Vi har bekreftet ved sekvensering som unormal båndene er forårsaket av en delesjon av en adeninrest i poly-adenin-tarmkanalen (reduksjon fra ni til åtte adenines), som tidligere er vist [24]. Mutasjonen frekvens i BLM
kan være et lavt anslag, siden vi har utelukket tilfeller hvor unormale band i tumor-DNA ble særlig svakere enn de normale seg, muligens som følge av en stor forurensning av tumor med ikke-ondartede celler eller fra et lavt del av maligne celler som viser abnormitet (fig. 1). Siden ingen BLM
mutasjon ble observert i MMP- tumorer, rammeskiftmutasjoner i BLM
genet ser ut til å være spesielt forbundet med gastrisk MMP + tumorer (sannsynlighet P < 0,01 ved Fisher eksakte test), lik den foregående vel- dokumenterte endringer i TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6 Hotell og BAX
gener [14, 16, 17, 32]. Derfor våre data utvide repertoaret av endrede gener assosiert med MMP + mage karsinom. Figur 1 Representative eksempler på mutasjoner påvist i mikro på genet som koder regioner. Saksnummer er vist over hver samsvarende normal (N) og tumor (T) DNA-par. Pilene viser unormale band. Merk at vi ikke har vurdert muterte prøver der unormale band var veldig svak (som i BLM Hotell og BAX
gener av tumorprøve 30P). På grunn av tendensen til Taq-polymerase for å legge til en ekstra nukleotid i enden av de syntetiserte DNA-fragmentene, PCR-produkter synes noen ganger som dobbeltbånd. Med unntak av BAX
rammeskifte i tumor 69R, vises ingen annen mutasjon å være homozygot. Men ved å vite forholdet mellom ondartede celler i tumorprøve, vi har tidligere indikert at BLM
mutasjon i tumor 69R er også homozygot [24].
Frameshifts i andre CDR mikro og relasjoner med BLM frameshifts
det samme panel av MMP + tumorer ble også analysert for tilstedeværelse av frameshifts i mikrosatellitter som ligger i de kodende regioner av åtte andre gener (tabell 2). Vi har funnet variasjon i sekvens lengde i TGFβ1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6 Hotell og BAX
gener, alle tidligere rapportert som skal endres i MMP + GCer. Data om den TGFβ1-RII
status for åtte (P serie i tabell 2) av de femten tumorene ble tidligere rapportert [27]. De observerte mutasjonsfrekvenser var sammenlignbare med de som tidligere er rapportert for alle disse genene, med unntak av IGFIIR, etter som vi fant en lav prosentandel av frameshifts (tabell 2). Interessant, i sammenligning med BLM
mutasjoner, bare TGFβ1-RII
frameshifts var hyppigere (60% vs. 27%, henholdsvis) og BAX
frameshifts var samt hyppige (27%). Disse dataene antyder at frameshifts i BLM
er vanlige endringer i MMP + GCer. En trend mot en sammenheng mellom mutasjoner i BLM
og mutasjoner i BAX Hotell og hMSH3
og /eller hMSH6
ble observert (tabell 2) (P = 0,05 ved Fisher eksakt test).
Vi har også analysert RecQL, WRN Hotell og CBL
gener, som inneholder korte repetisjoner i sine kodende områder. De første to gener er medlemmer av den samme helicase-genfamilien som BLM product: [36, 37]. Mens RecQL
ikke er knyttet til noe menneskelig sykdom, mutasjoner i WRN
genet er årsaken til Werner syndrom (WS; OMIM 277700), en sjelden autosomal recessiv lidelse klinisk preget av tidlig aldring og økt risiko for en rekke av neoplasmer, og genetisk karakterisert ved genomisk instabilitet. CBL
er en tyrosin-kinase-reseptor [38], hvis deregulering ble forbundet med onkogenese [39]. Vi har funnet mutasjoner bare i CBL
-genet (Fig. 1). To prøver (69R og 14P), ble funnet å bære en 3 bp innsetting i trinukleotidet (ATG) 6 gjentagelse av CBL
-genet (data ikke vist). Som vi tidligere har rapportert [24], siden ingen rammeskifte blir produsert, ingen funksjonell konsekvens kan utledes. Begge mutasjoner ble funnet i kreft viser også BLM
frameshifts (tabell 2). Det er bemerkelsesverdig at denne undergruppe av svulster viser en statistisk signifikant økning av MSI i kodende regioner sammenlignet med MMP + undergruppe uten BLM
forandringer. (P < 0,001, ved Χ 2-test) (tabell 2)
diskusjon
Flere studier har dokumentert at alternative veier kan eksistere i gastrointestinal MMP + og MMP- kreft preget av ulike sett av endrede gener [40]. En gradvis modell av Mutator mutasjoner ( "den mutator som muterer den andre mutator") ble foreslått å definere mutator versus Lyddemper trasé i gastrointestinale svulster [41]. Ved å analysere timingen av mutasjons hendelser i genetisk ustabile GCer, ble det foreslått at de første målene for mismatch reparasjon mangel er mononukleotid områder med TGFβ1-RII Hotell og BAX.
Den rammeskifte mutasjoner av hMSH3 Hotell og hMSH6
synes å være sekundære mismatch reparasjon lesjoner, som genererer mutasjoner i IGFIIR product: [42]. Oppdagelsen av at rammeskifte mutasjoner ved TGFβ1-RII
er den hyppigste og IGFIIR
er de sjeldnere i mage MMP + svulster støtter til modellen der tidlige hendelser bør være til stede i de fleste svulster og sene mutasjoner bare i en liten brøkdel [43]. Dette funnet er også bekreftet i vår studie (tabell 2). BLM
rammeskifte mutasjoner er knyttet oftere med første og andre trinn endringer som foreslås i denne modellen, noe som tyder på at de er sekundære til mismatch reparasjon defekter (i hMSH3
og /eller hMSH6
) til stede i celler som ikke gjennomgår apoptose (muligens som følge av BAX
inaktivering). Verdt å merke seg, i tilfelle 3P, i tillegg til BLM, etter bare frameshifts ble funnet i BAX (se
figur 1) og p53 plakater (data ikke vist) gener, noe som tyder på at i noen tilfeller, BLM
endringer kan forekomme uten hMSH3 Hotell og /eller hMSH6
mutasjoner i celler med unormalt p53-mediert vei av apoptotisk respons på DNA mismatch.
involvering av BLM
i tumorigenesis utenfor BS pasienter synes tenkelig, ettersom dette genet ser ut til å virke som en vaktmester. BLM
mutasjoner er kjent for å forårsake en økt genomisk ustabilitet preget av forhøyet antall kromosom pauser, hull og rearrangements og med en overdreven antall mutasjoner i både koding og ikke-kodende regioner, trolig stammer av ulik søster-kromatid utveksling, karakteristiske trekk av Bloom-syndrom [44, 45]. Følgelig, BS oppviser en kombinasjon av genomisk instabilitet og forhøyet risiko for kreft, en forening finnes også ved andre sykdommer som forårsakes av defekter i vaktmester gener (for eksempel HNPCC, WS, ataxia-telangiectasia og xeroderma pigmentosum). I likhet med de mutasjoner som finnes i BS, de frameshifts beskrevet i GCer avskaffe helikasen funksjonen av proteinet BLM [24]. BLM protein har en påvist DNA avviklings aktivitet [46], og kan være involvert i prosessene som er forstyrret i maligne celler, slik som DNA-replikasjon, rekombinasjon, kromosom segregering, DNA-reparasjon og transkripsjon. Faktisk fisjons gjær BLM genet
homolog (radl2
+ /rqhl
+) ble vist å regulere S-fase sjekkpunkt og ble foreslått å par kromosom integritet med cellecyklusprogresjonen [47, 48]. Men funn av BLM
mutasjoner i MMP + svulster genererer et paradoks: BLM
mutasjoner er spådd å generere kromosomal instabilitet mens de fleste av MMP + svulster er diploid. Likevel, noen MMP + svulster er aneuploid og BLM
tap-av-funksjon mutasjoner kan ha pleiotrope konsekvenser, muligens påvirker også mikro ustabilitet vei, som foreslått av beskrivelsen av en økt intra-genmutasjoner i Bloom syndrom [44, 45 ]. I suppoprt til vårt forslag er det funn at vi har funnet at BLM
er mutert i LoVo cellelinje, en tykktarmskreft cellelinje med både mikro og kromosomalt inatability [43]. Mye mer, var det nylig rapportert at SGS1
genet, Saccharomyces cerevisiae
homolog av BLM Hotell og WRN, undertrykker
genom instabilitet og homeologous rekombinasjon og er overflødig med DNA mismatch reparasjon (MMR) for å undertrykke brutto kromosomavvik rearrangements og for å undertrykke rekombinasjon mellom avvikende DNA-sekvenser [49].
Konklusjoner
Våre resultater indikerer at BLM
frameshifts er hyppige endringer i GCer og er spesielt knyttet til MMP + svulster som viser minst 2 ustabile mikro. Mutasjoner i BLM
synes å være ofte forbundet med frameshifts i BAX
og i hMSH6
og /eller hMSH3, etter og svulster med BLM
endringer presentere en rekke av ustabile mono- og trinucleotide gjentar ligger i koding regioner betydelig høyere enn det som ble observert i MMP + svulster uten BLM
frameshifts. Vi foreslår at BLM
tap av funksjon av MSI i mage svulster er en mellommutasjons hendelse, noe som kan øke ustabilitet av en pre-eksisterende ustabil genotype.
Metoder
tumorprøver
Femti primære mage svulster og deres normale parede vev (blod eller normal gastrisk mucosa) ble valgt på grunnlag av tilgjengelige DNA fra et panel av 80 mage-tumorer (27, Calin G og Negrini M upubliserte data). Når det er mulig, områder av tumorvev med minimal inflammatoriske celler eller minimal stroma, eller begge deler, ble valgt for å oppnå en neoplastisk celle last som er større enn 50%. Alle saker ble identifisert histopathologically som adenokarsinomer. Histotype (i henhold til Lauren klassifikasjon) [28] og iscenesettelse (i henhold til TNM klassifisering) [29] ble kjent for 47 av 50 tilfeller (94%) (tab 1). Trettito tilfeller var av tarm histotype og 15 tilfeller av diffuse eller blandet type. Tjue tumorer ble trinnvis I eller II, mens 27 var i stadium III eller IV. Når det gjelder lymfeknute status, atten tilfellene var NO og 29 ble N-positive. Ingen av pasientene hadde utviklet kreft i ung alder, og ingen hadde en familiehistorie som tyder på genetisk predisposisjon for kreft. Høymolekylære DNA ble isolert ved hjelp av etablerte prosedyrer [30]
Vurdering av MSI
MSI ble avslørt med to sett av anonyme markørene på loci. (I) D11S1778, D11S1328, D11S922 Hotell og D11S1318
[24] eller (ii) D2S177, D3S1076, D5S433, D11S904, D17S796 Kjøpe og D18S59 product: [27]. De primere for disse dinucleotide mikro loci ble hentet fra informasjon tilgjengelig gjennom Genome databasen. PCR-amplifikasjoner ble utført som tidligere beskrevet [24, 27]. For alle prøver den BAT25 Hotell og BAT26
mikro ble analysert ved PCR forsterkning som beskrevet [31]. MSI ble undersøkt om en mobilitetsforskyvning av PCR-produktene fra tumor-DNA sammenlignet med den normale motstykke ble identifisert. svulster kun med minst to MSI (> 30% av testede mikro). ble ansett MMP +
Forsterkning av mikrosatellitter i BLM og i andre kodende områder (CDR)
(A) 9 mikro plassert i posisjon 1610- 1618 av BLM
cDNA-sekvensen ble analysert for alle parede prøver. I korte trekk ble den mikro amplifisert ved PCR ved anvendelse av 50 ng templat-DNA, 1 uM av hver primer, 1,5 mM MgC12, 50 pM av hver av dATP, dGTP, og dTTP og 5,0 uM av dCTP, 0,1 enhet av Taq DNA-polymerase, og 1 pCi [α33P] dCTP i 10 ul reaksjonsvolum. PCR-reaksjoner ble utført i en syklus på 94 ° C i 5 minutter etterfulgt av 35 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 sek. PCR-produkter fra svulsten og tilhørende kontroll DNA ble lastet på parallelt på 6% akrylamid sekvense gels og utsatt for visualisering av autoradiografi på Kodak X-AR filmer. Påvisning av mutasjoner i mikro ligger i CDR fra åtte andre gener (det (A) 10 i TGFβ1-RII,
(G) 8 i IGFIIR, etter den (G) 8 i BAX, etter den (A) 8 i hMSH3,
(C) 8 i hMSH6, etter det (A) 9 i RecQL, etter det (A) 8 i WRN, etter og (ATG) 6 i CBL
) ble utført som tidligere beskrevet [14, 16, 17, 24, 32]. For verifisering, ble hver PCR gjentas minst to ganger. En mutert allel ble representert av et bånd skifte fra 1 til 3 bp fra det normale bånd med intensitet tilsvarende eller større enn den til villtype-bånd (fig. 1).
Sekvensering av unormale produkter
Genomisk DNA-fragmenter stiller bandet skift ble reamplifisert under de samme betingelser med unntak av utelatelse av merket dCTP. Før sekvensering ble PCR-produktene ble renset enten direkte eller etter separering i en 2% agarosegel ved bruk av Qiagen rensing kit. Begge DNA-trådene ble sekvensert ved hjelp av PCR-primere og en automatisert Applied Biosystems 377 sekvense stasjon. Nukleotidsekvenser ble analysert ved hjelp av Wisconsin (GCG) programpakken versjon Unix-8.1.
Statistisk analyse
statistisk analyse av resultatene ble utført ved hjelp av Χ 2 test eller Fishers eksakte test. AP
verdi. ≪ 0,05 ble ansett statistisk signifikant
Erklæringer
Erkjennelse
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) og dels fra EC BIOMED kontrakt BMH4-CT95-0914. GC ble støttet av en IARC Forskerutdanningsfellowship.
Forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes opprinnelige innsendte filer for bilder. 12863_2001_18_MOESM1_ESM.png Forfatteroriginalfilen for figur 1

• Abdominal migrene hos barn: Sammenhengen mellom gastrisk motilitet parametere og klinisk characteristics
• Anti-ulcerogent aktivitet av roten bark ekstrakt av det afrikanske gullregn "Cassia sieberiana" og dens effekt på antioksidant forsvar systemet hos rotter