Somatische frameshift mutaties in het Bloom syndroom BLM-gen zijn frequent in sporadische maagcarcinomen met microsatelliet mutator fenotype

Somatische frameshift mutaties in het Bloom syndroom BLM
gen zijn frequent in sporadische maagcarcinomen met microsatelliet mutator fenotype
Abstracte achtergrond
Genomische instabiliteit is gemeld bij microsatelliet stukken in een paar coderende sequenties. We hebben aangetoond dat de Bloom syndroom BLM
gen doelwit van microsatelliteinstability (MSI) in een korte poly-adenine repeat in het coderende gebied kan zijn. Om verder te karakteriseren de betrokkenheid van BLM
in het ontstaan ​​van tumoren, hebben we onderzocht mutaties in negen genen die coderen van microsatellieten in microsatelliet mutator fenotype (MMP) positieve en negatieve maagcarcinomen (GC).
Methods
We analyseerden 50 gastric carcinomen (GC) voor mutaties in de BLM
poly (A) kanaal gemaakt als in de coderende microsatellieten van TGFB1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6, BAX, WRN, RECQL Kopen en CBL
genen.
Resultaten
BLM
mutaties werden gevonden in 27% van de MMP + GC (4/15 gevallen), maar niet in een van de MMP negatieve GC (0/35 gevallen). De frequentie van mutaties in de andere acht coderende gebieden microsatelliet bedroegen: TGFB1-RII
(60%), BAX
(27%), hMSH6
(20%), hMSH3
(13 %), CBL
(13%), IGFIIR
(7%), RECQL
(0%) en WRN
(0%). Mutaties in BLM
blijken vaker geassocieerd met leesraamverschuiving in BAX Kopen en in hMSH6 Kopen en /of hMSH3.
Tumoren met BLM
wijzigingen geven een hogere frequentie van instabiele mono- en trinucleotide herhalingen in coderende gebieden ten opzichte van mutator fenotype tumoren zonder BLM
frameshifts.
Conclusies
BLM
leesraamverschuiving zijn frequente wijzigingen in GC specifiek geassocieerd met MMP + tumoren. Wij stellen voor dat BLM
functieverlies door MSI de genetische instabiliteit van een pre-existent instabiele genotype gastrische tumoren toenemen. Achtergrond
Kanker is een progressieve erfelijke ziekte die wordt gekenmerkt door progressieve accumulatie van mutaties in zowel coderende en niet-coderende sequenties [1]. Eenvoudige opeenvolging herhaalt of microsatellieten zijn zeer instabiel in sommige menselijke tumoren, het identificeren van een klasse van tumoren met de microsatelliet mutator fenotype (MMP +) (zie voor een overzicht [2]). MMP + ve status wordt gedefinieerd door instabiliteit in meer dan 30% van de geanalyseerde microsatellieten, ten minste één mononucleotide (zoals BAT26 en BAT25) [3]. Microsatelliet instabiliteit (MSI) is beschreven als een frequente genetische verandering in verschillende menselijke solide tumoren waaronder sporadische en familiale maagcarcinomen (GC). In bijna alle patiënten met erfelijke nonpolyposis colorectale kanker (HNPCC), hebben moleculaire studies aangetoond dat MSI door kiemlijn mutaties in genen die coderen voor eiwitten die nodig zijn voor DNA mismatch reparatie (MMR) [4]. Genen zoals hMSH2, hMLH1, PMS1, PMS2 Kopen en hMSH6 /GTBP
[5-8], werden gedefinieerd als "verzorgers", omdat, wanneer verstoord, zij het verwerven van mutaties op hoge frequentie genade in verschillende genen, waaronder oncogenen en tumorsuppressorgenen [9]. In een aanzienlijk deel van sporadische MMP + tumors, mutatieanalyse niet leidde tot de identificatie van de genen voor MSI [2, 10], wat suggereert dat in dergelijke gevallen kan MSI worden veroorzaakt door epigenetische mechanismen. In feite werd gene silencing door promotor hypermethylering onlangs aangetoond voor de hMLH1
gen [11-13]. Ondernemingen De betekenis van MSI in het ontstaan ​​van tumoren werd ondersteund door de demonstratie dat de genetische instabiliteit karakteriseren MMP + gastro-intestinale kankers short kunnen richten repetitieve stukken binnen het coderende gebied van genen die belangrijk zijn voor de overleving van de cel en proliferatie. Insertie /deletie mutaties gevonden in de genen voor de transformerende groeifactor-bèta type II receptor (TGFB1-RII
), insuline-achtige groeifactor type II receptor (IGFIIR
), de DNA-mismatch repair genen hMSH3 Kopen en hMSH6, of the pro-apoptotische gen BAX Kopen en de transcriptiefactor E2F-4
[14-18]. In alle gevallen, met uitzondering van de E2F-4,
de nucleotiden insertie /deletie resulteerde in frameshift mutaties en eiwit truncatie. Alhoewel de biologische significantie van deze veranderingen is niet volledig vastgesteld, werd voorgesteld dat het ontbreken van TGFB1-RII receptoren van het oppervlak van gastrointestinale epitheelcellen de negatieve groeicontrole van TGF-β kan elimineren, wat leidt tot ongecontroleerde celgroei [19]. IGFIIR een rol bij groeiremming door binding en activering van de TGFB1 receptorcomplex en internalisatie mediëren, gevolgd door afbraak van de groeifactor IGF-II [20, 21]. BAX
bevordert apoptose werd gemeld dat BAX
inactivering leidt tot een snelle tumorgroei [22]. De menselijke genen hMSH3 Kopen en hMSH6 Wat zijn homoloog aan het bacteriële MutS
gen waarvan de producten bindend DNA mismatches tot inleiding strengs specifieke DNA-reparatie replicatiefouten [23]. Somatische en kiemlijn mutaties in hMSH6
werden geassocieerd met sporadische colorectale carcinomen MMP + HNPCC en [6].
Wij hebben gevonden dat de eerder BLM
gen ook een doelstelling van MSI [24] kan zijn. De leesraamverschuiving, in een korte poly-adenine repeat, werd voorspeld dat een afgeknot en niet-functioneel eiwit BLM genereren. Homozygote of samengesteld heterozygote mutaties op de BLM
gen bleken de Bloom syndroom (BS; OMIM 210.900), een pre-maligne aandoening gekenmerkt door chromosomale instabiliteit en verhoogde mutatie-tarief. BS patiënten vatbaar voor allerlei neoplasmen gediagnosticeerd op jonge leeftijd. Opmerkelijk onder 100 neoplasmen opgenomen in de BS register 19 waren gastro-intestinale (slokdarm, maag en colon) en slechts twee werden gediagnosticeerd na de leeftijd van 40 [25]. Deze gegevens geven aan dat mutaties in het gen BLM
tumorigenese kan bevorderen Belgique Om de rol van BLM
gastrointestinale tumorigenese we een panel van MMP en MMP + maagcarcinomen (GC) voor afgeschermde beter te definiëren: a.) leesraamverschuiving in de BLM
coderende gebied microsatelliet en b) voor de mogelijke associaties met andere intragene frameshifts.
Resultaten
MSI-status
voor de huidige studie, ons panel van 50 GC bevat 15 MMP + tumoren met MSI op twee of meer loei (Tabel 2) en 35 GC MMP met een veranderde in een microsatelliet (4 tumoren) of zonder MSI (31 tumoren). Alle MMP + gevallen waren BAT 26 positief, en BAT 25 instabiliteit werd gevonden in 13 van de 15 gevallen (met uitzondering van de gevallen 67R en 27p). De klinische en pathologische kenmerken van MMP + tumoren zijn beschreven in tabel 1. De MMP + fenotype was nauw verbonden met een lage pTNM fase en een minder voorkomen kliermetastasen (p = 0,02 en p = 0,001 bij Fisher exact test, respectievelijk vs.
MMP-tumoren). Binnen de MMP + -groep, een overmaat van tumoren in een vroeg stadium en zonder lymfeknoop metastasen gevonden (10/15 gevallen vs. 10/32 gevallen van MMP gevallen, p = 0,02 en 11/15 gevallen vs. 7/32 gevallen MMP-gevallen, p = 0,001, respectievelijk), gegevens die ondersteuning bieden voor de voorgestelde betere prognostische van GC MMP + [33, 34]. Van de nota, geen eigen risico van intestinale soort onder MMP + tumoren gevonden (12/15 gevallen vs.
20/32 van MMP-cases) (tabel 1), gegevens in overeenstemming met recente studies blijkt geen significant verschil in de frequentie van MSI in intestinaal-type en diffuse-type carcinomen [26, 35] .table 1 Histotype en enscenering parameters in verband met de MMP fenotype in onze GCsa
Variable

Aantal patiënten
P waardeB
Totaal (%)
MMP + (%)
MMP - (%)
Histotype
Intestinale
32 (68,0)
12 (37,5)
20 (62,5)
Diffuse + Gemengd
15 (32,0)
3 (20,0)
12 (80,0)
NSC
T (diepte van de muur infiltratie)
T1 + T2
12 (25,5)
6 (50,0)
6 (50,0)
T3 + T4
35 (74.5 )
9 (25,7)
26 (74,3)
NS
N (lymfeklierstatus)
N0
18 (38,3)
11 (78,5)
7 (21,5)
N +
29 (61,7) verhuur 4 (12,1)
25 (87,9)
= 0,001
M (uitzaaiingen)
M0
40 (85.1 )
14 (35,0)
26 (65,0)
M +
7 (14,9)
1 (14.2)
6 (85,8)
NS
Staging
I + II
20 (42,5)
10 (58,8)
10 (41,2)
III + IV
27 (57,5)
5 (16,6)
22 ( 83,4)
= 0.02
totala
47
15
32
- gegevens beschikbaar waren voor 47 van de 50 gevallen b - bij Fisher exact test c - NS = niet statistisch significant
Tabel 2 Status van het coderende microsatellieten binnen BLM, WRN, RECQL, CBL, hMSH6, hMSH3, IGFIIR, TGF-βRII Kopen en BAX
genen in de reeks van de maag carcinomen met microsatelliet mutator fenotype.
Case

Histotypea

Stagingb


BLM

WRN

REQL

CBL

hMSH6

hMSH3

IGFIIR

TGF-βRII

BAX

No.



MSIc

(A)9

(A)8

(A)9

(ATG)6

(C)8

(A)8

(G)8

(A)10

(G)8

31R
I
I(T2N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
57R
I
IV(T3N1M1)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
63R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
+
-
-
+
+
67R
I
I(T2N0M0)
4/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
69R
D
II(T3N0M0)
4/5
+
-
-
+
+
+
-
+
+
79R
I
I(T2N0M0)
5/5
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3P
I
II(T3N0M0)
4/7
+
-
-
-
-
-
-
-
+
11P
I
III(T3N1M0)
3/7
+
-
-
-
-
+
+
+
-
14P
M
II(T3N0M0)
6/7
+
-
-
+
+
-
-
+
+
17P
I
II(T3N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
19P
D
III(T3N1M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
-
-
27P
I
IV(T4N0M0)
2/5
-
-
-
-
-
-
-
+
-
30P
I
I(T2N0M0)
3/6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
37P
I
I(T2N0M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
38P
I
III(T3N2M0)
3/7
-
-
-
-
-
-
-
+
-
%
present studie (aantal gevallen)
27%
0% 0%

13%
20%
13%
7%
60%
27 %
mutaties
(4/15)
(0/15)
(0/15)
(2/15)
(3/15)
(2 /15)
(1/15)
(9/15)
(4/15)
beschreven in de literatuur (in GC) d
- - Frankrijk -
- 22-52%
19-64%
19-24%
42-83%
15-64%
- I = intestinale soort; D = diffuse soort; M = gemengde type b - volgens de TNM classificatie (Sobin en Wittekind, 1997) c - aantal onstabiele /totaal getest microsatellieten D - gegevens verzameld van de referenties: [17,27,42,50,51,52]
BLM frameshifts
PCR amplificatie van de BLM
microsatelliet geopenbaard abnormale bands, afwezig in de normale DNA gekoppeld, in 4 van de 15 MMP + tumoren (27%) (fig. 1). We hebben door sequentiebepaling bevestigd dat de abnormale banden worden veroorzaakt door een deletie van een adenine residu in de poly-adenine tract (reductie 9-8 adeninen), zoals eerder aangetoond [24]. De mutatie frequentie in BLM
kan een lage schatting, omdat we gevallen waarin abnormale bands in tumor-DNA's waren met name zwakker dan de normale mensen, mogelijk als gevolg van een grote verontreiniging van de tumor met nonmalignant cellen of van een lage uitgesloten gedeelte van maligne cellen die de afwijking (fig. 1). Aangezien geen BLM
mutatie werd waargenomen bij MMP tumoren, frameshift mutaties in het gen BLM
lijken specifiek geassocieerd met maag- MMP + tumoren (waarschijnlijkheid P < 0,01 bij Fisher exact test), vergelijkbaar met de vorige goed gedocumenteerde veranderingen in TGFB1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6 Kopen en BAX
genen [14, 16, 17, 32]. Derhalve Onze resultaten breiden het repertoire van veranderde genen geassocieerd met MMP + maagcarcinomen. Figuur 1 Representatieve voorbeelden van mutaties gedetecteerd bij microsatellieten gen coderende gebieden. Case nummers staan ​​boven elke overeenkomende normale (N) en tumor (T) DNA pairs. Pijlen geven de abnormale bands. Merk op dat we niet gemuteerde monsters, waarbij abnormale bands waren erg flauw (net als in de BLM Kopen en BAX
genen van de tumor monster 30P) hebben overwogen. Vanwege de neiging van Taq-polymerase om een ​​extra nucleotide aan het einde van de gesynthetiseerde DNA-fragmenten toe, PCR producten lijken soms dubbele banden. Met uitzondering van BAX frameshift
tumor 69R, verschijnt er geen andere mutatie homozygoot zijn. Echter, door te weten de verhouding van maligne cellen in tumormonster, we hebben eerder aangegeven dat de BLM
mutatie in tumor 69R is homozygoot [24].
Leesraamverschuiving in andere CDRs microsatellieten en relaties met BLM frameshifts
hetzelfde panel van MMP + tumoren geanalyseerd op de aanwezigheid van leesraamverschuiving in microsatellieten in de coderende gebieden van acht andere genen (Tabel 2). We hebben variatie in de volgorde lengte TGFB1-RII, IGFIIR, hMSH3, hMSH6 Kopen en BAX
genen gevonden, eerder gemeld te worden gewijzigd MMP + GC. Gegevens over de TGFB1-RII
status van acht (P series in tabel 2) van de vijftien tumoren eerder beschreven [27]. De waargenomen mutatie frequenties waren vergelijkbaar met die eerder gerapporteerd voor deze genen, met uitzondering van IGFIIR,
waarvoor we een laag percentage leesraamverschuiving (tabel 2). Interessant is dat in vergelijking met BLM
mutaties alleen TGFB1-RII
frameshifts die vaker (60% vs. 27%, respectievelijk) en BAX
frameshifts waren en frequent (27%). Deze gegevens suggereren dat leesraamverschuiving in BLM Wat zijn vaak veranderingen in de MMP + GC. Een trend naar een associatie tussen mutaties in BLM Kopen en mutaties in BAX Kopen en hMSH3 Kopen en /of hMSH6
waargenomen (tabel 2) (P = 0,05 bij Fisher exact test).
We hebben ook geanalyseerd de RecQL, WRN Kopen en CBL
genen, die korte herhalingen in hun coderende gebieden bevatten. De eerste twee genen zijn leden van dezelfde genfamilie helicase als BLM
[36, 37]. Hoewel RecQL
niet is geassocieerd met een menselijke ziekte, mutaties in het gen WRN
oorzaak van Werner syndroom (WS; OMIM 277.700), een zeldzame autosomale recessieve aandoening klinisch gekenmerkt door vroegtijdige veroudering en verhoogd risico op diverse van neoplasmen en genetisch gekarakteriseerd door genomische instabiliteit. CBL
is een tyrosine kinase receptor [38], waarvan de deregulering was geassocieerd met oncogenese [39]. We hebben mutaties die alleen in het CBL
gen (fig. 1). Twee monsters (69R en 14P) bleken een 3 bp insertie dragen in het trinucleotide (ATG) 6 herhaling van het CBL-gen
(gegevens niet getoond). Zoals we al eerder gerapporteerd [24], aangezien geen leeskader wordt geproduceerd, geen functionele consequentie kan worden afgeleid. Beide mutaties gevonden in kankers tonen ook BLM
leesraamverschuiving (tabel 2). Het is opmerkelijk dat deze subgroep tumoren een statistisch significante stijging van MSI in coderende regio's vertoont in vergelijking met de MMP + subgroep zonder BLM
aanpassingen. (P < 0,001, bij Χ 2-test) (tabel 2)
Discussie
verschillende studies hebben aangetoond dat alternatieve routes kunnen bestaan ​​in gastrointestinale + MMP en MMP kankers gekenmerkt door verschillende groepen veranderde genen [40]. Een geleidelijke model van mutator mutaties ( "de mutator de mutator andere muteert") werd voorgesteld om de mutator versus de suppressor trajecten in gastro-intestinale kankers [41] bepalen. Door het analyseren van de timing van de mutatie gebeurtenissen in genetisch instabiele GC, werd voorgesteld dat de eerste doelwitten van mismatch repair deficiëntie zijn de mononucleotide stukken TGFB1-RII Kopen en BAX.
De frameshift mutaties van hMSH3 Kopen en hMSH6
lijken secundaire mismatch repair laesies, die mutaties in IGFIIR
[42] genereren. De bevinding dat frameshift mutaties op TGFB1-RII Wat zijn de meest voorkomende en de IGFIIR Wat zijn de minder frequent in de maag MMP + tumoren ondersteunt het model in die vroege gebeurtenissen aanwezig is in het merendeel van de tumoren en laat mutaties mag alleen in een kleine fractie [43]. Deze bevinding wordt bevestigd in onze studie (Tabel 2). BLM
frameshift mutaties vaker geassocieerd met de eerste en tweede stap in dit model voorgestelde wijzigingen, wat erop wijst dat zij ondergeschikt zijn aan reparatie defecten mismatch (in hMSH3 Kopen en /of hMSH6
) aanwezig zijn in cellen die dat niet doen ondergaan apoptose (mogelijk als gevolg van BAX
inactivatie). Opmerkelijk bij 3P, naast BLM, of the enige leesraamverschuiving gevonden in BAX (zie
figuur 1) en p53
(gegevens niet getoond) genen, wat suggereert dat, in sommige gevallen, BLM
verandering kan plaatsvinden zonder hMSH3 Kopen en /of hMSH6
mutaties in cellen met abnormale p53-gemedieerde route van apoptotische respons op DNA mismatch. Ondernemingen De betrokkenheid van BLM
in het ontstaan ​​van tumoren buiten BS patiënten lijkt denkbaar, aangezien dit gen lijkt te werken als een verzorger. BLM
mutaties bekend een verhoogde genomische instabiliteit gekarakteriseerd door verhoogde aantal chromosomale breuken, spleten en herschikkingen en door een te groot aantal mutaties in zowel coderende en niet-coderende gebieden veroorzaken, waarschijnlijk geïnitieerd door ongelijke zuster-chromatide uitwisseling Kenmerkend van de Bloom syndroom [44, 45]. Dienovereenkomstig BS vertoont een combinatie van genomische instabiliteit en verhoogd risico op kanker, een vereniging ook gevonden in andere ziekten veroorzaakt door gebreken in caretaker genen (zoals HNPCC, WS, ataxie-telangiectasia en xeroderma pigmentosum). Soortgelijke mutaties in BS, in het GC beschreven frameshifts heffen de helicase functie van de BLM eiwit [24]. BLM eiwit een bewezen DNA afwikkelen activiteit [46] en kunnen worden bij processen die verstoord kwaadaardige cellen, zoals DNA-replicatie, recombinatie, chromosoomsegregatie, DNA-reparatie en transcriptie. Inderdaad, de kernsplijting gist BLM-gen
homoloog (radl2
+ /rqhl
+) werd aangetoond dat de S-fase checkpoint reguleren en werd voorgesteld te koppelen chromosomale integriteit met celcyclus [47, 48]. Echter, het vinden van BLM
mutaties in MMP + tumoren genereert een paradox: BLM
mutaties worden voorspeld chromosomale instabiliteit te genereren, terwijl de meeste van de MMP + tumoren zijn diploïde. Niettemin zijn sommige MMP + tumoren aneuploïde en BLM
verlies-van-functie mutaties pleiotrope gevolgen hebben, mogelijk van invloed eveneens de microsatelliet instabiliteit route, zoals voorgesteld door de beschrijving van een verhoogde intra-genmutaties bij Bloom syndroom [44, 45 ]. In suppoprt onze suggestie is de vaststelling dat we hebben gevonden dat BLM
is gemuteerd in LoVo cellijn, een darmkanker cellijn met zowel microsatelliet en chromosomale inatability [43]. Veel meer, het was meldde onlangs dat SGS1
gen, het Saccharomyces cerevisiae
homoloog van BLM
en WRN,
onderdrukt genoom instabiliteit en homologe recombinatie en is redundant met DNA mismatch repair (MMR) voor het onderdrukken bruto chromosomale herschikkingen en voor het onderdrukken van recombinatie tussen uiteenlopende DNA sequenties [49].
Conclusies
Onze resultaten geven aan dat BLM
leesraamverschuiving zijn frequente veranderingen in GC en zijn specifiek geassocieerd met MMP + tumors het weergeven van ten minste 2 instabiel microsatellieten. Mutaties in BLM
lijken te vaak worden geassocieerd met leesraamverschuiving in BAX Kopen en in hMSH6 Kopen en /of hMSH3, Kopen en tumoren met BLM
wijzigingen presenteren een aantal instabiele mono- en trinucleotide repeats in coderende gebieden significant hoger dan die waargenomen bij tumoren zonder MMP + BLM
frameshifts. Wij stellen voor dat BLM
functieverlies van MSI in maagtumoren een tussenproduct mutationele gebeurtenis die de instabiliteit van een pre-existent instabiele genotype kan verhogen.
Methods
tumormonsters
Vijftig primaire maagtumoren en hun normale gepaarde weefsel (bloed of normaal maagslijmvlies) werden geselecteerd op basis van de beschikbare DNA uit een panel van 80 maagtumoren (27, Calin G en Negrini M ongepubliceerde gegevens). Indien mogelijk gebieden van tumorweefsel met minimale ontstekingscellen of minimale stroma, of beide, werden geselecteerd om een ​​neoplastische cel lading meer dan 50% te verkrijgen. Alle zaken werden histopathologisch geïdentificeerd als adenocarcinomen. Histotype (volgens de classificatie Lauren's) [28] en staging (volgens de TNM classificatie) [29] stond bekend om 47 van de 50 gevallen (94%) (tabel 1). Tweeëndertig gevallen waren van intestinale histotype en 15 gevallen van diffuse of gemengde type. Twintig tumoren werden opgevoerd I of II, terwijl 27 waren in fase III of IV. Met betrekking tot de lymfeklierstatus, achttien gevallen waren NO en 29 waren N-positief. Geen van de patiënten had een kanker ontwikkeld op jonge leeftijd en niemand had een familiegeschiedenis wijzen op genetische aanleg voor kanker. Hoge gewicht DNA moleculair werd geïsoleerd volgens vaste procedures [30]
Beoordeling van MSI
MSI werd onthuld met twee sets van anonieme markers op loci. (I) D11S1778, D11S1328, D11S922 Kopen en D11S1318
[24] of (ii) D2S177, D3S1076, D5S433, D11S904, D17S796 Kopen en D18S59
[27]. De primers voor deze dinucleotide microsatelliet loci werden verkregen uit informatie die beschikbaar is via de Genome DataBase. PCR amplificaties werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [24, 27]. Voor alle monsters de BAT25 en BAT26

microsatellieten werden geanalyseerd door PCR-amplificatie zoals beschreven [31]. MSI werd beoordeeld als een mobiliteitsverandering van PCR producten van tumor DNA vergeleken met de normale tegenhanger werd geïdentificeerd. Alleen tumoren met minstens 2 MSI (> 30% van de geteste microsatellieten). Werden beschouwd MMP +
Versterking van microsatellieten in BLM en in andere coderende gebieden (CDR's) Ondernemingen De (A) 9 microsatelliet zich op positie 1610- 1618 van BLM
cDNA-sequentie werd geanalyseerd voor alle gepaarde monsters. Kort samengevat, werd de microsatelliet geamplificeerd door PCR met 50 ng template-DNA, 1 pM van elke primer, 1,5 mM MgC12, 50 pM elk van dATP, dGTP en dTTP en 5,0 uM dCTP, 0,1 eenheid Taq DNA polymerase, en 1 uCi [α33P] dCTP in 10 pl reactievolume. PCR reacties werden uitgevoerd gedurende één cyclus van 94 ° C gedurende 5 minuten gevolgd door 35 cycli van 94 ° C gedurende 30 s, 60 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 30 s uitgevoerd. PCR producten van tumor en overeenkomende controle DNAs werden op parallelle op 6% acrylamide gels en sequencing blootgesteld visualisatie door autoradiografie op Kodak X-AR film. Detectie van mutaties in microsatellieten gelegen in de CDR's van acht andere genen (de (A) 10 in TGFB1-RII,
de (G) 8 in IGFIIR, of the (G) 8 in BAX, of the (A) 8 in hMSH3,
het (C) 8 in hMSH6, of the (A) 9 in RecQL, of the (A) 8 in WRN,
en de (ATG) 6 in CBL
) werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [14, 16, 17, 24, 32]. Voor controle werd elke PCR ten minste tweemaal herhaald. Een gemuteerde allel werd vertegenwoordigd door een bandverschuiving van 1-3 bp van de normale band intensiteit vergelijkbaar met of groter dan die van het wild-type band (fig. 1).
Sequentiebepaling van abnormale producten
Genomische DNA-fragmenten vertonen band verschuivingen werden opnieuw geamplificeerd onder dezelfde omstandigheden met uitzondering van het weglaten van gelabeld dCTP. Voordat sequencing werden de PCR producten gezuiverd hetzij rechtstreeks hetzij na scheiding in een 2% agarosegel met behulp van Qiagen zuivering kits. Beide DNA-strengen werd de sequentie bepaald onder toepassing van PCR primers en een geautomatiseerde Applied Biosystem 377 sequencing station. Nucleotide sequenties werden geanalyseerd met de Wisconsin (GCG) programmapakket versie Unix-8,1.

Statistische analyse De statistische analyse van de resultaten werd uitgevoerd met het Χ 2-test of Fisher's exact test. AP
waarde van <. 0,05 werd beschouwd als statistisch significant
verklaringen
Erkenning
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) en deels uit het EG-BIOMED contract BMH4-CT95-0914. GC werd ondersteund door een IARC Research Training Fellowship.
Authors 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan ​​de links naar de auteurs oorspronkelijke ingediende dossiers voor afbeeldingen. 12863_2001_18_MOESM1_ESM.png originele bestand Authors 'voor figuur 1

• Abdominale migraine bij kinderen: vereniging tussen maagmotiliteit parameters en klinische characteristics
• Anti-ulcerogene activiteit van de wortel schors extract van de Afrikaanse goudenregen "Cassia sieberiana" en het effect op de anti-oxidant afweersysteem in rats