Avsaknad av Helicobacter pylori hög tetracyklinresistenta 16S rDNA AGA926-928TTC genotyp i mag biopsiprover från dyspeptiska patienter i en stad i det inre av São Paulo, Brazil

frånvaro av Helicobacter pylori
hög tetracyklinresistenta 16S rDNA AGA926-928TTC genotyp i mag-biopsi prover från dyspeptiska patienter i en stad i det inre av São Paulo, Brasilien Bild Sammanfattning
bakgrund
behandling effektivitet Helicobacter pylori
varierar regionalt och minskar över hela världen, främst till följd av antibiotikaresistenta bakterien. Tetracyklin är i allmänhet ingår i andra raden H. pylori
regimer utrotnings. I Brasilien är en hög nivå av tetracyklinresistens (TetR) förknippas främst med AGA926-928TTC 16 S rDNA nukleotidsubstitutioner. Som H. pylori
kultur är kräsna, undersökte vi den primära förekomsten av H. pylori
16 S rDNA hög nivå TetR genotyp med användning av ett molekylärt tillvägagångssätt direkt på gastriska biopsier från dyspeptiska patienter som deltar i följd vid Hospital das Clinicas av Marilia, São Paulo, Brasilien.
metoder
Gastric biopsiprover av 68 magsår (PUD) och 327 kronisk gastrit (CG) patienter med en positiv histologisk diagnos av H. pylori
undersöktes för TetR 16 S rDNA genotyp genom en molekylär analys baserad på amplifiering av en 16 S rDNA 545 bp-fragment genom polymeraskedjereaktion och Hinfl
restriction fragment length polymorphism (PCR /RFLP). Genom denna analys, AGA926-928TTC 16 S rDNA TetR genotyp resulterade i en tre DNA-fragment restriktionsmönster (281, 227 och 37 bp) och dess frånvaro härrörde två DNA-fragment (264 och 281 bp) på grund av en 16 S rDNA bevarad Hinf I Resultat
restriktionsställe.
545 bp 16 S rDNA PCR-fragment förstärktes från 90% av gastriska biopsier från histologiska H. pylori
positiva patienter. Hinfl
RFLP avslöjade frånvaro av AGA926-928TTC H. pylori
genotyp och PCR-produkter av två patienter visade frånvaro av den konserverade 16 S rDNA Hinfl
restriktionsställe. BLASTN sekvensanalys av fyra amplikoner (två bevaras och två med en oförutsedd HinfI
restriktionsmönstret) visade en 99% homologi med H. pylori
16 S rDNA från Afrika, Nord- och Sydamerika bakterieisolat. En nukleotidsubstitution avskaffats den konserverade Hinfl
restriktionsställe i de två PCR-fragmenten med unpredicted Hinfl
RFLP, vilket resulterar i ett EcoRI
restriktionsställe.
Slutsatser
H. pylori
AGA926- 928TTC 16 S rDNA gen substitutioner påträffades inte i vår befolkning. Mer forskning behövs för att undersöka om H. pylori
TetR har en annan genetisk bakgrund i vår region och om nukleotidsubstitutioner i obildade H. pylori
16 S rRNA partiella sekvenser har biologisk betydelse.
Sökord
Helicobacter pylori
Tetracyklinresistens Helicobacter pylori
16 S rDNA Nukleinsyra baserad diagnos Helicobacter pylori
16 S rDNA polymorfism bakgrund
Det är allmänt accepterat att Helicobacter pylori
, en gramnegativ mikroaerofil bakterie är förknippad med flera mag-tarmkanalen sjukdomar såsom kronisk gastrit, magsår och duodenalsår, magsäckscancer och lymfoproliferativa sjukdomar [1]. Det finns ingen standardiserad behandlingsregim för H. pylori
infektion [2] och när bakterien upptäcks i förändrad magslemhinna, den angivna behandlingen består av en trippel antibiotikum regim inklusive metronidazol, klaritromycin, amoxicillin, tinidazole, tetracyklin och fluorokinoloner associerade med en protonpumpshämmare såsom omeprazol, lansoprazol eller pantoprazol [3-5], enligt antibiotika receptreglerna för närsjukvård.
H. pylori
utläkningshastigheten med ett antal kombinerade medel och regimer är nära 80% [6, 7], som varierar från land till land och regionalt inom länder [8]. Flera faktorer bidrar till denna låga hastighet av H. pylori
läkning inklusive ineffektiviteten av antibiotikumet penetration i magslemhinnan, inaktivering av antibiotikumet genom syrautsöndring i magen [9], brist på patientföljsamhet [10] och huvudsakligen, nödsituationer och ökning av H. pylori
antibiotikaresistenta stammar [11]. Således, är av stor betydelse för test- och behandlingsstrategier regionalt H. pylori
motstånd övervakning.
I Brasilien, ett land med kontinentala dimensioner, majoriteten av praktiserande läkare inkluderar tetracyklin i en andrahandsbehandlingsregim efter bortfall av den klassisk trippel regim bestående av klaritromycin, amoxicillin och en protonpumpshämmare i sju dagar för att övervinna H. pylori
infektion [12].
H. pylori
resistens mot tetracyklin (TetR) är låg i de flesta länder [13-15], omvänt, i Latinamerika, enligt ett fåtal studier har det visat sig vara hög i Chile [16] och i Brasilien [17]. Dessutom, för några år förekomsten av TetR har ökat [15, 18-21]. Följaktligen överväger den kliniska betydelsen av primär H. pylori
antibiotikaresistens, det bör övervägas regionalt innan de ingår i regimer utrotnings.
Guld standardmetod för bestämning av H. pylori in vitro
känslighet för antibiotika motsvarar isolering av mikroorganismen från kulturen. Men på grund av den långsamma tillväxten och de särskilda kraven i H. pylori
kultur, är denna metod inte är tillförlitlig för användning i de flesta rutin kliniska laboratorier, främst i utvecklingsländerna. Därför molecular test riktar resistens i samband genmutationer direkt från biopsiprover har potential för användning i storskaliga studier [22-25].
Molekylära mekanismen för TetR består av dess bindning till en specifik 16 S rRNA regionen, interagera stoiskt med aminoacyl-tRNA transferas till en plats för ribosomen. Detta bindningsställe har definierats av atomär upplösning i ribosomer av Thermus thermophilus
bildas av två domäner av 16 S rRNA fraktion bestående av helix 34 och slingan intill helix 31 [26, 27]. I H. pylori
isolat, är den höga graden av TetR främst på grund av tre grund mutationer från AGA926-928 till TTC i 16 S rRNA gener rRNA /B [28, 29]. Mutationer i en eller två av dessa positioner resulterar i en låg nivå av TetR [30, 31].
I Brasilien, studier utförda på patienter från Bragança Paulista, São Paulo, visade att trippel AGA926-928 till TTC-mutationer återfinns i alla TetR H. pylori
isolat [32]. Således, med hjälp av en molekylär metod som bygger på en polymerase chain reaction samband med restriction fragment length polymorfism (PCR-RFLP) -analys, undersökte vi den primära förekomsten av H. pylori
hög nivå TetR direkt i mag biopsiprover som erhållits från dyspeptiska patienter som lämnats att gastroskopi på sjukhus das Clinicas i Marilia, Sao Paulo, Brasilien, från januari 2003 till juli 2006.
Resultat och diskussion
Gastric sjukdom resultatet av 1102 patienter som deltog i gastroenterologiska polikliniken sjukhus das Clínicas av Marília undersöktes genom endoskopi och histopatologi. Endoskopisk konstaterandet av magsår eller tolvfingertarmen sjukdom (PUD) var närvarande i 119 patienter. Olika grader av kronisk gastrit (CG) observerades genom histopatologi i 693 patienter och andra förändringar som motsvarar främst till gastroesofageal refluxsjukdom (GERD) och normal magslemhinna, hittades i 290 patienter. Vissa patienter äldre än en förändring, med den allvarligaste patologi som övervägs i analysen detektion av H..
Pylori
utfördes direkt från biopsiprover genom histologi, guldmyntfoten H. pylori
diagnostiskt test anställd i vår kliniska rutin som tillsammans med histopatologisk analys används för att bestämma H. ​​pylori
eradikering. Av 119 PUD, 693 CG och 290 GERD prover, 76, 359 och 2, respektive, var positiv för H. pylori Musik av histologi.
När upptäcks i magslemhinnan, en klassisk H. pylori
utrotning trippel regim som föreskrivs i våra kliniker gastroenterologi sjukvårds. När första val regim terapi misslyckas att utrota H. pylori
, är en andra linjens behandling innehållande tetracyklin mest anges. H. pylori
antibiotikum TetR varierar regionalt, är mycket låg i Europa och Nordamerika [2, 33, 34]. Men i Asien [15, 19, 35] och Latinamerika, däribland Brasilien [16, 32], en hög grad av H. pylori
TetR har hittats. Således, i syfte att förbättra valet av H. pylori
tillhörande behandling sjukdom, främst vid fel utrotning första undersökte vi den regionala höga graden av H. pylori
TetR med hjälp av en molekylär metod baserad på PCR och RFLP direkt från samma gastric biopsi används för snabb ureastest. Endast biopsiprov från patienter med positiv H. pylori
diagnos av histologi ingick. En 545 bp H. pylori
16SrDNA PCR-fragment erhölls från 89,5% (68/76) och 91,1% (327/359) av gastric biopsier från PUD och CG patienterna. Eftersom båda tester utfördes på en enda och annorlunda gastric biopsi och H. pylori
infektion presenterar en fokal karakteristiska för infektion [36], för att förbättra känsligheten hos denna metod, är multipel biopsiprovtagning rekommenderas Sekventiellt.
, I syfte att upptäcka de stora relaterade punktmutationer, AGA till TTC vid positionerna 926, 927 och 928 av H. pylori
16 S rDNA förknippade med en hög grad av TetR och en unik genotyp, kännetecknad av brasiliansk TetR H. pylori
isolat [32], den 545 bp 16 S rDNA PCR-fragmentet klövs med Hinfl
. I detta H. pylori
16 S rDNA amplikon det finns en konserverad Hinfl
restriktionsställe, vilket ger en intern kontroll av enzymdigerering, vilket resulterar i ett två DNA-fragment restriktionsmönstret, när trippel AGA926-928TTC nukleotidsubstitution är frånvarande. Av 395 PCR prover, 393 presenterade två DNA-fragment restriktionsmönster och två PCR-produkter som erhållits från en PUD (Hp16S563Mar) patient och en CG (Hp16S587bp) patienten inte smältas av Hinfl
. Den höga tetracyklinresistenta AGA926-928TTC genotyp beroende H. pylori
16 S rDNA inte var närvarande i vår befolkning. Dessa resultat kan tyda på H. pylori
hög nivå TetR frånvaro eller att i vår region andra 16 S rDNA nukleotidsubstitutioner eller olika genetiska faktorer är inblandade i tetracyklinresistens, som hittas av andra studier [21]. Mer forskning måste genomföras för att bekräfta eller utesluta dessa hypoteser.
För att bekräfta specificiteten av 545 bp H. pylori
16 S rDNA PCR-produkter som amplifierats från gastriska biopsier, de 545 bp PCR-fragment som erhållits från två H. pylori
positiva PUD patienter som används som kontroller i PCR-reaktioner (Hp16S248Mar och Hp16S644Mar) och de 545 bp PCR-fragment med unpredicted HinfI
restriktionsmönster som heter Hp16S563Mar och Hp16S587bp, sekvenserades och analyserades genom basisk BLASTN sökning [ ,,,0],37]. Alla fyra sekvenser presenterade 99% homologi med 16 S rDNA från väst och Sydafrika, Syd- och Nordamerika H. pylori
isolat. De punktmutationer som finns i var och en analyserades PCR-sekvensen jämfört med H. pylori
16 S rDNA referenssekvenserna uppvisar högre homologi med de erhållna amplikoner är sammanfattade i tabell 1. Avskaffande av Hinfl
restriktionsstället i Hp16S563 och 587Mar resulte från en nukleotid substitution vid position 958, har sitt ursprung i ett EcoRI
restriktionsställe. Således var de nukleotidsubstitutioner i dessa 16 S 545 bp PCR-fragment bekräftas genom EcoRI
restriktionsanalys (data ej visade). Den biologiska betydelsen av nukleotidsubstitutioner i våra 16 S obildade H. pylori
PCR-fragment behöver utredas. Tabell 1 Jämförelse av Helicobacter pylori 545 bp 16 S rDNA nucleotide polymorphisms bland referenser och obildade bakterie stammar
H. pyloristrain +
16 S rDNA nukleotidpositioner #

926-928

947

954-959

981

988

1092

1093

1097

SouthAfrica07
AGA Review, en
GAATCC Review, en
T
T
C
G
2017WestAfrica
AGA Review, en
GAATCC
En
T
T
C
G
EU544200USA
AGA Review, en
GAATCC Review, en
T
T
T
G
Puno /Peru
AGA Review, en
GAATCC
G
C
T
C
G
Hp16S248Mar
AGA
G
GAATCC Review, en
T
T
C Review, en
Hp16S644Mar
AGA Review, en
GAATCC
A
T
G
C
G
Hp16S563Mar
AGA Review, en
GAATTC Review, en
T
T
T
G
Hp16S587Mar
AGA Review, en
GAATTC
G
C
T
C
G
# baserat på H. pylori
hänvisning stam 26995; + Anslutningsnummer H. pylori
sekvens stammar för SouthAfrica07, 2017WestAfrica, EU544200USA, Puno /Peru, Hp16S248Mar, Hp16S644mar, Hp16S563Mar och Hp16S567Mar är respektive: [Genbank: CP002336.1, Genbank: CP002571.1, Genbank: EU544200.1, Genbank: CP002982.1, Genbank: JQ315410, Genbank: JQ315411, Genbank: JQ315412 och Genbank. JQ315413]
slutsatser
hög nivå TetR H. pylori
genotyp beroende AGA926-929TTC 16 S rDNA gen utbyten hittades inte i vår befolkning. Mer forskning behövs för att undersöka om H. pylori
hög TetR är frånvarande eller om det är förenat med en annan bakterie genetisk bakgrund i vår region. Även den biologiska betydelsen av de oförutsedda nukleotidsubstitutioner i Marilia obildade H. pylori
16 S rDNA delsekvens behöver utredas ytterligare.
Metoder
Patienter
1102 vuxna patienter som är bosatta i Marilia stad, São Paulo State, Brasilien, i åldern 19 till 91 år, som hade följd genomgått gastroskopi (EGD) för övre delen av buken smärta eller dyspeptiska symtom från januari 2003 till juli 2006 på gastroenterologiska polikliniken sjukhuset das Clínicas av Marília Medical School, var inskrivna i detta Endoscopy studie.
, biopsier
EGD åstadkoms genom fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) eller video-endoskop (GIF-100) båda från Olympus. Magsår eller tolvfingertarmen diagnos definierades av endoskopi och två fragment av antrum samlades för att utföra snabba ureas och histopatologiska tester. Den biopsi används för snabb ureastest hävdade också att DNA-extraktion. Det protokoll som används är i överensstämmelse med Helsingforsdeklarationen och godkändes av den etiska kommittén i mänskliga forsknings från Marilia Medical School, med angivande av referens 388/01.
Histologi
En antral prov fastställdes i formol lösning vid 10% och inbäddades i paraffin. Sektioner Giemsa färgades för H. pylori
utvärdering och färgades med hematoxilin och eosin för bedömning av histopatologiska förändringar [38].
DNA-extraktion och polymeras kedjereaktion
polymeras kedjereaktion och restriktionsanalys sattes upp med samma biopsi används för snabb ureastest. Detta överlämnades till DNA-extraktion med anställning av GFX DNA-extraktion kit köpt från Amersham /Pharmacia Biotech, enligt tillverkarens instruktioner. DNA kvantifierades i agarosgelelektrofores med användning av Invitrogem låg massa stege och 50-100ηg användes i PCR-reaktionerna med primeruppsättning Hp16Sr1 (sens),): 5 'AAC ATT ACT GAC GCT GAT TG 3'; Hp16S r2 (antisense): 5 'TGG CTC CAC TTC GCA GTA TT 3 ", som förstärker en konserverad fragment av 545 bp motsvarande H. pylori
16 S rRNA-genen mellan nukleotidpositionerna 700 och 1245 (numrerade enligt rRNA-genen av H. pylori
stam 26695), ändras från [32]. I alla PCR-reaktioner en negativ och en positiv kontroll användes motsvarande, respektive, sterilt vatten och två olika ureas H.pylori
positiva gastriska biopsier från PUD patienter. PCR villkor var 94 ° C 5 'följt av 40 cykler av 94 ° C 1' /55 ° C 1 '/72 ° C 1' och en cykel vid 72 ° C 7 ', med en total volym av 25 ^ il innehållande 1 x PCR buffert, 200 ^ M dNTP, 2,0 mM MgCb 2, 1 pM oligoHp16Sr1, 1 ^ M oligo Hp16Sr2, 1,25 U Taq DNA-polymeras Platinum Brasilien (Invitrogen), 2,5% DMSO, 50ηg DNA. PCR-produkterna löstes i 1,5% agarosgeler färgade med etidiumbromid och fotograferades under UV-ljus.
Restriktions och sekvenseringsanalys
De 16 S rDNA 545 bp amplikoner erhållna genom PCR från biopsiprover digererades med Hinf
i (Biolab - New England) enligt tillverkarens anvisningar. Den förutsägbara restriktionsmönstret för tetracyklin känsliga H. pylori
stammar motsvarar två fragment av 264 och 281 bp och för H. pylori
stammar med hög tetracyklinresistens motsvarar tre fragment av 281, 227 och 37 bp. Produkterna av restriktionsanalys löstes i 8% akrylamidgeler, färgade med etidiumbromid och fotograferades under UV-ljus. 16 S rRNA 545 bp PCR-amplikoner från de två H. pylori
positiv kontroll gastriska biopsier (Hp16S248Mar och 644Mar) och de båda produkterna uppvisar oväntade Hinf
I restriktionsmönster (Hp16S563Mar och Hp16S587bp) lämnades till sekvensering med DyeTM Terminator v3.0 cykelsekvense Ready Reaction kit och en ABI-3100 maskin inköpt från Applied Biosystems, enligt tillverkarens anvisningar. Nukleotidsekvensbestämning utfördes i duplikat och jämförande analys genomfördes av grund nukleotid BLAST inriktning [37] Författarens
bidrag
RBS och CMA utförde molekylära studier och bidragit till förvärv och tolkning av data. MAS utformade experimenten, bidrog till dataanalys och utarbetade manuskriptet. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet
Notes
Rodrigo Buzinaro Suzuki, Cristiane Maria Almeida bidragit lika för detta arbete
Förkortningar
PUD:..
Magsår

CG:
kronisk gastrit
GERD:
gastroesofageal refluxsjukdom
PCR:
polymeras kedjereaktion
RFLP:
restriction fragment length polymorfism
TetR:
Tetracyklinresistens
.
förklaringar
Erkännanden
Vi är tacksamma till Dr Adriana Augusta Pimenta de Barros för hennes vård till alla patienter som ingick i studien och Dr David Howe för hans bidrag i upplagan av manuskriptet språket. Detta arbete stöddes av Fundação de Amparo en pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Research Grant 2006 /01.223-0; Gemenskap CMA 2005 /04.087-7.
Konkurrerande intressen
Vi inte har någon att förklara.

• Iska förändringar och molekylära subtyper av magcancer i asiater
• Interobserver och intraobserver avtal för magslemhinnan atrofi