Puuttuminen Helicobacter pylori korkea tetrasykliiniresistentit 16S rDNA AGA926-928TTC genotyypin mahalaukun biopsianäytteistä alkaen dyspepsiapotilaan of kaupunki sisätilojen Sao Paulo, Brazil

puuttuminen Helicobacter pylori
korkea tetrasykliiniresistentit 16S rDNA AGA926-928TTC genotyypin Mahan koepalan yksilöt dyspepsiapotilaan of kaupunki sisätilojen Sao Paulo, Brasilia
Abstract
tausta
hoito tehokkuuden Helicobacter pylori
vaihtelee alueellisesti ja vähenee maailmanlaajuisesti, pääasiassa seurauksena antibiooteille vastustuskykyisten bakteeri. Tetrasykliini sisällytetään yleensä toisella rivillä helikobakteeri
hävittämiseksi hoito. Brasiliassa korkeatasoisen tetrasykliiniresistenssin (TetR) liittyy lähinnä AGA926-928TTC 16 S rDNA nukleotidisubstituutioita. Kuten Helikobakteeri
kulttuuri on nirso, tutkimme ensisijainen esiintyminen helikobakteeri
16 S rDNA korkean tason TetR genotyyppi käyttäen molekyyli lähestymistapaa suoraan mahalaukun koepaloja dyspepsiapotilaan läsnä peräkkäin klo sairaalan das Clinicas of Marilia, São Paulo, Brasilia. Tool menetelmät
Mahalaukun kudosnäytteistä 68 mahahaavan (puuro) ja 327 krooninen gastriitti (CG) potilaille, joilla on positiivinen histologista diagnoosia helikobakteeri
tutkittiin TetR 16 S rDNA genotyyppi läpi molekyylipainon määritys perustuu monistamisen 16 S rDNA 545 bp: n fragmentti polymeraasiketjureaktiolla ja Hinfl
restriktiofragmenttipituuspolymorfismin (PCR /RFLP). Tämän määrityksen, AGA926-928TTC 16 S rDNA TetR genotyyppi johti kolmen DNA-fragmentti restriktiokuvio (281, 227 ja 37 bp) ja sen puuttuminen alkunsa kaksi DNA-fragmenttia (264 ja 281 bp) vuoksi 16 S rDNA säilyneitä Hinfl
restriktiokohta.
tulokset
545 bp 16 S rDNA PCR-fragmentti monistettiin 90% mahalaukun koepaloja histologista H. pylori
positiivisten potilaiden. Hinfl
RFLP paljasti poissaollessa AGA926-928TTC helikobakteeri
genotyypin ja PCR-tuotteiden kaksi potilasta osoitti poissaollessa säilytetty 16 S rDNA Hinfl
restriktiokohdan. BLASTN sekvenssianalyysi neljä amplikonien (kaksi konservoitunutta ja kaksi arvaamaton Hinfl
restriktioreaktio) paljasti 99% homologia helikobakteeri
16 S rDNA alkaen Afrikkalainen, Pohjois- ja Etelä-Amerikan bakteerien isolaatteja. Nukleotidi korvaaminen poistettiin konservoitunut Hinfl
restriktiokohdan kahden PCR-fragmentit, joissa arvaamaton Hinfl
RFLP, jolloin EcoRI
restriktiokohta.
Päätelmät
H. pylori
AGA926- 928TTC 16 S rDNA-geenin vaihtoja ei todettu väestöstä. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään jos helikobakteeri
TetR on erilainen geneettinen tausta alueemme ja jos nuklcotidisubstituutioiden on sivistymätön helikobakteeri
16 S rRNA osittaiset sekvenssit on biologista merkitystä.
Avainsanat
Helicobacter pylori
Tetrasykliiniresistenssi Helicobacter pylori
16 S rDNA Nukleiinihappo perustuva diagnoosi Helicobacter pylori
16 S rDNA polymorfismi Tausta
on yleisesti hyväksytty, että Helicobacter pylori
, gramnegatiivisen mikroaerofiilinen bakteerin , liittyy useita ruoansulatuskanavan sairauksia, kuten krooninen gastriitti, mahan ja pohjukaissuolihaavat, mahasyövän ja lymfoproliferatiiviset sairaudet [1]. Ei ole standardoitu hoito-H.pylori
infektion [2] ja kun bakteeri löytyy muuttuneessa mahan limakalvoa, asianmukainen hoito koostuu kolmen antibiootin johon sisältyi metronidatsoli, klaritromysiini, amoksisilliini, tinidatsolia, tetrasykliiniä ja fluorokinolonit liittyvän protonipumpun estäjä kuten omepratsoli, lansopratsoli tai pantopratsoli [3-5] mukaan antibiootti reseptiä ehdot paikallisille sairaanhoidon.
H. pylori
eradikaationopeus useita yhdistetyn aineita ja hoito ovat lähes 80% [6, 7], jotka vaihtelevat maittain ja alueellisesti maiden sisällä [8]. Useat tekijät vaikuttavat tähän alhaisen helikobakteeri
paranemista myös tehottomuus antibiootin levinneisyys mahalaukun limakalvon, inaktivointi antibiootin hapon erityksen mahan [9], ettei potilaan hoitomyöntyvyys [10] ja pääasiallisesti, hätätilanteissa ja kasvu helikobakteeri
antibiooteille vastustuskykyisiä kantoja [11]. Täten alueellinen helikobakteeri
vastus valvonta on hyvin tärkeä testi ja hoitostrategioita.
Brasiliassa maa Manner mitat, suurin osa harjoitellaan lääkärit kuuluu tetrasykliiniä toinen rivi hoito jälkeen epäonnistumisen klassinen kolmoishoitoa koostuu claritromycin, amoksisilliini ja protonipumpun estäjä seitsemän päivää voittaa helikobakteeri
infektion [12].
H. pylori
tetrasykliiniresistenssin (TetR) on alhainen useimmissa maissa [13-15], päinvastoin, Latinalaisessa Amerikassa, mukaan pieni määrä tutkimuksissa on osoitettu olevan korkeat Chilessä [16] ja Brasiliassa [17]. Lisäksi joitakin vuosia ilmaantuvuuden TetR on kasvanut [15, 18-21]. Näin ollen, kun otetaan huomioon kliininen merkitys ensisijainen helikobakteeri
resistenssiä antibiooteille, olisi pidettävä alueellisesti ennen sisältyvät hävittämiseen hoito.
Kultakanta määritysmenetelmä H. pylori in vitro
alttiuteen antibiootit vastaa eristäminen mikro-organismin viljelemällä. Kuitenkin, koska hitaan kasvun ja erityisvaatimukset helikobakteeri
kulttuuri, tämä lähestymistapa ei ole luotettava käytettäväksi useimmissa rutiini kliinisissä laboratorioissa, pääasiassa kehitysmaissa. Siksi molekyylitestejä kohdistaminen kestävyys liittyy geenimutaatioita suoraan koepalanäytteistä on potentiaalia käytettäväksi suuren mittakaavan tutkimuksia [22-25].
Molekyylitason mekanismi TetR koostuu sen sitoutumista tiettyyn 16 S rRNA alueen vuorovaikutuksessa stoically kanssa aminoasyyli-tRNA transferaasin A ribosomin. Tämä sitoutumiskohta on määritetty atomiresoluutiolla vuonna ribosomien Thermus thermophilus
on muodostettu kaksi domeeneihin 16 S rRNA osa koostuu kierteen 34 ja silmukan vieressä helix 31 [26, 27]. H. pylori
isolaatteja, suurta TetR johtuu pääasiassa kolmen emäksen mutaatiot, mistä AGA926-928 TTC, että 16 S rRNA geenit rRNA /B [28, 29]. Mutaatiot yhdessä tai kahdessa näistä asemista johtaa alhainen TetR [30, 31].
Brasiliassa tutkimukset suoritettiin potilaita Bragança Paulista, São Paulo, osoittivat, että triple AGA926-928 TTC mutaatiot löytyvät kaikki TetR helikobakteeri
isolaatit [32]. Siten käyttämällä molekyyli- lähestymistapaa, joka perustuu polymeraasiketjureaktion liittyy restriktiofragmenttipituuspolymorfismin (PCR-RFLP) määritys, tutkimme ensisijainen esiintyvyys helikobakteeri
korkean tason TetR suoraan mahalaukun biopsianäytteistä saatu dyspepsiapotilaan toimitettu että tähystystut- sairaalan das Clinicas of Marilia, São Paulo, Brasilia, tammikuusta 2003 heinäkuussa 2006.
tulokset ja pohdinta
Mahalaukun sairaus tulos 1102 potilasta hoitavan gastroenterologian poliklinikalla sairaalan das Clínicas Marília tutkittiin tähystykseen ja histopatologia. Endoskooppinen havainto peptisen tai pohjukaissuolihaavan taudin (PUD) oli läsnä 119 potilasta. Eriasteisia krooninen gastriitti (CG) havaittiin histopatologisella vuonna 693 potilasta ja muut muutokset vastaavat enimmäkseen refluksitauti (GERD) ja normaali mahan limakalvoa, havaittiin 290 potilaalla. Jotkut potilaista enemmän kuin yksi muutos, vaikeimmin patologian harkitaan analyysissä.
Toteaminen helikobakteeri
tehtiin suoraan koepalanäytteistä histologisesti, kultakantaan Helikobakteeri
diagnostinen testi työskentelee kliinisen rutiini joka yhdessä histopatologista analyysiä käytetään päättää helikobakteerin
häätöhoidossa. 119 puuro, 693 CG ja 290 GERD näytteitä, 76, 359 ja 2, vastaavasti, olivat positiivisia Helikobakteeri
histologian.
Kun havaitaan mahan limakalvoa, klassinen helikobakteeri
hävittämiseksi kolminkertainen hoito on määrätty meidän gastroenterologiassa terveydenhuollossa klinikoilla. Kun ensimmäinen valinta hoito hoito ei hävittämiseksi H. pylori
, toinen rivi hoito tetrasykliiniä sisältävälle on eniten ilmoitettu. Helikobakteeri
antibiootti TetR vaihtelee alueellisesti, on hyvin alhainen Euroopassa ja Pohjois-Amerikassa [2, 33, 34]. Kuitenkin Aasiassa [15, 19, 35] ja Latinalaisessa Amerikassa, mukaan lukien Brasilia [16, 32], on korkea Helikobakteeri
TetR on löytynyt. Niinpä parantamiseksi valintaan helikobakteeri
liittyvän sairauden hoito, pääasiassa kyse on ensimmäisestä hävittämisen vika, tutkimme alueellisella korkea helikobakteeri
TetR käyttäen molekyyli lähestymistapaa, joka perustuu PCR ja RFLP suoraan samasta mahalaukun koepala käyttää nopeina ureaasin testi. Vain otetuissa potilaiden positiivisia helikobakteeri
diagnoosin histologia olivat mukana. 545 emäsparin helikobakteeri
16SrDNA PCR-fragmentti saatiin 89,5% (68/76) ja 91,1% (327/359) mahalaukun koepaloja puuro ja CG potilaista. Koska molemmat testit suoritettiin yhdellä ja toinen mahalaukun koepala ja helikobakteeri
infektion esittelee polttoväli ominaisuus infektion [36], parantaa herkkyyttä tämän menetelmän useita koepala ottoa.
Peräkkäin, jotta havaitsemaan suuret liittyvän pistemutaatioita, AGA TTC asemissa 926, 927 ja 928 on H. pylori
16 S rDNA liittyy korkea TetR, ja ainutlaatuinen genotyypin tunnettu Brasilian TetR helikobakteeri
isolaatit [32], 545 emäsparin 16 S rDNA PCR-fragmentti pilkottiin Hinfl
. Tässä H. pylori
16 S rDNA amplikoni on konservoitunut Hinfl
restriktiokohdan, joka tarjoaa sisäisen valvonnan entsyymidigestiolla, jolloin kahden DNA-fragmentin restriktiokartta, kun kolmen AGA926-928TTC nukleotidisubstituution on poissa. 395 PCR näytteitä, 393 esitetään kahden DNA-fragmentin restriktiokartta ja kaksi PCR-tuotetta, joka on saatu PUD (Hp16S563Mar) potilaan ja CG (Hp16S587bp) potilas ei ole pilkottiin Hinfl
. Korkea tetrasykliiniresistentit AGA926-928TTC genotyypin riippuvainen helikobakteeri
16 S rDNA ei ollut läsnä meidän väestöstä. Nämä tulokset voivat olla merkki helikobakteeri
korkea TetR puuttuminen tai että alueemme muut 16 S rDNA nukleotidisubstituutioita tai erilaiset geneettiset tekijät ovat mukana tetrasykliiniresistenssin, kuten saapuvat muissa tutkimuksissa [21]. Enemmän tutkimus on suoritettava vahvistamiseksi tai jättää nämä hypoteesit.
Jotta voitaisiin vahvistaa spesifisyyttä 545 emäsparin Helikobakteeri
16 S rDNA PCR-tuotteet amplifioitiin mahalaukun koepaloja, 545 emäsparin PCR-fragmentit on saatu kaksi helikobakteeri
positiivinen PUD potilailla käytettiin verrokkeina PCR-reaktioissa (Hp16S248Mar ja Hp16S644Mar), ja 545 emäsparin PCR-fragmenttien arvaamaton Hinfl
restriktioreaktio nimetty Hp16S563Mar ja Hp16S587bp, sekvensoitiin ja analysoitiin perus- BLASTN haku [ ,,,0],37]. Kaikki neljä sekvenssit esitetään 99% homologia 16 S rDNA West ja Etelä-Afrikkalainen, Etelä-ja Pohjois-Amerikan H.pylori
isolaatteja. Pistemutaatiot Jokaisessa analysoitiin PCR: llä sekvenssin verrattuna H. pylori
16 S rDNA viitesekvenssit esittää korkeampi homologia saatiin amplikonit on esitetty taulukossa 1. poistamistavoitetta Hinfl
restriktiokohtaan Hp16S563 ja 587Mar johtanut alkaen nukleotidin substituutio asemassa 958, ovat peräisin EcoRI
restriktiokohdan. Siten nukleotidisubstituutioita näissä 16 S 545 bp: n PCR-fragmentit varmistettiin EcoRI
restriktioanalyysi (tietoja ei ole esitetty). Biologinen merkitys nukleotidikorvauksia löytyy meidän 16 S sivistymätön helikobakteeri
PCR-fragmentit on tutkittava. Taulukko 1 Helicobacter pylori 545 emäsparia 16 S rDNA nukleotidipolymorfismien keskuudessa viittauksia ja sivistymätön bakteeri kannat
H. pyloristrain +
16 S rDNA nukleotidiasemat #

926-928

947

954-959

981

988

1092

1093

1097

SouthAfrica07
AGA

GAATCC

T
T
C
G
2017WestAfrica
AGA

GAATCC

T
T
C
G
EU544200USA
AGA

GAATCC

T
T
T
G
Puno /Peru
AGA

GAATCC
G
C
T
C
G
Hp16S248Mar
AGA
G
GAATCC

T
T
C

Hp16S644Mar
AGA

GAATCC

T
G
C
G
Hp16S563Mar
AGA

GAATTC

T
T
T
G
Hp16S587Mar
AGA

GAATTC
G
C
T
C
G
# perustuu H. pylori
viite kanta 26995; + Liittyminen numerot helikobakteerin
järjestyksessä kantoja SouthAfrica07, 2017WestAfrica, EU544200USA, Puno /Peru, Hp16S248Mar, Hp16S644mar, Hp16S563Mar ja Hp16S567Mar ovat vastaavasti: [Genbank: CP002336.1, Genbank: CP002571.1, Genbank: EU544200.1, Genbank: CP002982.1, Genbank: JQ315410, Genbank: JQ315411, Genbank: JQ315412 ja Genbank: JQ315413].
Johtopäätökset
korkea TetR helikobakteeri
genotyypin riippuvainen AGA926-929TTC 16 S rDNA-geenin vaihtoja ei löytynyt väestöstä. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään jos helikobakteeri
korkea TetR puuttuu tai se on liitetty eri bakteerien geneettistä taustaa alueemme. Myös biologinen merkitys arvaamaton nukleotidin substituutioita Marilia sivistymätön Helikobakteeri
16 S rDNA osasekvenssi tarvitsee lisätutkimuksia. Tool Menetelmät
Potilaat
1102 aikuista potilasta asuville Marilia kaupunki, São Paulo valtion, Brasilia, iältään 19-91 vuotta, joilla oli peräkkäin tehty minkä gastroskopia (EGD) varten ylävatsakipu tai happovaivat tammikuusta 2003 kautta heinäkuuta 2006 gastroenterologian poliklinikalla sairaalan das Clínicas Marília Medical School, otettiin tässä tutkimus.
tähystys, koepaloja
EGD toteutettiin fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) tai video-endoskooppia (GIF-100) niin Olympus. Maha- tai pohjukaissuolihaava diagnoosi määriteltiin tähystys ja kahta fragmenttia antrum kerättiin suorittamaan nopean ureaasia ja histopatologisia testejä. Biopsia käytetään nopeaan ureaasin testi Lisäksi esitettiin DNA louhinta. Käytetty protokolla on yhteisymmärryksessä Helsingin julistuksen ja hyväksyi eettinen komitea in Human Research Marilia Medical School viitteellä 388/01.
Histologia
Yksi antral näyte fiksoitiin formaliinilla liuoksessa 10% ja upotettiin parafiiniin. Leikkeitä Giemsa värjättiin helikobakteeri
arviointi ja värjättiin hematoxilin ja eosiinilla arviointiin histopatologiset muutokset [38].
DNA: n eristämistä ja Polymeraasiketjureaktio
Polymeraasiketjureaktio ja restriktioanalyysillä perustettiin kanssa sama koepala käytetään nopeaan ureaasin testi. Tämä toimitettiin DNA uutetaan työllistymistä gfx DNA: n eristämiseksi pakki ostettiin Amersham /Pharmacia Biotech, seuraten valmistajan ohjeita. DNA määrällisesti agaroosigeelielektroforeesilla käyttämällä Invitrogem pienen massan tikkaat ja 50-100ηg käytettiin PCR-reaktioissa kanssa alukesetin Hp16Sr1 (sense),): 5 'AAC ATT ACT GAC GCT GAT TG 3'; Hp16S r2 (antisense): 5 'TGG CTC CAC TTC GCA GTA TT 3', jotka vahvistavat konservoituneen fragmentti 545 bp vastaten helikobakteerin
16 S rRNA välillä nukleotidiasemien 700 ja 1245 (numeroitu siinä rRNA H.pylorin
kanta 26695), muokattu [32]. Kaikissa PCR-reaktioissa negatiivisen ja positiivisen kontrolli käytettiin vastaavat vastaavasti steriiliä vettä ja kaksi erilaista ureaasin helikobakteeri
positiivinen mahalaukun koepaloja PUD potilaista. PCR ehto oli 94 ° C 5 ', jota seuraa 40 sykliä 94 ° C 1' /55 ° C 1 '/72 ° C 1' ja yksi sykli 72 ° C: ssa 7 ', joissa on yhteensä 25 ui, joka sisälsi 1 x PCR- puskuria, 200 uM dNTP: itä, 2,0 mM MgCI 2, 1 uM oligoHp16Sr1, 1 uM oligo Hp16Sr2, 1,25 U Taq-DNA-polymeraasia Platinum Brazil (Invitrogen), 2,5% DMSO: ta, 50ηg DNA. PCR-tuotteet erotettiin 1,5% agaroosigeeleillä värjättiin etidiumbromidilla ja valokuvattiin UV-valossa.
Rajoituksista ja sekvenssianalyysi
16 S rDNA 545 bp amplikonien saatu PCR: llä kudosnäytteistä pilkottiin Hinf
I (Biolab - New England) mukaan valmistajan ohjeiden. Ennustettavissa restriktioreaktio tetrasykliinille herkkiä Helikobakteeri
kannat vastaa kahta fragmentteja 264 ja 281 emäsparia ja H. pylori
kantoja, joilla on korkea tetrasykliiniresistenssigee- vastaa kolmea fragmentteja 281, 227 ja 37 emäsparia. Tuotteita restriktioanalyysillä erotettiin 8% akryyliamidigeeleillä, värjättiin etidiumbromidilla ja valokuvattiin UV-valossa. 16 S rRNA 545 emäsparin PCR-amplikonien kahdesta Helikobakteeri
positiivisen kontrollin mahalaukun koepaloja (Hp16S248Mar ja 644Mar) sekä kahdesta amplikonista esittää odottamatonta Hinf
I restriktiokuvioidenperusteella (Hp16S563Mar ja Hp16S587bp) toimitettiin sekvensointi DyeTM Terminator v3.0 sykli Sequencing Ready Reaction kit ja ABI-3100 kone hankittiin Applied Biosystem, mukaan valmistajan ohjeiden. Nukleotidisekvenssimäärityksestä suoritettiin kahtena ja vertaileva analyysi toteutettiin perus- nukleotidin BLAST linjaus [37].
Tekijän maksut
RBS ja CMA suorittivat molekyylitutkimukset ja vaikutti hankinnan ja tietojen tulkinnassa; MAS suunnitellut kokeet, osaltaan tietojen analysointi ja laati käsikirjoituksen. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.
Huomautuksia
Rodrigo Buzinaro Suzuki, Cristiane Maria Almeida vaikuttanut yhtä tähän työhön.
Lyhenteet
PUD:
Ulkustauti

CG:
Krooninen gastriitti
GERD:
refluksitauti
PCR:
Polymeraasiketjureaktio
RFLP:
restriktiofragmenttipituuspolymorfismin
TetR:
Tetrasykliiniresistenssi.

julistukset
Kiitokset
Olemme kiitollisia Dr. Adriana Augusta Pimenta de Barros hänen huolellisesti kaikki potilaat tutkimukseen sisältyvät sekä tohtori David Howe hänen panos painos käsikirjoitus kieli. Tätä työtä tukivat Fundação de Amparo Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Research Grant 2006 /01223-0; Fellowship CMA 2005 /04087-7.
Kilpailevat edut
Meillä ei ole mitään tullattavaa.

• Genominen muutokset ja molekyylitason alatyyppien mahasyövistä aasialaisilla
• Interobserver ja intraobserver sopimuksen mahalaukun limakalvon surkastumista