Absencia Helicobacter pylori vysoko odolného tetracyklínu 16S rDNA AGA926-928TTC genotyp v žalúdočných biopsiou z dyspeptických pacientov mesto v interiéri Sao Paulo, Brazil

absencia Helicobacter pylori
vysokú tetracyklínu rezistentné 16S rDNA AGA926-928TTC genotyp v žalúdočnej biopsia exempláre z dyspeptických pacientov mesta vo vnútrozemí Sao Paulo, Brazília
abstraktné
pozadia
účinnosti liečby Helicobacter pylori
líšia regionálne a klesá po celom svete, a to predovšetkým v dôsledku antibiotikám rezistentné baktérie. Tetracyklín je zvyčajne zahrnuté v druhom riadku H. pylori
eradikáciu režimov. V Brazílii, vysokú úroveň odolnosti proti tetracyklínu (TETRA) je spojený predovšetkým s AGA926-928TTC 16 S rDNA nukleotidových substitúciou. Ako H. pylori
kultúra je náročný, sme skúmali primárny výskyt H. pylori
16 S rDNA vysokej úrovni Tetra genotyp s využitím molekulárnej prístup priamo na žalúdočných biopsiách dyspeptických pacientov navštevujúcich za sebou v nemocnici das Clínicas z Marilia, Sao Paulo, Brazília.
Metódy
žalúdočné biopsia z 68 vredovej choroby (pud) a 327 chronickej gastritídy (CG) u pacientov s pozitívnym histologickej diagnóze H. pylori
boli skúmané na TETRA 16 s rDNA genotyp cez molekulárne test založený na amplifikáciu fragmentu 16 s rDNA 545 bp pomocou PCR a Hinfl
dĺžky reštrikčných fragmentov polymorfizmus (PCR /RFLP). Prostredníctvom tohto testu, AGA926-928TTC 16 S rDNA Tetra genotyp malo za následok tri DNA vzor reštrikčných fragmentov a (281, 227 a 37 bp) a jeho absencia vznikal dva fragmenty DNA (264 a 281 bp) v dôsledku 16 S rDNA zachovaná Hinf I
restrikčné miesto.
Výsledky
545 bp 16 S rDNA PCR fragment bol amplifikovaný z 90% žalúdočných biopsiou z histologických H. pylori pozitívnych pacientov
. Hinfl
RFLP odhalila neprítomnosť AGA926-928TTC H. pylori
genotypu a produkty PCR dvoch pacientov preukázala neprítomnosť konzervovaného 16 S rDNA Hinfl
restrikčné miesto. BLASTN sekvenčná analýza štyroch amplikónov (dve ošetrenia a dve s nepredvídateľnou Hinfl
obmedzenia vzoru) ukázal, 99% homológie sa na H. pylori
16 S rDNA z Afriky, Severnej a Južnej Ameriky bakteriálnych izolátov. Substitúcia nukleotidov zrušil konzervovať Hinfl
restrikčné miesto vo dvoch PCR fragmentov s nepredvídateľnou Hinfl
RFLP, čo má za následok ECOR
restrikčné miesto.
Závery
H. pylori
AGA926- 928TTC 16 S rDNA génovej substitúcie sa nenašli v našej populácii. Ďalší výskum je potrebný skúmať, či H. pylori
Tetra má iný genetické pozadie v našom regióne a ak sú nukleotidové substitúcie na nekultúrnych H. pylori
16 S rRNA čiastočné sekvencie majú biologický význam.
Kľúčové slová
Helicobacter pylori
tetracyklín odbojovej Helicobacter pylori
16 s rDNA nukleovej kyseliny založené diagnóza Helicobacter pylori
16 s rDNA polymorfizmus pozadie
je všeobecne uznáva, že Helicobacter pylori
, gramnegatívne baktérie mikroaerofilní , je spojená s niekoľkými chorôb zažívacieho traktu, ako je chronické gastritídy, žalúdočných a dvanástnikových vredov, karcinómu žalúdka a lymfoproliferatívne poruchy [1]. Neexistuje žiadny štandardizovaný liečebný režim pre H. pylori infekcie
[2], a akonáhle je baktéria je detekovaný v pozmenenej žalúdočnej sliznice, indikovaná liečba pozostáva z trojitej liečby antibiotikami vrátane metronidazol, klaritromycín, amoxicilín, tinidazol, tetracyklín a fluorochinolóny spojeného s inhibítorom protónovej pumpy, ako je omeprazol, lansoprazol alebo pantoprazol [3-5], podľa antibiotickej predpis politiky pre miestne lekársku starostlivosť.
H. pylori
eradikáciu ceny s počtom kombinovaných agentov a režimy sa blíži 80% [6, 7], ktoré sa líši od krajiny ku krajine a regionálne v rámci jednotlivých krajín [8]. Niekoľko faktorov prispieva k tejto nízkej rýchlosti H. pylori
rán, vrátane neúčinnosti prenikaniu antibiotika v žalúdočnej sliznici, inaktivácia antibiotiká u sekrécie kyseliny v žalúdku [9], nedostatok pohodlia pacienta [10] a hlavne, núdzové prípady a zvýšenie odolných voči antibiotikám kmeňov H. pylori
[11]. Tak, regionálne H. pylori
odpor dohľad má veľký význam pre testovacie a liečebných stratégií.
V Brazílii, krajine kontinentálnych rozmerov, väčšina praktizujúcich lekárom patrí tetracyklínu v druhej línii liečby režimom po poruche klasický triple režim zložený z klaritromycín, amoxicilínu a inhibítora protónovej pumpy po dobu siedmich dní na prekonanie H. pylori
infekcie [12].
H. pylori
odolnosť proti tetracyklínu (TETRA) je nízka vo väčšine krajín [13-15], naopak, v Latinskej Amerike, v závislosti na malom počte štúdií bolo preukázané, že je vysoká v Čile [16], a v Brazílii [17]. Okrem toho, niekoľko rokov incidencia Tetra rastie [15, 18-21]. V dôsledku toho s ohľadom na klinický význam primárnych H. pylori
rezistencie voči antibiotikám, by mala byť považovaná regionálne pred zaradením na eradikačné režimoch.
Zlatý štandard metóda na stanovenie H. pylori in vitro
náchylnosti k antibiotiká odpovedá izoláciu mikroorganizmu kultiváciou. Avšak, vzhľadom k pomalému rastu a osobitných požiadaviek H. pylori
kultúry, tento prístup nie je spoľahlivý pre použitie vo väčšine bežných klinických laboratóriách, najmä v rozvojových krajinách. Z tohto dôvodu, molekulárne testy cielenie génových mutácií rezistencie spojený priamo z biopsiou majú potenciál pre použitie v rozsiahlych štúdiách [22-25].
Molekulárna mechanizmus Tetra sa skladá z jeho väzby na špecifickú oblasť 16 S rRNA, interagujúce stoicky s aminoacyl-tRNA transferázy na mieste A ribozómu. Špecifickým väzobným miestom bola definovaná v atomárnym rozlíšením ribozómy z Thermus thermophilus
sú tvorené dvoma doménami frakcie 16 S rRNA, ktorú tvorí skrutkovice 34 a slučky vedľa helix 31 [26, 27]. V H. pylori
izolátov, vysoký stupeň Tetra je hlavne kvôli trom základných mutácií, z AGA926-928 do TTC, v 16 S rRNA génov rRNA /B [28, 29]. Mutácie v jednej alebo dvoch z týchto polôh za následok nízku úroveň tetra [30, 31].
V Brazílii, štúdie vykonanej na pacientoch z Bragança Paulista, Sao Paulo, ukázali, že triple AGA926-928 TTC mutácie sa nachádzajú v všetky tetra H. pylori
izoláty [32]. Takto, s použitím molekulárneho prístupu založené na PCR spojenú s dĺžky reštrikčných fragmentov polymorfizmus (PCR-RFLP) teste sme skúmali primárny výskyt H. pylori
vysokú úroveň TETRA priamo v žalúdočných biopsií získaných od pacientov dyspeptických predložených na gastroskopia v nemocnici das Clínicas z Marilia, Sao Paulo, Brazília, od januára 2003 do júla 2006.
Výsledky a diskusia
žalúdočné výsledku choroby z 1102 pacientov navštevujúcich gastroenterológie ambulantné kliniku nemocnice das Clínicas z Marília bol vyšetrovaný endoskopia a histopatológie. Endoskopický nález peptického alebo dvanástnikové vredovým ochorením (PUD) boli prítomné u 119 pacientov. Rôzne stupne chronickej gastritídy (CG) boli pozorované histopatológie v 693 pacientov a ďalšie úpravy zodpovedajúce väčšinou k refluxnej choroby pažeráka (GERD) a normálne žalúdočnej sliznice, boli nájdené u 290 pacientov. U niekoľkých pacientov viac ako jednej zmeny, s najzávažnejšie patológie boli považované v analýze.
Detekcia H. pylori
bolo vykonané priamo z biopsiou histologicky, zlatý štandard H. pylori
diagnostický test použitý v našej klinickej praxi, ktorá spolu s histopatologické analýzy sa používa na rozhodnutie o H. pylori
eradikačnej terapie. Zo 119 PUD, 693 CG a 290 vzoriek GERD, 76, 359 a 2, v uvedenom poradí, boli pozitívne na H. pylori
histologicky.
Po nájdení signálu v žalúdočnej sliznici, klasický H. pylori
vykorenenie triple režim je predpísané v našich klinikách gastroenterológie zdravotnej starostlivosti. Pri prvej voľba režimu terapia nedokáže vykoreniť H. pylori
, druhá linka režim obsahujúci tetracyklín je najviac uvedené. H. pylori
antibiotikum tetra líšia regionálne, že v Európe a Severnej Amerike [2, 33, 34] veľmi nízka. Avšak, v Ázii [15, 19, 35] a Latinskej Ameriky, vrátane Brazílie [16, 32], vysokou mierou H. pylori
TETRA bol nájdený. Tak, aby sa zlepšila výber H. pylori
spojená terapie ochorení, najmä v prípade zlyhania prvej eradikácie, sme skúmali regionálna vysokú úroveň H. pylori
Tetra pomocou molekulárnej prístup založený na PCR a RFLP priamo z rovnakého žalúdočné biopsia používané pre rýchle ureasového testu. boli zahrnuté len biopsia vzoriek od pacientov s pozitívnym H. pylori
diagnózu histologicky. H. pylori 545 bp
16SrDNA PCR fragment bol získaný z 89,5% (68/76) a 91,1% (327/359) žalúdočných biopsiou z PUD a CG pacientov, v danom poradí. Pretože oba testy boli vykonávané na jednom a iným žalúdočné biopsia a H. pylori infekcie
predstavuje ohniskovej charakteristiku infekcie [36], sa zlepšila citlivosť tejto metódy odberov násobok biopsia sa odporúča.
Postupne v poradí pre detekciu hlavné bodové mutácie súvisiace, AGA na TTC v polohách 926, 927 a 928 zo H. pylori
16 s rDNA spojené s vysokou úrovňou Tetra, a unikátny genotypom vyznačujúci sa tým, brazílsky Tetra H. pylori
izoláty [32], je 545 bp 16 s rDNA PCR fragment bol obmedzený Hinfl
. V tomto H. pylori
16 S rDNA amplikónu je zachovaná Hinfl
restrikčné miesto, ktoré poskytuje internú kontrolu enzýmovej trávenia, čo má za následok dve DNA vzor reštrikčných fragmentov je, keď trojnásobný AGA926-928TTC nukleotidu substitúcia je chýba. 395 vzoriek PCR, 393 predstavil dva DNA vzor reštrikčných fragmentov a dva PCR produkty získané z Pud (Hp16S563Mar) pacientom a (Hp16S587bp) pacienta CG neboli štiepené Hinfl
. Vysoká odolnosť tetracyklín AGA926-928TTC závislá na H. pylori genotyp
16 S rDNA nebol prítomný v našej populácii. Tieto výsledky môžu byť indikatívne pre H. pylori
vysokej úrovni tetra neprítomnosti alebo, že v našom regióne ďalších 16 S rDNA nukleotidové substitúcie alebo rôzne genetické faktory sa podieľajú na tetracyklín odporu, ako sa zistilo ďalšie štúdie [21]. Ďalšie výskumy, ktoré majú byť vykonané na potvrdenie alebo vylúčenie týchto hypotéz.
S cieľom potvrdiť špecifickosť H. pylori 545 bp
16 S rDNA PCR vzniknuté amplifikáciou z žalúdočných biopsiou sa 545 bp PCR fragmenty získané z dve pylori pozitívnych pacientov
PUD H. použité ako kontroly v PCR reakciách (Hp16S248Mar a Hp16S644Mar), a 545 bp PCR fragmenty s nepredvídateľné Hinfl štiepenia vzorom
názvom Hp16S563Mar a Hp16S587bp, boli sekvencovaní a analyzované základné vyhľadávanie BLASTN [ ,,,0],37]. Všetky štyri sekvencie prezentované 99% homológie s 16 S rDNA od západu a južnej Afriky, južnej a severnej americká H. pylori
izolátov. Mutácie bod nachádzajúci sa v každej PCR analyzované sekvencie v porovnaní s H. pylori
16 S rDNA referenčné sekvencie, ktoré predstavujú vyššie homológie s získaných amplikónov sú zhrnuté v tabuľke 1. zrušením Hinfl
štiepenia Hp16S563 a 587Mar viedlo z nukleotidové substitúcie v pozícii 958, pochádzajúce z ECOR
restrikčné miesto. To znamená, že nukleotidové substitúcie v nasledujúcich 16 S 545 bp PCR fragmentov boli potvrdené restrikčné analýzou ECOR
(dáta nie sú uvedené). Biologický význam nukleotidových substitúciou v našich 16 S nekultúrnych H. pylori
fragmentov PCR je potrebné vyšetriť. Tabuľka 1 Porovnanie Helicobacter pylori 545 bp 16 S rDNA nukleotidových polymorfizmov medzi referencií a nekultúrnych kmeňov baktérie H.
pyloristrain +
16 S rDNA nukleotidov pozície #

926-928

947

954-959

981

988

1092

1093

1097

SouthAfrica07
AGA
GAATCC
T
T
C
G
2017WestAfrica
AGA
GAATCC
A
T
T
C
G
EU544200USA
AGA
GAATCC
T
T
T
G
Puno /Peru
AGA
GAATCC
G
C
T
C
G
Hp16S248Mar
AGA
G
GAATCC
T
T
C
Hp16S644Mar
AGA
GAATCC
A
T
G
C
G
Hp16S563Mar
AGA
GAATTC
T
T
T
G
Hp16S587Mar
AGA
GAATTC
G
C
T
C
G
# založený na H. pylori referencie kmeň 26995; + Čísla pristúpení H. pylori
sekvencie kmeňov pre SouthAfrica07, 2017WestAfrica, EU544200USA, Puno /Peru, Hp16S248Mar, Hp16S644mar, Hp16S563Mar a Hp16S567Mar sú, v uvedenom poradí: [Genbank: CP002336.1, Genbank: CP002571.1, Genbank: EU544200.1, Genbank: CP002982.1, Genbank: JQ315410, Genbank: JQ315411, Genbank: JQ315412 a Genbank :. JQ315413]
závery
vysokej úrovni Tetra H. pylori
genotypu závislé na AGA926-929TTC 16 S rDNA génu substitúciou nebola nájdená v našej populácii. Ďalší výskum, je nutné preskúmať, či H. pylori
vysoká miera Tetra chýba alebo ak je spojené s iným bakteriálnym genetickom pozadí v našom regióne. Tiež biologický význam z nepredvídateľných nukleotidových substitúciou Marilia nekultúrnych H. pylori
16 S rDNA čiastočná sekvencia vyžaduje ďalšie skúmanie.
Metódy
pacientov
1102 dospelých pacientov s bydliskom v meste Marilia, Sao Paulo stať, Brazília, vo veku 19 až 91 rokov, ktorí mali za sebou podrobený Ezofagogastroduodenoskopie (EGD) pre bolesť v nadbrušku alebo dyspeptických príznakov od januára 2003 do júla 2006 na gastroenterologickej ambulancii Fakultnej nemocnice das Clínicas z Marília Medical School, boli zaradení do tejto študovať.
endoskopia, biopsia
EGD bolo vykonané fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) alebo video endoskop (GIF-100), a to ako z Olympu. Žalúdočný alebo dvanástnikové vredy diagnóza bola definovaná endoskopicky a dva fragmenty antra boli odobraté na vykonanie rýchlej ureázy a histopatologických testov. Biopsia slúži k rýchlemu ureasového testu bol ďalej predložený na extrakciu DNA. Použitý protokol je v súlade s Helsinskou deklaráciou a bola schválená etickou komisiou v ľudskom výskumu z Marilia Medical School, s uvedením čísla 388/01.
Histológia
Jedna antrálnej vzorky bola stanovená v formol roztoku pri 10% a vložené do parafínu. Rezy boli zafarbené Giemsa pre H. pylori
vyhodnotenia a boli zafarbené hematoxilinem a eosínu pre vyhodnotenie histopatologických zmien [38].
Extrakcia DNA a polymerázovú reťazovú reakciu
polymerázovej reťazovej reakcie a reštrikčné analýzou boli stanovené s rovnaký biopsia používa pre rýchle ureasového testu. To bol predložený na extrakciu DNA sa zamestnávaním extrakčný súpravy GFX DNA zakúpené od Amersham /Pharmacia Biotech, podľa pokynov výrobcu. DNA bola kvantifikovaná elektroforézou na agarózovom géle s použitím Invitrogem malú hmotnosť rebríka a 50-100ηg boli použité v PCR reakciách so súborom primerov Hp16Sr1 (sense),): 5 'ATT AAC ACT GCT GAC GAT TG 3'; Hp16S r2 (antisencie): 5 'TGG CTC CAC TTC GCA GTA TT 3', ktoré amplifikuje konzervovaný fragmentu 545 bp, ktorý zodpovedá H. pylori
16 S rRNA gén medzi nukleotidové pozície 700 a 1245 (číslované podľa rRNA gén H. pylori
kmeňom 26695), upravený z [32]. Vo všetkých reakciách PCR negatívne a pozitívna kontrola boli použité zodpovedajúce, v danom poradí, sterilné vodu a s dvoma rôznymi ureázy z Helicobacter pylori pozitívnych
žalúdočných biopsiách pacientov pôd. Podmienkou PCR bola 94 ° C 5 'nasleduje 40 cyklov pri teplote 94 ° C po 1' /55 ° C po 1 '/72 ° C, 1' a jeden cyklus pri teplote 72 ° C, 7 ', s celkovým objemom 25 ul, ktorý obsahuje 1x PCR pufra, 200 uM dNTP, 2,0 mM MgCl 2, 1 uM oligoHp16Sr1, 1 uM oligonukleotid Hp16Sr2, 1,25 U Taq DNA polymerázy Platinum Brazília (Invitrogen), 2,5% DMSO, 50ηg DNA. PCR produkty boli rozdelené na 1,5% agarózových géloch zafarbených etidiumbromidom a fotografované pod UV svetlom.
Reštrikčná analýza a sekvenovanie
16 S rDNA 545 bp produkty PCR získané pomocou PCR z biopsiou boli štiepené Hinf
I (Biolab - New England) podľa inštrukcií výrobcu. Predvídateľné obmedzenia vzorom pre kmene tetracyklín citlivých H. pylori
zodpovedá dvom fragmenty 264 a 281 bp a pre H. pylori
kmene s vysokou odolnosťou proti tetracyklínu zodpovedá trom fragmentov 281, 227 a 37 bp. Produkty z reštrikčnej analýzou boli vyriešené v 8% akrylamidovém gélu, zafarbené s etídiumbromidom a fotografované pod UV svetlom. 16 S rRNA 545 bp PCR amplikóny z oboch H. pylori
pozitívnu kontrolu žalúdočných biopsiou (Hp16S248Mar a 644Mar) a oboch amplikónov predstavujúcich neočakávané Hinf
obmedzenia Aj vzory (Hp16S563Mar a Hp16S587bp) boli podrobené sekvenovania s DyeTM Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction kit a ABI-3100 zakúpenie stroja od Applied Biosystems, v súlade s pokynmi výrobcu. Stanovenie sekvencie nukleotidov bola vykonaná v dvoch vyhotoveniach a porovnávacia analýza bola vykonaná základná vyrovnanie nukleotidu BLAST [37] príspevky
Autorské
RBS a CMA vykonal molekulárnej štúdie a prispeli k získavanie a interpretáciu dát .; MAS navrhol experimenty, prispel k analýze dát a navrhol rukopis. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis
Poznámky
Rodrigo Buzinaro Suzuki, Cristiane Maria Almeida prispelo rovnakou mierou k tejto práci
Skratky
PUD: ..
Vredová choroba

CG:
Chronická gastritída
GERD:
refluxná choroba
PCR:
polymerázová reťazová reakcia
RFLP:
polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov
tetra:
tetracyklín odpor
.
deklarácia
Poďakovanie
sme vďační Dr. Adriana Augusta Pimenta de Barros za jej starostlivosť o všetci pacienti zaradení do štúdie, a Dr David Howe za jeho prínos v edícii rukopis jazyk. Táto práca bola podporená Fundação de Amparo Pesquisa robiť Estado de Sao Paulo (FAPESP), výskumný grant 2006 /01223-0; Fellowship CMA 2005 /04087-7.
Protichodnými záujmami
Nemáme niektorý deklarovať.

• Genomické zmeny a molekulárnej subtypy žalúdočné rakoviny v Ázijcov
• Interobservační a intraobserver zmluva o žalúdočnej sliznice atrofia