La ausencia de Helicobacter pylori resistentes a la tetraciclina alta genotipo 16S rDNA AGA926-928TTC en muestras de biopsias gástricas de pacientes dispépticos de una ciudad en el interior de Sao Paulo, Brazil

ausencia de Helicobacter pylori resistentes a la tetraciclina
alta genotipo 16S rDNA AGA926-928TTC en biopsia gástrica las muestras de pacientes dispépticos de una ciudad en el interior de Sao Paulo, Brasil |
Resumen Antecedentes
la efectividad del tratamiento de Helicobacter pylori
varía según la región y está disminuyendo en todo el mundo, principalmente como resultado de la bacteria resistente a los antibióticos. La tetraciclina se incluye generalmente en la segunda línea H. pylori
regímenes de erradicación. En Brasil, un alto nivel de resistencia a la tetraciclina (TetR) se asocia principalmente con AGA926-928TTC 16 sustituciones de nucleótidos S rDNA. Como H. pylori Francia culture es fastidioso, se investigó la aparición primaria de H. pylori
16 S rDNA genotipo TetR alto nivel utilizando un enfoque molecular directamente en biopsias gástricas de pacientes dispépticos que asisten de forma consecutiva en el Hospital de Clínicas de Marília, Sao Paulo, Brasil.
Métodos
muestras de biopsias gástricas de 68 úlcera péptica (PUD) y 327 gastritis crónica (CG) de los pacientes con un diagnóstico histológico positivo de H. pylori
fueron investigados por TetR 16 S rDNA genotipo a través de un ensayo molecular basado en la amplificación de un fragmento de ADNr 16 S 545 pb por reacción en cadena de la polimerasa y HinfI
longitud de los fragmentos de restricción polimórficos (PCR /RFLP). A través de este ensayo, AGA926-928TTC 16 S rDNA TetR genotipo resultó en un patrón de fragmentos de restricción de ADN de tres (281, 227 y 37 pb) y su ausencia se originó dos fragmentos de ADN (264 y 281 pb), debido a una 16 S rDNA conservan Hinf I
sitio de restricción.
resultados comentario El fragmento de 545 pb 16 S rDNA PCR se amplificó a partir del 90% de las biopsias gástricas de pacientes H. pylori positivos
histológicos. HinfI
RFLP reveló ausencia de los H. pylori
genotipo y productos de PCR AGA926-928TTC de dos pacientes mostraron ausencia del conservada 16 S rDNA HinfI
sitio de restricción. BLASTN análisis de la secuencia de cuatro amplicones (dos conservado y dos con un patrón de restricción HinfI
imprevisto) reveló una homología del 99% de H. pylori
16 S rDNA de África, Norte y las bacterias aisladas de América del Sur. Una sustitución de nucleótidos abolido la HinfI conservada
sitio de restricción en los dos fragmentos de PCR con HinfI imprevisto
RFLP, dando como resultado un fragmento EcoRI
sitio de restricción.
Conclusiones
H. pylori
AGA926- 928TTC 16 S rDNA sustituciones de genes no fueron encontrados en nuestra población. Se requiere más investigación para investigar si H. pylori
TetR tiene una base genética diferente en nuestra región y si las sustituciones de nucleótidos de los incultos H. pylori
16 secuencias parciales S rRNA tener importancia biológica.
Palabras clave
Helicobacter pylori
tetraciclina resistencia Helicobacter pylori
16 S rDNA ácido nucleico diagnóstico basado Helicobacter pylori
16 S rDNA Antecedentes polimorfismo
es ampliamente aceptado que la Helicobacter pylori
, una bacteria Gram negativa microaerofılico , se asocia con varias enfermedades del sistema digestivo, tales como gastritis crónica, úlceras pépticas y duodenales, cáncer gástrico y trastornos linfoproliferativos [1]. No existe un régimen de tratamiento normalizado para H. pylori
infección [2] y una vez se detecta la bacteria en mucosa gástrica alterada, el tratamiento indicado consiste en un régimen antibiótico triple incluyendo metronidazol, claritromicina, amoxicilina, tinidazol, tetraciclina y fluoroquinolonas asociado con un inhibidor de la bomba de protones como el omeprazol, lansoprazol o pantoprazol [3-5], de acuerdo con las políticas de prescripción de antibióticos para la atención médica local.
H. pylori
tasas de erradicación con un número de agentes y regímenes combinados son cerca del 80% [6, 7], que varían de país a país y regionalmente dentro de los países [8]. Varios factores contribuyen a esta baja tasa de H. pylori
curación incluyendo la ineficacia de la penetración de los antibióticos en la mucosa gástrica, la inactivación del antibiótico por la secreción de ácido del estómago [9], la falta de cumplimiento del paciente [10] y principalmente, los casos de emergencia y aumento de H. pylori
cepas resistentes a antibióticos [11]. De este modo, regional H. pylori
vigilancia de la resistencia es de gran importancia para las estrategias de prueba y tratamiento. Hoteles en Brasil, un país de dimensiones continentales, la mayoría de los médicos en ejercicio se encuentran la tetraciclina, en una segunda línea régimen de tratamiento después del fracaso de la clásica régimen triple compuesto de claritromicina, amoxicilina y un inhibidor de la bomba de protones durante siete días para superar H. pylori
la infección [12].
H. pylori
resistencia a la tetraciclina (TetR) es baja en la mayoría de los países [13-15], por el contrario, en América Latina, según un pequeño número de estudios, se ha demostrado que es alta en Chile [16] y en Brasil [17]. Además, para algunos años la incidencia de TetR ha ido en aumento [15, 18-21]. En consecuencia, teniendo en cuenta la importancia clínica de primaria H. pylori
resistencia a los antibióticos, que debe ser considerado a nivel regional antes de ser incluidas en regímenes de erradicación.
El método de referencia para la determinación de H. pylori in vitro la susceptibilidad a
antibióticos corresponde al aislamiento del microorganismo por la cultura. Sin embargo, debido al lento crecimiento y las necesidades particulares de H. pylori Francia culture, este enfoque no es fiable para el uso en la mayoría de los laboratorios clínicos de rutina, principalmente en los países en desarrollo. Por lo tanto, las pruebas moleculares dirigidas a la resistencia asociada mutaciones de genes directamente de las muestras de biopsia tienen el potencial para su uso en estudios a gran escala [22-25]. México La mecanismo molecular de TetR consiste en su unión a una región específica 16 S rRNA, interactuando con estoicismo con la transferasa aminoacil-tRNA al sitio a del ribosoma. Este sitio de unión se ha definido en la resolución atómica en ribosomas de Thermus thermophilus
estando formada por dos dominios de la fracción 16 S rRNA que consiste en hélice 34 y el bucle de lado de hélice 31 [26, 27]. En H. pylori
aislamientos, el alto grado de TetR se debe principalmente a tres mutaciones de base, a partir de AGA926-928 TTC, en los 16 S rRNA rRNA genes /B [28, 29]. Las mutaciones en uno o dos de estas posiciones dan lugar a un bajo nivel de TetR [30, 31].
En Brasil, los estudios realizados en pacientes de Bragança Paulista, Sao Paulo, mostraron que el triple AGA926-928 a mutaciones se encuentran en TTC todo TetR H. pylori
aislados [32]. Por lo tanto, el uso de un enfoque molecular basada en una reacción en cadena de la polimerasa asociada con la longitud de los fragmentos de restricción polimórficos (PCR-RFLP), se investigó la incidencia primaria de H. pylori
alto nivel TetR directamente en muestras de biopsias gástricas obtenidas de pacientes dispépticos presentados a gastroscopia al hospital de clínicas de Marília, Sao Paulo, Brasil, desde enero de 2003 hasta julio de 2006.
resultados y discusión
resultado de la enfermedad gástrica de 1102 pacientes que acuden a consultas externas del hospital de clínicas de Marília fue investigado por endoscopia y la histopatología. hallazgo endoscópico de la úlcera péptica o duodenal (PUD) estaban presentes en 119 pacientes. Diferentes grados de gastritis crónica (GC) fueron observados por histopatología en 693 pacientes y otras alteraciones correspondientes en su mayoría a la enfermedad por reflujo gastroesofágico (ERGE) y la mucosa gástrica normal, se encontraron en 290 pacientes. Algunos pacientes presentan más de una alteración, con la patología más grave que se considera en el análisis.
La detección de H. pylori
se realizó directamente de las muestras de biopsia por histología, el estándar de oro H. pylori
prueba diagnóstica empleado en la rutina clínica que junto con el análisis histopatológico se utiliza para decidir por H. pylori
terapia de erradicación. De 119 PUD, 693 y CG 290 muestras de ERGE, 76, 359 y 2, respectivamente, fueron positivos para H. pylori fotos: por histología.
Una vez detectada en mucosa gástrica, una clásica H. pylori
erradicación de triple régimen se prescribe en nuestras clínicas de atención médica gastroenterología. Cuando el tratamiento de primera elección régimen de falla para erradicar H. pylori
, un régimen de segunda línea que contiene tetraciclina es el más indicado. H. pylori a los antibióticos
TetR varía según la región, siendo muy baja en Europa y América del Norte [2, 33, 34]. Sin embargo, en Asia [15, 19, 35] y América Latina, incluyendo Brasil [16, 32], una alta tasa de H. pylori
TetR se ha encontrado. terapia de la enfermedad Por lo tanto, con el fin de mejorar la elección de H. pylori servicios asociados, principalmente en caso de fallo de primera erradicación, se investigó el alto nivel regional de H. pylori
TetR mediante un enfoque molecular basado en PCR y RFLP directamente de la misma biopsia gástrica utilizado para la prueba rápida de ureasa. Sólo se incluyeron muestras de biopsias de los pacientes con H. pylori positivo
diagnóstico histológico. Se obtuvo un fragmento de 545 pb H. pylori
PCR a partir de ADN 16Sr 89,5% (68/76) y 91,1% (327/359) de las biopsias gástricas de pacientes PUD y CG, respectivamente. Como ambas pruebas se realizaron en un único y diferente biopsia gástrica y H. pylori
infección presenta una característica focal de la infección [36], para mejorar la sensibilidad de este método, el muestreo de biopsia múltiple se recomienda.
Secuencialmente, con el fin para detectar las principales mutaciones puntuales relacionadas, AGA a TTC en las posiciones 926, 927 y 928 de la H. pylori
16 S rDNA asociados con un alto nivel de TetR, y un genotipo único caracterizado TetR brasileña H. pylori
aislados [32], el fragmento 545 pb 16 S rDNA PCR se restringió con HinfI
. En este H. pylori
16 S rDNA amplicón hay un HinfI
sitio de restricción conservado, que proporciona un control interno de la digestión enzimática, lo que resulta en un patrón de fragmentos de restricción de ADN de dos, cuando la sustitución de nucleótidos AGA926-928TTC triple es ausente. De 395 muestras de PCR, 393 presentó el patrón de fragmentos de restricción de ADN de dos y dos productos de PCR obtenidos a partir de un paciente PUD (Hp16S563Mar) y un paciente CG (Hp16S587bp) no fueron digeridas por HinfI
. El genotipo resistente a la tetraciclina AGA926-928TTC alta depende de H. pylori
16 S rDNA no estaba presente en nuestra población. Estos resultados pueden ser indicativos de H. pylori
alto nivel TetR ausencia o que en nuestra región otros 16 sustituciones de nucleótidos S rDNA o diferentes factores genéticos están involucrados en la resistencia a la tetraciclina, tal como se encuentra en otros estudios [21]. Más investigación ha de llevarse a cabo para confirmar o descartar estas hipótesis.
Con el fin de confirmar la especificidad del 545 pb H. pylori
16 productos S rDNA PCR amplificados a partir de biopsias gástricas, los fragmentos de 545 pb de PCR obtenidos a partir de dos H. pylori
pacientes PUD positivas utilizadas como controles en las reacciones de PCR (Hp16S248Mar y Hp16S644Mar), y los 545 pb fragmentos de PCR con HinfI inesperado patrón de restricción
llamado Hp16S563Mar y Hp16S587bp, se secuenciaron y se analizaron por búsqueda básica BLASTN [ ,,,0],37]. Las cuatro secuencias presentan 99% de homología con el 16 S rDNA del oeste y el sur de África, el sur y el norte de América del H. pylori
aislamientos. Las mutaciones puntuales se encuentran en cada analizaron secuencia de PCR en comparación con el H. pylori
16 secuencias de referencia S de ADNr que presentan mayor homología con los amplicones obtenidos se resumen en la Tabla 1. Supresión de la HinfI
sitio de restricción de Hp16S563 y 587Mar resultó a partir de una sustitución de nucleótidos en la posición 958, originarios de un fragmento EcoRI
sitio de restricción. Por lo tanto, las sustituciones de nucleótidos en estos 16 S 545 bp fragmentos de PCR se confirmaron por análisis de restricción EcoRI
(datos no mostrados). La importancia biológica de sustituciones de nucleótidos que se encuentra en nuestras 16 S incultos H. pylori
fragmentos de PCR que hay que investigar. Tabla 1 Comparación de Helicobacter pylori 545 pb 16 polimorfismos de nucleótido S rDNA entre las referencias y las cepas de la bacteria H. incultos
pyloristrain +
16 posiciones de nucleótidos S rDNA #

926-928

947

954-959

981

988

1092

1093

1097

SouthAfrica07
AGA
Un
GAATCC
Un
T
T
C
G
2017WestAfrica
AGA
Un
GAATCC
Un
T
T
C
G
EU544200USA
AGA
Un
GAATCC
Un
T
T
T
G
Puno /Perú
AGA
Un
GAATCC
G
C
T
C
G
Hp16S248Mar
AGA
G
GAATCC
Un
T
T
C
Un
Hp16S644Mar
AGA
Un
GAATCC
A
T
G
C
G
Hp16S563Mar
AGA
Un
GAATTC
Un
T
T
T
G
Hp16S587Mar
AGA
Un
GAATTC
G
C
T
C
G #
basado en H. pylori
referencia cepa 26995; + Los números de acceso de la H. pylori
secuencia de cepas para SouthAfrica07, 2017WestAfrica, EU544200USA, Puno /Perú, Hp16S248Mar, Hp16S644mar, Hp16S563Mar y Hp16S567Mar son, respectivamente: [GenBank: CP002336.1, GenBank: CP002571.1, GenBank: EU544200.1, GenBank: CP002982.1, GenBank: JQ315410, GenBank: JQ315411, GenBank: JQ315412 y GenBank:. JQ315413]
Conclusiones Francia El TetR H. pylori
genotipo de alto nivel que dependen de AGA926-929TTC 16 sustituciones de genes S rDNA no se ha encontrado en nuestra población. Se requiere más investigación para investigar si H. pylori
alta tasa TetR está ausente o si está asociado con un fondo genético de bacterias diferentes en nuestra región. Además, la importancia biológica de las sustituciones de nucleótidos imprevistos del Marilia Uncultured H. pylori
16 S secuencia parcial del ADNr necesita más investigación.
Métodos Los pacientes

1.102 pacientes adultos residentes en la ciudad de Marília, Sao Paulo Estado, Brasil, de entre 19 y 91 años, que tenía esofagogastroduodenoscopía consecutivamente sufrida (EGD) para el dolor abdominal superior o síntomas dispépticos desde enero de 2003 hasta julio de 2006 a la consulta de digestivo del hospital de las clínicas de la Facultad de Medicina de Marília, se inscribieron en este estudio.
endoscopia, biopsias México La EGD se logró mediante fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) o video-endoscopio (GIF-100), tanto desde el Olimpo. diagnóstico úlcera gástrica o duodenal fue definida por endoscopia y se recogieron dos fragmentos del antro para llevar a cabo la rápida de ureasa y Análisis histopatológicos. La biopsia utilizado para la prueba rápida de ureasa se presenta de conformidad con la extracción de ADN. El protocolo utilizado está de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Humana de la Facultad de Medicina de Marília, con el número de referencia 388/01.
Histología
Una muestra antrales se fijó en solución de formol al 10% y embebidos en parafina. Las secciones fueron teñidas con Giemsa para H. pylori Evaluación Opiniones y se tiñeron con hematoxilina y eosina para la evaluación de las alteraciones histopatológicas [38].
Reacción en cadena de la polimerasa extracción de ADN y reacción en cadena de la polimerasa
y análisis de restricción se establecieron con la misma biopsia utilizado para la prueba rápida de ureasa. Este se sometió a extracción de ADN con el empleo del kit de extracción de ADN GFX adquirido de Amersham /Pharmacia Biotech, siguiendo las instrucciones del fabricante. ADN se cuantificó en la electroforesis en gel de agarosa utilizando la escala de masa baja Invitrogem y 50-100ηg se utilizaron en las reacciones de PCR con el conjunto de cebadores Hp16Sr1 (sentido),): 5 'AAC ATT ACT GAC GCT GAT TG 3'; Hp16S r2 (antisentido): 5 'TGG CTC CAC TTC GCA GTA TT 3', que amplifican un fragmento conservado de 545 pb correspondiente a la H. pylori
16 gen S rRNA entre las posiciones de nucleótidos 700 y 1245 (numeración de acuerdo con la rRNA gen de H. pylori cepa 26695
), modificado a partir de [32]. En todas las reacciones de PCR negativo y un control positivo se utilizaron correspondiente a, respectivamente, agua estéril y dos diferentes ureasa de H. pylori
biopsias gástricas de pacientes positivos PUD. condición de la PCR fue de 94 ° C 5 'seguido de 40 ciclos de 94 ° C 1' /55 ° C 1 '/72 ° C 1' y un ciclo a 72 ° C 7 ', con un volumen total de 25 l que contiene 1x PCR tampón, dNTP 200 mM, MgCl 2,0 mM 2, 1μM oligoHp16Sr1, 1μM oligo Hp16Sr2, 1,25 U Taq ADN polimerasa Platinum Brasil (Invitrogen), 2,5% de DMSO, 50ηg ADN. Los productos de PCR se resolvieron en geles de agarosa al 1,5% teñidos con bromuro de etidio y se fotografiaron bajo luz UV.
Restricción y el análisis de secuenciación
Los 16 S rDNA amplificados 545 pb obtenido por PCR a partir de muestras de biopsia se digirieron con HinfI
I (Biolab - New England) según las instrucciones del fabricante. El patrón de restricción previsible para la tetraciclina susceptibles H. pylori cepas
corresponde a dos fragmentos de 264 y 281 pb y presencia de H. pylori
cepas con alta resistencia a la tetraciclina corresponde a tres fragmentos de 281, 227 y 37 pb. Los productos de análisis de restricción se resolvieron en geles de acrilamida al 8%, teñido con bromuro de etidio y se fotografiaron bajo luz UV. 16 S rRNA 545 pb amplicones de PCR de las dos pylori
de control positivo biopsias gástricas (H. Hp16S248Mar y 644Mar) y los dos amplicones que presentan inesperados Hinf
patrones de restricción I (Hp16S563Mar y Hp16S587bp) fueron sometidos a secuenciación con DyeTM Terminator v3.0 ciclo de Secuenciación kit Ready Reaction y una máquina ABI-3100 adquirido de Applied Biosystem, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. determinación de la secuencia de nucleótidos se realizó por duplicado y el análisis comparativo se llevó a cabo por la alineación básica de nucleótidos BLAST [37] contribuciones
del Autor
RBS y CMA llevaron a cabo los estudios moleculares y contribuyeron a la adquisición e interpretación de datos.; MAS diseñado los experimentos, contribuyó al análisis de datos y redactó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final
Notas
Rodrigo Buzinaro Suzuki, Cristiane Maria Almeida contribuyeron igualmente a este trabajo
abreviaciones
PUD:..
Úlcera péptica enfermedad

CG:
La gastritis crónica
ERGE:
la enfermedad por reflujo gastroesofágico
PCR: reacción en cadena de la polimerasa

RFLP:
restricción polimorfismo de longitud de fragmentos de
TetR:
resistencia a la tetraciclina
.
Declaraciones
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Adriana Augusta Pimenta de Barros por su atención a todos los pacientes incluidos en el estudio y el Dr. David Howe por su contribución en la edición de el lenguaje de manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de São Paulo (FAPESP), Beca de investigación 2006 /01223-0; Comunión CMA 2005 /04087-7.
Conflicto de intereses
No tenemos ninguna para declarar.

• alteraciones genómicas y subtipos moleculares de cáncer gástrico en los asiáticos
• Entre observadores y en un observador convenio para la atrofia de la mucosa gástrica