L'assenza di Helicobacter pylori resistente alle alte tetraciclina genotipo 16S rDNA AGA926-928TTC nei campioni bioptici gastrici di pazienti dispeptici di una città all'interno di San Paolo, Brasile

L'assenza di Helicobacter pylori
resistente alle alte tetraciclina genotipo 16S rDNA AGA926-928TTC in campioni bioptici gastrici da pazienti dispeptici di una città all'interno di San Paolo, Brasile
Abstract
sfondo
efficacia del trattamento di Helicobacter pylori
varia regionalmente e sta diminuendo in tutto il mondo, principalmente per effetto del batterio resistente agli antibiotici. Tetraciclina è generalmente incluso in seconda linea H. pylori
regimi di eradicazione. In Brasile, un elevato livello di resistenza alla tetraciclina (TetR) è principalmente associato con AGA926-928TTC 16 S rDNA sostituzioni nucleotidiche. Come H. pylori
cultura è fastidioso, abbiamo studiato l'insorgenza primaria di H. pylori
16 S rDNA genotipo TetR alto livello utilizzando un approccio molecolare direttamente su biopsie gastriche di pazienti dispeptici che frequentano consecutivamente in ospedale das Clinicas di Marilia, Sao Paulo, Brasile.
Metodi
campioni bioptici gastrici di 68 ulcera peptica (PUD) e 327 pazienti gastrite cronica (CG) con una diagnosi istologica positiva di H. pylori
sono stati studiati per TetR 16 S rDNA genotipo attraverso un test molecolare basato sull'amplificazione di un 16 S rDNA 545 bp frammento dalla reazione a catena della polimerasi e HinfI
lunghezza dei frammenti di restrizione polimorfismo (PCR /RFLP). Attraverso questa analisi, AGA926-928TTC 16 S rDNA TetR genotipo ha determinato un modello di restrizione frammento di DNA di tre (281, 227 e 37 bp) e la sua assenza ha avuto origine due frammenti di DNA (264 e 281 bp) a causa di una S rDNA 16 conservati Hinf I Il portale di restrizione
. Risultati
Il 545 bp 16 S rDNA PCR frammento è stato amplificato dal 90% delle biopsie gastriche da pylori
pazienti positivi istologici H.. HinfI
RFLP ha rivelato l'assenza dei AGA926-928TTC H. pylori
genotipo e prodotti di PCR di due pazienti hanno mostrato assenza del conservato 16 S rDNA HinfI portale di restrizione. BLASTN analisi della sequenza di quattro amplificati (due conservato e due con un HinfI
modello restrizione imprevisto) ha rivelato una omologia del 99% di H. pylori
16 S rDNA da Africa, Nord e Sud America isolati batterici. Un nucleotide sostituzione abolito la conservato HinfI portale di restrizione nei due frammenti di PCR con imprevisto HinfI
RFLP, con un conseguente EcoRI portale di restrizione.
Conclusioni
H. pylori
AGA926- 928TTC 16 S rDNA sostituzioni di geni non sono state trovate nella nostra popolazione. Sono necessarie ulteriori ricerche per indagare se H. pylori
TetR ha un background genetico diverso nella nostra regione e se le sostituzioni nucleotidiche del incolto H. pylori
16 S rRNA sequenze parziali hanno significato biologico.
Parole chiave
Helicobacter pylori
tetraciclina resistenza Helicobacter pylori
16 S rDNA acido nucleico diagnosi basata Helicobacter pylori
16 S rDNA polimorfismo Sfondo
è ampiamente accettato che Helicobacter pylori
, un batterio Gram negativo microaerofili , è associata a diverse malattie del tratto digerente come la gastrite cronica, ulcere peptiche e duodenali, cancro gastrico e malattie linfoproliferative [1]. Non vi è alcun regime di trattamento standard per H. pylori
infezione [2] e una volta che viene rilevato il batterio nella mucosa gastrica alterata, il trattamento indicato è costituito da un regime antibiotico tripla tra cui metronidazolo, claritromicina, amoxicillina, tinidazolo, tetraciclina e fluorochinoloni associati con un inibitore della pompa protonica come omeprazolo, lansoprazolo o pantoprazolo [3-5], in base ai criteri di prescrizione di antibiotici per l'assistenza medica locale.
H. pylori
tassi di eradicazione con un certo numero di agenti combinati e regimi sono vicine al 80% [6, 7], che varia da paese a paese e regionale all'interno dei paesi [8]. Diversi fattori contribuiscono a questo basso tasso di H. pylori
guarigione compresa l'inefficienza della penetrazione antibiotico nella mucosa gastrica, inattivazione dell'antibiotico dalla secrezione acida dello stomaco [9], la mancanza di compliance del paziente [10] e principalmente, i casi di emergenza e aumento di H. pylori
ceppi resistenti agli antibiotici [11]. Così, regionale H. pylori
sorveglianza della resistenza è di grande importanza per le strategie di test e di trattamento.
In Brasile, un paese di dimensioni continentali, la maggior parte dei medici che praticano includono tetraciclina in un secondo regime di trattamento linea dopo fallimento del classica triplo regime composto da claritromicina, amoxicillina e un inibitore della pompa protonica per sette giorni di tempo per superare H. pylori
infezione [12].
H. pylori
resistenza alla tetraciclina (TetR) è bassa nella maggior parte dei paesi [13-15], al contrario, in America Latina, secondo un piccolo numero di studi, è stato dimostrato per essere elevata in Cile [16] e in Brasile [17]. Inoltre, per alcuni anni l'incidenza di TetR è aumentata [15, 18-21]. Pertanto, considerando l'importanza clinica di primaria H. pylori
resistenza agli antibiotici, dovrebbe essere considerato regionale prima di essere inclusi nei regimi di eradicazione.
Il metodo standard di riferimento per la determinazione di H. pylori in vitro
suscettibilità alle antibiotici corrisponde all'isolamento del microrganismo dalla cultura. Tuttavia, a causa della crescita lenta e le particolari esigenze di H. pylori
cultura, questo approccio non è affidabile per l'uso nella maggior parte dei laboratori clinici di routine, soprattutto nei paesi in via di sviluppo. Quindi, i test molecolari di targeting di resistenza associata mutazioni del gene direttamente da campioni bioptici hanno il potenziale per l'utilizzo in studi su larga scala [22-25].
Il meccanismo molecolare di TetR consiste in suo legame ad una specifica regione 16 S rRNA, interagendo stoicamente con la transferasi-tRNA al sito a del ribosoma. Questo sito di legame è stato definito dalla risoluzione atomica in ribosomi di Termo thermophilus
essere formato da due domini della frazione 16 S rRNA composto da elica 34 e il ciclo successivo a Helix 31 [26, 27]. In H. pylori
isolati, l'elevato grado di TetR è dovuta principalmente a tre mutazioni di base, da AGA926-928 al TTC, nei 16 S rRNA geni rRNA /B [28, 29]. Le mutazioni in uno o due di queste posizioni si traducono in un basso livello di TetR [30, 31].
In Brasile, gli studi condotti su pazienti provenienti da Bragança Paulista, San Paolo, hanno mostrato che AGA926-928 tripla a mutazioni TTC si trovano in tutto TetR H. pylori
isolati [32]. Quindi, utilizzando un approccio molecolare basato su una reazione a catena della polimerasi associata a test della lunghezza dei frammenti di restrizione polimorfismo (PCR-RFLP), abbiamo studiato l'incidenza primaria di H. pylori
alto livello TetR direttamente in campioni bioptici gastrici ottenuti da pazienti dispeptici presentati a gastroscopia in ospedale das Clinicas di Marilia, San Paolo del Brasile, da gennaio 2003 a luglio 2006.
Risultati e discussione
esito della malattia gastrica di 1102 pazienti che frequentano la clinica ambulatoriale gastroenterologia dell'Ospedale Das Clínicas di Marília è stato studiato da endoscopia e istopatologia. ritrovamento endoscopica di ulcera peptica o duodenale (PUD) erano presenti in 119 pazienti. Diversi gradi di gastrite cronica (CG) sono stati osservati da istopatologia in 693 pazienti e altre alterazioni corrispondenti per lo più alla malattia da reflusso gastroesofageo (GERD) e normale mucosa gastrica, sono stati trovati in 290 pazienti. Alcuni pazienti hanno presentato più di una alterazione, con la più grave patologia presa in considerazione nell'analisi
. Rilevazione di H. pylori
è stato eseguito direttamente dai campioni bioptici per esame istologico, lo standard di H. pylori oro
test diagnostico impiegato nella nostra routine clinica che, insieme con l'analisi istopatologica viene utilizzato per decidere per H. pylori
terapia di eradicazione. Di 119 PUD, 693 CG e 290 campioni di malattia da reflusso gastroesofageo, 76, 359 e 2, rispettivamente, sono stati positivi per H. pylori
da istologia.
Una volta rilevato nella mucosa gastrica, una classica H. pylori
eradicazione tripla regime è prescritto nelle nostre cliniche gastroenterologia di assistenza sanitaria. Quando terapia di prima scelta di regime non riesce a debellare H. pylori
, un secondo regime riga contenente tetraciclina è la più indicata. H. pylori
antibiotico TetR varia a livello regionale, essendo molto basso in Europa e Nord America [2, 33, 34]. Tuttavia, in Asia [15, 19, 35] e in America Latina, tra cui Brasile [16, 32], un alto tasso di H. pylori
TetR è stato trovato. La terapia della malattia Pertanto, al fine di migliorare la scelta di H. pylori
associato, principalmente in caso di primo guasto eradicazione, abbiamo studiato l'elevato livello regionale di H. pylori
TetR utilizzando un approccio molecolare basato su PCR e RFLP direttamente dalla stessa biopsia gastrica usato per test rapido. Solo campioni bioptici di pazienti con positivo H. pylori
diagnosi istologica sono stati inclusi. A 545 bp H. pylori
16SrDNA PCR frammento è stato ottenuto dal 89,5% (68/76) e il 91.1% (327/359) di biopsie gastriche di pazienti PUD e CG, rispettivamente. Mentre entrambi i test sono stati eseguiti su un unico e differente biopsia gastrica e H. pylori
infezione presenta una caratteristica focale di infezione [36], per migliorare la sensibilità di questo metodo, il campionamento biopsia multipla è raccomandato
. Sequenziale, in ordine per rilevare i principali mutazioni puntiformi correlate, AGA per TTC nelle posizioni 926, 927 e 928 del H. pylori
16 S rDNA associati con un elevato livello di TetR, e un genotipo unico caratterizzato brasiliana TetR H. pylori
isolati [32], il 545 bp frammento di 16 S rDNA PCR è stato limitato con HinfI
. In questo H. pylori
16 S rDNA ampliconi c'è un HinfI portale di restrizione conservato, che fornisce un controllo interno della digestione enzimatica, con un conseguente modello di restrizione frammento di DNA di due, quando la tripla sostituzione nucleotidica AGA926-928TTC è assente. Di 395 campioni di PCR, 393 presentato il modello di restrizione frammento di DNA di due e due prodotti di PCR ottenuti da un PUD (Hp16S563Mar) del paziente e un paziente CG (Hp16S587bp) non sono stati digeriti da HinfI
. Il resistente AGA926-928TTC genotipo alta tetraciclina dipendente da H. pylori
16 S rDNA non era presente nella nostra popolazione. Questi risultati possono essere indicativi di H. pylori
alto livello TetR assenza o che nella nostra regione altri 16 sostituzioni nucleotidiche S rDNA o diversi fattori genetici sono coinvolti nella resistenza alla tetraciclina, come trovata da altri studi [21]. Più ricerca deve essere effettuato per confermare o escludere queste ipotesi.
Al fine di confermare la specificità del 545 bp H. pylori
16 S rDNA prodotti della PCR amplificati da biopsie gastriche, i 545 bp frammenti di PCR ottenuti da due H. pylori
pazienti PUD positivi utilizzati come controlli nelle reazioni PCR (Hp16S248Mar e Hp16S644Mar), e le 545 bp frammenti di PCR con imprevisto HinfI modello
restrizione di nome Hp16S563Mar e Hp16S587bp, sono stati sequenziati e analizzati da ricerca di base BLASTN [ ,,,0],37]. Tutte e quattro le sequenze presentate il 99% omologia al 16 S rDNA da West e del Sud Africa, Sud e Nord America H. pylori
isolati. Le mutazioni puntiformi si trovano in ogni analizzati sequenza di PCR rispetto al H. pylori
16 sequenze di riferimento S rDNA che presentano maggiore omologia con gli ampliconi ottenuti sono riassunti nella Tabella 1. Abolizione della HinfI portale di limitazione della Hp16S563 e 587Mar portato da un nucleotide sostituzione alla posizione 958, originari di uno EcoRI portale di restrizione. Così, le sostituzioni nucleotidiche in questi 16 S 545 bp frammenti di PCR sono stati confermati da EcoRI
analisi di restrizione (dati non riportati). Il significato biologico di sostituzioni nucleotidiche trovato nei nostri 16 S incolti H. pylori
PCR frammenti ha bisogno di essere indagato. Tabella 1 Confronto di Helicobacter pylori 545 bp 16 S rDNA polimorfismi nucleotidici tra riferimenti e ceppi batterio incolti
H. pyloristrain +
16 S rDNA posizioni nucleotidiche #

926-928

947

954-959

981

988

1092

1093

1097

SouthAfrica07
AGA
Un
GAATCC

a T
T
C
G
2017WestAfrica
AGA
Un
GAATCC
Un
T
T
C
G
EU544200USA
AGA
Un
GAATCC

a T
T
T
G
Puno /Perù
AGA
Un
GAATCC
G
C
T
C
G
Hp16S248Mar
AGA
G
GAATCC

a T
T
C
Un
Hp16S644Mar
AGA
Un
GAATCC
A
T
G
C
G
Hp16S563Mar
AGA
Un
GAATTC

a T
T
T
G
Hp16S587Mar
AGA
Un
GAATTC
G
C
T
C
G
# sulla base di H. pylori
di riferimento ceppo 26995; + Il numero di adesione del H. pylori
sequenza di ceppi per SouthAfrica07, 2017WestAfrica, EU544200USA, Puno /Perù, Hp16S248Mar, Hp16S644mar, Hp16S563Mar e Hp16S567Mar sono rispettivamente: [GenBank: CP002336.1, GenBank: CP002571.1, GenBank: EU544200.1, GenBank: CP002982.1, GenBank: JQ315410, GenBank: JQ315411, GenBank: JQ315412 e GenBank:. JQ315413]
Conclusioni
Il TetR H. pylori
genotipo ad alto livello dipendenti AGA926-929TTC 16 S rDNA sostituzioni gene non è stato trovato nella nostra popolazione. Sono necessarie ulteriori ricerche per indagare se H. pylori
alto tasso TetR è assente o se è associato con un diverso background genetico dei batteri nella nostra regione. Inoltre, il significato biologico delle sostituzioni nucleotidiche imprevisti del Marilia incolto H. pylori
16 S rDNA sequenza parziale necessita di ulteriori indagini.
Metodi
pazienti
1102 adulti pazienti residenti nella città di Marilia, São Paulo Stato, Brasile, di età compresa tra 19 e 91 anni, che ha avuto esofagogastroduodenoscopia consecutivamente sottoposti (EGDS) per il dolore addominale superiore o sintomi dispeptici da gennaio 2003 a luglio 2006 la clinica di gastroenterologia ambulatorio dell'Ospedale Das Clínicas di Marília Medical School, sono stati arruolati in questo studio
. endoscopia, biopsie
Il EGD è stato realizzato da fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) o un video-endoscopio (GIF-100) sia da Olympus. la diagnosi di ulcera gastrica o duodenale è stato definito mediante endoscopia e due frammenti del antro sono stati raccolti per effettuare la rapida dell'ureasi e test istopatologici. La biopsia utilizzato per la prova dell'ureasi rapida è stata ulteriormente sottoposta ad estrazione del DNA. Il protocollo utilizzato è in accordo con la Dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal Comitato Etico di umano di ricerca da Marilia Medical School, con il numero di riferimento 388/01.
Istologia
Un esemplare antrali è stato fissato in formalina soluzione al 10% e inclusi in paraffina. Le sezioni sono state colorate per Giemsa H. pylori
valutazione e sono state colorate con ematossilina e eosina per la valutazione delle alterazioni istopatologiche [38].
Estrazione del DNA e polymerase chain reaction
polymerase chain reaction e analisi di restrizione sono stati istituiti con la stessa biopsia utilizzato per il test rapido dell'ureasi. Questo è stato sottoposto ad estrazione del DNA con l'impiego del kit di estrazione del DNA GFx acquistato da Amersham /Pharmacia Biotech, seguendo le istruzioni del produttore. DNA è stato quantificato in elettroforesi su gel di agarosio utilizzando la scala Invitrogem bassa massa e 50-100ηg sono stati utilizzati nelle reazioni PCR con il primer set Hp16Sr1 (senso),): 5 'AAC ATT ACT GAC GCT GAT TG 3'; Hp16S r2 (antisenso): 5 'TGG CTC CAC TTC GCA GTA TT 3', che amplificano un frammento conservato di 545 bp corrispondente al H. pylori
16 S rRNA gene tra nucleotide posizioni 700 e 1245 (numerati secondo la rRNA gene di H. pylori
ceppo 26695), modificato da [32]. In tutte le reazioni di PCR negativo e un controllo positivo sono stati utilizzati corrispondenti, rispettivamente, acqua sterile e due diversi ureasi H. pylori
biopsie gastriche positivi da pazienti PUD. condizioni PCR era 94 ° C 5 'seguita da 40 cicli di 94 ° C 1' /55 ° C 1 '/72 ° C 1' ed un ciclo a 72 ° C 7 ', con un volume totale di 25 microlitri contenente 1x PCR tampone, 200 micron dNTP, 2,0 mm MgCl 2, 1μM oligoHp16Sr1, 1μM oligo Hp16Sr2, 1,25 U Taq DNA Polymerase Platinum Brasile (Invitrogen), 2,5% DMSO, 50ηg DNA. I prodotti di PCR sono stati risolti in 1,5% gel di agarosio colorati con bromuro di etidio e fotografati sotto la luce UV.
Restrizione e analisi di sequenziamento
I 16 S rDNA ampliconi 545 bp ottenuti mediante PCR da campioni bioptici sono stati digeriti con Hinf
I (Biolab - New England) secondo le istruzioni del produttore. Il modello di restrizione prevedibile per suscettibili H. pylori
ceppi tetracicline corrisponde a due frammenti di 264 e 281 bp e per H. pylori
ceppi con elevata resistenza tetraciclina corrisponde a tre frammenti di 281, 227 e 37 bp. I prodotti di analisi di restrizione sono stati risolti in 8% gel di acrilamide, colorati con bromuro di etidio e fotografati sotto la luce UV. 16 S rRNA 545 bp PCR amplificati dai due H. pylori
controllo positivo biopsie gastriche (Hp16S248Mar e 644Mar) e due ampliconi presentano inaspettati Hinf
modelli I restrizione (Hp16S563Mar e Hp16S587bp) sono stati sottoposti a sequenziamento con DyeTM Terminator v3.0 ciclo di sequenziamento kit di reazione pronta e una macchina ABI-3100 acquistato da Applied Biosystem, secondo le istruzioni del produttore. determinazione sequenza nucleotidica è stata eseguita in duplice copia e l'analisi comparativa è stata effettuata da un allineamento dei nucleotidi BLAST base [37] contributi
d'autore
RBS e CMA effettuati gli studi molecolari e hanno contribuito alla acquisizione e l'interpretazione dei dati.; MAS progettato gli esperimenti, ha contribuito all'analisi dei dati e ha redatto il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale
Note
Rodrigo Buzinaro Suzuki, Cristiane Maria Almeida contribuito ugualmente a questo lavoro
Abbreviazioni
PUD:..
Peptica ulcera

CG:
gastrite cronica
GERD:
malattia da reflusso gastroesofageo
PCR: reazione a catena della polimerasi

RFLP:
rflp
TetR:
resistenza alla tetraciclina
.
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Siamo grati al Dr. Adriana Augusta Pimenta de Barros per la sua cura per tutti i pazienti inclusi nello studio e il Dr. David Howe per il suo contributo nella edizione di la lingua manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fundação de Amparo un Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Research Grant 2006 /01.223-0; Fellowship CMA 2005 /04.087-7.
Interessi concorrenti
Non abbiamo alcuna da dichiarare.

• alterazioni genomiche e sottotipi molecolari di cancro gastrico negli asiatici
• Inter e intra accordo per mucosa gastrica atrophy