Fravær af Helicobacter pylori høj tetracyclin resistente 16S rDNA AGA926-928TTC genotype i gastrisk biopsi prøver fra dyspeptiske patienter i en by i det indre af São Paulo, Brazil

Fravær af Helicobacter pylori
høj tetracyclin resistente 16S rDNA AGA926-928TTC genotype i gastrisk biopsi prøver fra dyspeptiske patienter i en by i det indre af São Paulo, Brazil
Abstrakt
Baggrund
Behandling effektiviteten af ​​Helicobacter pylori
varierer regionalt og er faldende over hele verden, hovedsageligt som følge af antibiotika resistente bakterie. Tetracyklin er generelt inkluderet i anden linje H. pylori
for udryddelse regimer. I Brasilien er en høj grad af tetracyclin resistens (TetR), hovedsagelig i forbindelse med AGA926-928TTC 16 S rDNA nucleotidsubstitutioner. Som H. pylori
kultur er kræsen, undersøgte vi den primære forekomst af H. pylori
16 S rDNA højt TetR genotype under anvendelse af en molekylær metode direkte på gastriske biopsier af dyspeptiske patienter tilmeldt konsekutivt på Hospital das Clinicas af Marilia, São Paulo, Brasilien.
Metoder
Gastric biopsipræparater af 68 mavesår sygdom (PUD) og 327 kronisk gastritis (CG) patienter med en positiv histologisk diagnose af H. pylori
blev undersøgt for TetR 16 S rDNA genotype gennem en molekylær assay baseret på amplifikation af en 16 S rDNA 545 bp fragment ved polymerasekædereaktion og HinfI
restriktionsfragmentlængde-polymorfisme (PCR /RFLP). Gennem dette assay AGA926-928TTC 16 S rDNA TetR genotype resulterede i en tre DNA-fragment restriktionsmønster (281, 227 og 37 bp) og dens fravær stammer to DNA-fragmenter (264 og 281 bp) som følge af en 16 S rDNA konserveret Hinf I
restriktionssted.
Resultater
545 bp 16 S rDNA PCR-fragment blev amplificeret fra 90% af gastriske biopsier fra histologiske H. pylori
positive patienter. HinfI
RFLP afslørede fravær af de AGA926-928TTC H. pylori
genotype og PCR-produkter fra to patienter viste fraværet af den bevarede 16 S rDNA HinfI
restriktion site. BLASTN sekvensanalyse af fire amplikoner (to bevaret og to med en uforudset HinfI
begrænsning mønster) viste en 99% homologi til H. pylori
16 S rDNA fra Afrika, Nord- og Sydamerika bakterielle isolater. En nukleotid substitution afskaffet det konserverede HinfI
restriktionssted i de to PCR-fragmenter med uforudsete HinfI
RFLP, hvilket resulterer i en EcoRI
restriktionssted.
Konklusioner
H. pylori
AGA926- 928TTC 16 S rDNA gen udskiftninger blev ikke fundet i vores befolkning. Der kræves mere forskning for at undersøge, om H. pylori
TetR har en anden genetisk baggrund i vores region, og hvis nukleotidsubstitutioner af ukultiverede H. pylori
16 S rRNA delsekvenser har biologisk betydning.
Keywords
Helicobacter pylori
tetracyclin resistens Helicobacter pylori
16 S rDNA Nucleic acid baseret diagnose Helicobacter pylori
16 S rDNA polymorfi Baggrund
Det er almindeligt accepteret, at Helicobacter pylori
, en Gram negativ mikroaerofil bakterie , er forbundet med adskillige fordøjelseskanalen sygdomme såsom kronisk gastritis, ulcus og duodenal ulcera, gastrisk cancer og lymfoproliferative sygdomme [1]. Der er nogen standardiseret behandlingsregime for H. pylori
infektion [2] og når bakterien påvises i ændret maveslimhinden, den angivne behandling består af en tredobbelt antibiotisk regimen herunder metronidazol, clarithromycin, amoxicillin, tinidazol, tetracyklin og fluorquinoloner forbundet med en protonpumpehæmmer, såsom omeprazol, lansoprazol eller pantoprazol [3-5], i henhold til antibiotiske recept politikker for lokal lægehjælp.
H. pylori
satser udryddelsesforanstaltninger med en række kombinerede agenter og regimer er tæt på 80% [6, 7], der varierer fra land til land og regionalt inden for landene [8]. Adskillige faktorer bidrager til denne lave H. pylori
healing herunder ineffektiviteten af ​​den antibiotiske indtrængen i maveslimhinden, inaktivering af antibiotikummet ved syresekretion i maven [9], manglende overholdelse patient [10] og hovedsagelig, nødsituationer og stigning i H. pylori
antibiotikaresistente stammer [11]. Således regional H. pylori
modstand overvågning er af stor betydning for test- og behandlingsstrategier.
I Brasilien, et land af kontinentale dimensioner, de fleste praktiserende læger omfatter tetracyclin i en anden linje behandlingsregime efter svigt af klassisk triple regime bestående af claritromycin, amoxicillin og en protonpumpehæmmer i syv dage til at overvinde H. pylori
infektion [12].
H. pylori
resistens mod tetracyclin (TetR) er lav i de fleste lande [13-15], omvendt i Latinamerika, ifølge et lille antal undersøgelser, det har vist sig at være høj i Chile [16] og i Brasilien [17]. Desuden er det for nogle år incidensen af ​​TetR har været stigende [15, 18-21]. Derfor overvejer den kliniske betydning af primær H. pylori
resistens over for antibiotika, bør det overvejes, regionalt, før de indgår i udryddelsesprogrammer regimer.
Gyldne standard metode til bestemmelse af H. pylori in vitro
følsomhed over for antibiotika svarer til isolering af mikroorganismen ved dyrkning. På grund af den langsomme vækst og de særlige krav til H. pylori
kultur, er denne fremgangsmåde ikke pålidelige til brug i de fleste rutinemæssige kliniske laboratorier, og navnlig i udviklingslandene. Derfor molekylære test målretning resistens associeret genmutationer direkte fra biopsiprøver har potentiale til anvendelse i undersøgelser i stor målestok [22-25].
Den molekylære mekanisme af TetR består af dets binding til en specifik 16 S rRNA region, interagere stoically med aminoacyl-tRNA transferase til A-stedet i ribosomet. Dette bindingssted er blevet defineret af atomar opløsning i ribosomer af Thermus thermophilus
er dannet af to domæner af 16 S rRNA fraktion bestående af helix 34 og sløjfen ved siden af ​​helix 31 [26, 27]. I H. pylori
isolater, den høje grad af TetR skyldes især tre basemutationer, fra AGA926-928 til TTC, i de 16 S rRNA-generne rRNA /B [28, 29]. Mutationer i en eller to af disse positioner resulterer i et lavt niveau af TetR [30, 31].
I Brasilien undersøgelser udført på patienter fra Bragança Paulista, Sao Paulo, viste, at tredobbelt AGA926-928 til TTC mutationer findes i alle TetR H. pylori
isolater [32]. Ved anvendelse af en molekylær metode baseret på en polymerasekædereaktion forbundet med restriktionsfragmentlængde-polymorfisme (PCR-RFLP) analyse, undersøgte vi den primære forekomst af H. pylori
TetR højt niveau direkte i gastriske biopsiprøver opnået fra dyspeptiske patienter indgivet til gastroskopi ved Hospital das Clinicas af Marilia, São Paulo, Brasilien, fra januar 2003 til juli 2006.
Resultater og diskussion
gastrisk sygdom resultat af 1102 patienter, der deltog i gastroenterologi ambulatoriet af Hospital das Clínicas af Marília blev undersøgt ved endoskopi og histopatologi. Endoskopisk fund af peptisk eller sår på tolvfingertarmen sygdom (pud) var til stede i 119 patienter. Forskellige grader af kronisk gastritis (CG) blev observeret ved histopatologi i 693 patienter og andre forandringer svarende meste til gastroøsofageal reflukssygdom (GERD) og normal gastrisk mucosa, blev fundet i 290 patienter. Nogle patienter præsenterede mere end én ændring, med den mest alvorlige patologi under overvejelse i analysen.
Påvisning af H. pylori
blev udført direkte fra biopsiprøver ved histologi, guldstandarden H. pylori
diagnostisk test ansat i vores kliniske rutine, der sammen med histopatologisk analyse bruges til at bestemme H. pylori
eradikationsbehandling. Af 119 PUD, 693 CG og 290 GERD prøver, 76, 359 og 2, henholdsvis, var positive for H. pylori
ved histologi.
Når opdaget i maveslimhinden, en klassisk H. pylori
udryddelse triple regime er foreskrevet i vores gastroenterologi sundhedsklinikker. Når første valg regime behandling svigter at udrydde H. pylori
, en anden linje regimen indeholdende tetracyclin er den mest angivet. H. pylori
antibiotikum TetR varierer regionalt, er meget lav i Europa og Nordamerika [2, 33, 34]. Men i Asien [15, 19, 35] og Latinamerika, herunder Brasilien [16, 32], en høj grad af H. pylori
TetR er fundet,. Således, for at forbedre valget af H. pylori
associeret sygdom terapi, hovedsagelig i tilfælde af første svigt udryddelse, undersøgte vi det regionale højt H. pylori
TetR anvendelse af en molekylær fremgangsmåde baseret på PCR og RFLP direkte fra den samme gastrisk biopsi anvendes til hurtig ureaseprøve. Kun biopsi prøver fra patienter med positive H. pylori
diagnose ved histologi var inkluderet. En 545 bp H. pylori
16SrDNA PCR-fragment blev opnået ud fra 89,5% (68/76) og 91.1% (327/359) af gastriske biopsier fra PUD og CG patienterne. Da begge tests blev udført på en enkelt og anderledes gastrisk biopsi og H. pylori
infektion præsenterer en fokal karakteristisk for infektion [36], for at forbedre følsomheden af ​​denne fremgangsmåde prøveudtagning multipel biopsi anbefales.
Sekventielt i rækkefølge at detektere de store beslægtede punktmutationer, AGA til TTC ved positionerne 926, 927 og 928 af H. pylori
16 S rDNA forbundet med en høj grad af TetR, og en unik genotype kendetegnet ved brasilianske TetR H. pylori
isolerer [32], den 545 bp 16 S rDNA PCR fragment blev begrænset med HinfI
. I denne H. pylori
16 S rDNA amplikon der et konserveret Hinfl
restriktionssted, som tilvejebringer en intern kontrol enzym fordøjelse, hvilket resulterer i en to DNA-fragment restriktionsmønster, når den tredobbelte AGA926-928TTC nucleotidsubstitution er fraværende. Af 395 PCR prøver, 393 præsenterede to DNA-fragment begrænsning mønster og to PCR-produkter opnået fra en pud (Hp16S563Mar) patient og en CG (Hp16S587bp) patient blev ikke fordøjet af HinfI
. Den høje tetracyclin resistent AGA926-928TTC genotype afhængig af H. pylori
16 S rDNA ikke var til stede i vores befolkning. Disse resultater kan være tegn på H. pylori
højt niveau TetR fravær eller som i vores region andre 16 S rDNA nukleotidsubstitutioner eller forskellige genetiske faktorer er involveret i tetracyklinresistens, som findes ved andre undersøgelser [21]. Mere forskning er, der skal udføres for at bekræfte eller udelukke disse hypoteser.
For at bekræfte specificiteten af ​​545 bp H. pylori
16 S rDNA PCR-produkter amplificeret fra gastriske biopsier, de 545 bp PCR-fragmenter opnået fra to H. pylori Salg positive PUD patienter anvendt som kontroller i PCR-reaktioner (Hp16S248Mar og Hp16S644Mar), og PCR-fragmenterne 545 bp med uforudset HinfI
restriktionsmønster navngivet Hp16S563Mar og Hp16S587bp, blev sekventeret og analyseret ved basisk BLASTN search [ ,,,0],37]. Alle fire sekvenser præsenterede 99% homologi til 16 S rDNA fra vest og syd Afrika, Syd- og Nordamerika Helicobacter pylori
isolater. De punktmutationer findes i hver analyseret PCR-sekvens sammenlignet med H. pylori
16 S rDNA referencesekvenserne frembyder højere homologi med de opnåede amplikoner er opsummeret i tabel 1. afskaffelsen af ​​Hinfl
restriktionssite af Hp16S563 og 587Mar resulterede fra et nukleotid substitution på position 958, som har oprindelse i et EcoRI
restriktionssted. Således blev nukleotidsubstitutioner i disse 16 S 545 bp PCR-fragmenter bekræftes ved EcoRI
restriktionsanalyse (data ikke vist). Den biologiske betydning af nukleotidsubstitutioner findes i vores 16 S-dyrkede H. pylori Salg PCR-fragmenter skal undersøges. Tabel 1 Sammenligning af Helicobacter pylori 545 bp 16 S rDNA nukleotid polymorfier blandt referencer og ukultiverede bakterien stammer
H. pyloristrain +
16 S rDNA nukleotidpositioner #

926-928

947

954-959

981

988

1092

1093

1097

SouthAfrica07
AGA
A
GAATCC
A
T
T
C
G
2017WestAfrica
AGA
A
GAATCC
A
T
T
C
G
EU544200USA
AGA
A
GAATCC
A
T
T
T
G
Puno /Peru
AGA
A
GAATCC
G
C
T
C
G
Hp16S248Mar
AGA
G
GAATCC
A
T
T
C
A
Hp16S644Mar
AGA
A
GAATCC
A
T
G
C
G
Hp16S563Mar
AGA
A
GAATTC
A
T
T
T
G
Hp16S587Mar
AGA
A
GAATTC
G
C
T
C
G
# baseret på H. pylori
henvisning stamme 26.995; + Numre af H. pylori
sekvens tiltrædelse stammer for SouthAfrica07, 2017WestAfrica, EU544200USA, Puno /Peru, Hp16S248Mar, Hp16S644mar, Hp16S563Mar og Hp16S567Mar er henholdsvis: [Genbank: CP002336.1, Genbank: CP002571.1, Genbank: EU544200.1, Genbank: CP002982.1, Genbank: JQ315410, Genbank: JQ315411, Genbank: JQ315412 og Genbank:. JQ315413]
konklusioner
høje TetR H. pylori
genotype afhængig AGA926-929TTC 16 S rDNA gen udskiftninger blev ikke fundet i vores befolkning. Der kræves mere forskning for at undersøge, om H. pylori
høj TetR er fraværende eller hvis den er forbundet med en anden bakteriel genetisk baggrund i vores region. Også den biologiske betydning af de uforudsete nucleotidsubstitutioner i Marilia ukultiverede H. pylori
16 S rDNA delsekvens kræver yderligere undersøgelse.
Metoder
Patienter
1102 voksne patienter med bopæl i Marilia byen, São Paulo stat, Brasilien, i alderen 19 til 91 år, der havde fortløbende undergået gastroskopi (EGD) til øvre mavesmerter eller mavesurhedssymptomer perioden fra januar 2003 til juli 2006 efter gastroenterologi ambulatoriet af Hospital das Clínicas af Marília Medical School, blev indrulleret i dette undersøgelse.
Endoskopi, biopsier
EGD blev gennemført ved fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) eller video-endoskop (GIF-100) begge fra Olympus. Mavesår eller duodenalsår diagnose blev defineret ved endoskopi og to fragmenter på antrum blev opsamlet for at udføre den hurtige urease og histopatologiske undersøgelser. Biopsi anvendes til hurtig ureasetest blev yderligere forelagt DNA-ekstraktion. Protokollen anvendes, er i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og blev godkendt af Etisk Komité i Human Forskning fra Marilia Medical School, under referencenummer 388/01.
Histologi Salg One antrale prøve blev fikseret i formol opløsning ved 10% og indlejret i paraffin. Sektioner blev Giemsa farvet for H. pylori
evaluering og blev farvet med hematoxilin og eosin til vurdering af histopatologiske ændringer [38].
DNA-ekstraktion og Polymerase kædereaktion
Polymerase kædereaktion og restriktionsanalyse blev oprettet med samme biopsi anvendes til hurtig ureaseprøve. Dette blev forelagt for DNA ekstraktion med ansættelse af GFX DNA-ekstraktion kit købt fra Amersham /Pharmacia Biotech, efter fabrikantens anvisninger. DNA blev kvantificeret i agarosegelelektroforese under anvendelse af Invitrogem lav masse stigen og 50-100ηg blev anvendt i PCR-reaktioner med primersæt Hp16Sr1 (sense),): 5 'AAC ATT ACT GAC GCT GAT TG 3'; Hp16S r2 (antisense): 5'-TGG CTC CAC TTC GCA GTA TT 3 ', som amplificerer en konserveret fragment på 545 bp svarende til H. pylori
16 S rRNA-genet mellem nukleotid positionerne 700 og 1245 (nummereret i overensstemmelse med den rRNA-genet af H. pylori
stamme 26.695), modificeret fra [32]. I alle PCR-reaktioner en negativ og en positiv kontrol blev anvendt svarende til henholdsvis sterilt vand og to forskellige urease H. pylori
positive gastriske biopsier fra PUD patienter. PCR betingelse var 94 ° C 5 'efterfulgt af 40 cykler ved 94 ° C 1' /55 ° C 1 '/72 ° C 1' og en cyklus ved 72 ° C 7 ', med et samlet volumen på 25 pi indeholdende 1 X PCR buffer, 200 uM dNTP'er, 2,0 mM MgCl 2, 1 pM oligoHp16Sr1, 1 pM oligo Hp16Sr2, 1,25 U Taq DNA Polymerase Platinum Brasilien (Invitrogen), 2,5% DMSO, 50ηg DNA. PCR-produkterne blev løst i 1,5% agarosegeler farvet med ethidiumbromid og fotograferet under UV-lys.
Begrænsning og sekvensanalyse Salg The 16 S rDNA 545 bp amplikoner opnået ved PCR fra biopsiprøver blev spaltet med Hinf
i (Biolab - New England) ifølge producentens instruktioner. Den forudsigelige restriktionsmønster for tetracyclin modtagelige H. pylori
stammer svarer til to fragmenter på 264 og 281 bp og for H. pylori
stammer med høj tetracyclinresistens svarer til tre fragmenter på 281, 227 og 37 bp. Produkterne af restriktionsanalyse blev løst i 8% acrylamidgeler, farvet med ethidiumbromid og fotograferet under UV-lys. 16 S rRNA 545 bp PCR amplikoner fra de to H. pylori
positiv kontrol gastrisk biopsier (Hp16S248Mar og 644Mar) samt de to amplikoner præsenterer uventede Hinf
I begrænsning mønstre (Hp16S563Mar og Hp16S587bp) blev forelagt sekventering med DyeTM Terminator v3.0 cycle Sequencing Ready Reaction kit og en maskine ABI-3100 indkøbt fra Applied Biosystem, ifølge producentens instruktioner. Nucleotidsekvens bestemmelse blev udført i to eksemplarer og sammenlignende analyse blev udført af grundlæggende nukleotid BLAST tilpasning [37]
Forfatter bidrag
RBS og CMA gennemførte de molekylære studier og bidraget til erhvervelsen og fortolkning af data.; MAS designet forsøgene, bidrog til dataanalyse og udarbejdet manuskriptet. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript
Notes
Rodrigo Buzinaro Suzuki, Cristiane Maria Almeida bidraget ligeligt til dette arbejde
Forkortelser
PUD:..
Mavesår sygdom

CG:
Kronisk gastritis
GERD:
gastroøsofageal reflukssygdom
PCR:
Polymerase kædereaktion
RFLP:
Begrænsning polymorfisme
TetR:
Tetracyklin modstand
.
erklæringer
Tak
Vi er taknemmelige for Dr. Adriana Augusta Pimenta de Barros for hendes omsorg til alle de patienter, der indgik i undersøgelsen, og til Dr. David Howe for hans bidrag i udgaven af manuskriptet sprog. Dette arbejde blev støttet af Fundação de Amparo en Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Forskning Grant 2006 /01.223-0; Fellowship CMA 2005 /04.087-7.
Konkurrerende interesser
Vi har ikke nogen til at erklære.

• Genomisk ændringer og molekylære undertyper af gastrisk kræft i asiater
• Interobserver og intraobserver aftale om maveslimhinden atrofi